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• Inhibitoren der Transkription:Rifampicin, Actinomycinα-Amanitin
• Inhibitoren der Translation:Puromycin, Streptomycin, Tetracycline, ChloramphenicolDiphterie-Toxin
Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression
Rifamycin & Rifampicin inhibieren prokaryotische, aber nicht
eukaryotische RNA-Polymerasen
Rifampicin ist ein halbsynthetisches Derivat von Rifamycin B,das von Streptomyces mediterranei produziert wird.
• aus Streptomyces antibioticus• inhibiert DNA- und RNA-Polymerasen• interkaliert zwischen Basenpaare der
dsDNA
Actinomycin D
α-Amanitin (Amatoxine)
• aus Amanita phalloides (Grüner Knollenblätterpilz)
• Inhibiert v.a. eukaryotische RNA-Polymerase II u. III, aber nicht I, und nicht prokaryot. RNA-Polymerasen
Puromycin(inhibiert die Translation)
Bindet ohne EF-Tu die A-Stelle im Ribosom und es wird ein Peptidylpuromycin gebildet.
Eine weiter Transpeptidierung kann nicht stattfinden.
Bindet an die grosse Untereinheit und inhibiert die Peptidyltransferase Aktivität von prokaryotischen Ribosomen
Chloramphenicol
Binden an die kleine Untereinheit prokaryotischer Ribosomen und verhindert die Bindung von Aminoacyl-tRNAs.
Tetracycline
Streptomycin und andere Amino-glycoside inhibieren die Initiation (bei hoher Konzentration) und verursachen bereits bei niedriger Konzentration Fehleinbau
Streptomycin
Diphterie-Toxin(inhibiert die Translation)
Diptherie-Toxin ist ein Protein ausCorynebacterium diphteriae,das in der infizierten Zelle inzwei Fragmente gespalten wird.
Ein Fragment ist ein Enzym, dasADP-Ribose auf ein modifiziertesHistidin im EF-2 überträgt und dadurch EF-2 inaktiviert.
Methoden zur Analyse und Manipulation von DNA
Techniken der Protein- und Nukleinsäure-Biochemie
Klonierungin einen
Expressions-Vektor
Bestimmungder DNA-Sequenz
Transformation vonE.coli oder andere
Zellen
Präparation vonsynthetischen
Peptiden
Herstellung von spezifischenAntikörpern
Gen odercDNA
Protein
Protein
Bestimmungder Amino-
säuresequenz
SynthetischeOligonukleotide
als Sonden
Analyse einer cDNA Bank mit
Southern blotting
Herstellung spezifischerAntikörper
Expression einer DNALibrary und Analyse
durch Western blottingGen oder
cDNA
Klonierung von DNA
1.) Rekombinante DNA Techniken beruhen auf der Fähigkeit große Mengen an identischen DNA Molekülen (Klone) herzustellen.
2) Durch Einbau von DNA Stücken in Vektoren, die in eine Wirtszelle eingeführt werden, können Klone erzeugt werden.
3) Durch die Replikation des Vektors wird auch das DNA-Stück von Interesse vervielfältigt.
4) Die am häufigsten verwendeten Vektoren sind E.coli Plasmid Vektoren und λ Bakteriophagen Vektoren.
Eine Gen für eine Antibiotika-Resistenzerlaubt einfache Selektionder transformierten Zellen Ampicillin-Resistenz
Klonierung von DNA mit Plasmid Vektoren
Restriktionsendonucleasen schneiden dsDNA an spezifischen Sequenzen
Schnittstelle
Methylierte Basen an der Schnittstelle schützen die DNA vor dem Restriktionsenzym
Restriktionsenzyme aus verschiedenen Bakterien
schneiden unterschiedliche DNA-Sequenzen.
Diese Sequenzen sind meistens Palindrome.
7.1 Selected restriction enzymes
Restriktionsenzyme schneiden DNA in definierte Stücke
Figure 7-7
Restriktionsfragmente mit komplementären ‘sticky ends’ können leicht verknüpft werden
Modifizierte Plasmid Vektoren enthalten Polylinker, die eine Klonierungen mit unterschiedlichen
Restriktionsenzymen ermöglichen.
Figure 7-24
Durch Mehrfach-Restriktionsanalyse können DNA Fragmente identifziert werden
Restriktionsfragmente können durch Gel-Elektrophorese getrennt werden (Agarose Gel)
Visualisierung der DNA-Fragmente erfolgt durch Ethidiumbromid oder
radioaktive Markierung
Ethidium-bromid
DNA-Sequenzierung mit der Dideoxy- Methode
(oder Sanger- oder Kettenabbruch-Methode)
Es werden 4 getrennte DNA-Polymerase Reaktionen durchgefuehrt (jeweils mit einem der 4 Dideoxy-NTPs)
Die Sanger Methode
Die Sanger Methode (II)
Fluoreszenzfarbstoff-markierte Nucleotide werden für moderne DNA-Sequenziergeräte verwendet
Chemische Synthese von DNA Molekülen: Festphasen-Synthese
Chemische DNA Synthese
Synthetische Peptide werden auch durch eine Festphasen-
Methode hergestellt(Bruce Merrifield)
Kopplung der C-terminalen Aminosäure an das Säulenmaterial
Abspaltung der Schutzgruppe am Aminoende
Kopplung mit der nächsten Aminosäure
Ablösen des fertigen Peptids
DNA wird durch ‘Southern blotting’spezifisch nachgewiesen
mRNAs werden durch ‘Northern blotting’spezifisch nachgewiesen
Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte DNA Sequenz (z.B. Gen) durch Vervielfältigung aus einer großen Ansammlung von vielen unterschiedlichen DNA Sequenzen isoliert werden.
Allerdings muss zumindest eine kurzes Stück der DNA Sequenz am Anfang und am Ende des gewünschten Gens bekannt sein.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR (polymerase chain reaction)
PCR (polymerase chain reaction)
PCR (polymerase chain reaction)
Herstellung rekombinanter Proteine
Überexpression eines Gensoder cDNA in
- E. coli- S. cerevisiae- Insektenzellen (Bacculovirus-System)
Industrielle Produktion rekombinanter Proteine
KleinwuchsWachstumshormonVirushüllproteineImpfstoffeAnämie (Erythozytenprodukt.)ErythropoietinDiagnostikMonoklonale AntikörperHIV, Krebs, ImmunschwächeInterleukineVirusinfektionen, KrebsIntereferoneFaktor VIII (Hämophilie)GerinnungsfaktorenDiabetesInsulinBeispeil /AnwendungProtein
in vitro Mutagenese
• DeletionenN- oder C-terminale VerkürzungEntfernen von Domänen
• SubstitutionenGerichtete Mutagenese
• InsertionenCassetten Mutagenese
• Designer Gene
Gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis)
mit Hilfe der PCR
Cassetten Mutagenese
Gezielter Genaustausch
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