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Crditos.
Editora.
Melany Espinosa
Colaboradores.
Marcela Muoz.
Fabin Carrin.
Contenido
ESTIMULACIN DE ALGUNAS
ENZIMAS RELACIONADAS CON
LA DEFENSA EN PLANTAS DE
ARROZ (Oryza sativa,
L.)OBTENIDAS DE SEMILLAS
TRATADAS CON QUITOSANA
CARACTERSTICAS
MORFOLGICAS Y BIOQUMICAS
DE FRUTOS DE CHINENE (Persea
schiedeana Nees.)
EMPLEO DE MARCADORES RAPD
PARA EL ANLISIS DE LA
VARIABILIDAD GENTICA EN
GENOTIPOS DE TOMATE
(Lycopersicon esculentum, Mill.)
Editorial
La Bioqumica es una ciencia que
estudia la composicin qumica de
los seres vivos, especialmente las
protenas, carbohidratos, lpidos y
cidos nucleicos, adems de otras
pequeas molculas presentes en
las clulas y las reacciones
qumicas que sufren estos
compuestos (metabolismo) que
les permiten obtener energa
(catabolismo) y generar
biomolculas propias
(anabolismo). La bioqumica se
basa en el concepto de que todo
ser vivo contiene carbono y en
general las molculas biolgicas
estn compuestas principalmente
de carbono, hidrgeno, oxgeno,
nitrgeno, fsforo y azufre.
RESUMEN.
La aplicacin de elicitores es
uno de los mtodos ms
ecolgicos y econmicos para
el control de plagas y
enfermedades. La quitosana
es un elicitor que tiene la
capacidad de estimular
mecanismos defensivos en
las plantas, las cuales van a
conferir resistencia a
enfermedades. En el trabajo
se presentan los primeros
resultados logrados en Cuba
en el empleo de elicitores
quitinosos en el cultivo del
arroz, en particular de la
quitosana obtenida en el
Departamento de Fisiologa y
Bioqumica Vegetal del
Instituto Nacional de
Ciencias Agrcolas (INCA).
Durante la investigacin se
determin in vivo el efecto de
este compuesto aplicado a la
semilla, en la estimulacin de
algunas enzimas defensivas
como la PAL, glucanasa, quitinasa y
quitosanasa en
plantas de arroz (varie- dad J-104). Se
observ el mayor incremento de la
actividad de estas enzimas en las
plantas tratadas con respecto al control.
ABSTRACT.
The application of elicitors is one of the
most ecological and economic methods
for pest and disease control. The
chitosan is an elicitor that stimulates
defensive mechanisms in plants, which
confer disease resistance. This work
presents the first results obtained in
Cuba by using chitinous elicitors in rice
Crop, particularly the chitosan obtained
in the Department of the crop
Physiology and Biochemistry from the
National Institute of Agricultural
Sciences (INCA). During the
investigation, the effect of this
compound applied to seed was in vivo
determined, to estimulate some
defensive enzymes, such as PAL,
glucanase, chitinase and chitosanase in
rice plants (cv. J-104). The highest
increment of enzymatic activity was
recorded in treated plants-1
ESTIMULACIN DE ALGUNAS ENZIMAS RELACIONADAS CON LA
DEFENSA EN PLANTAS DE ARROZ (Oryza sativa, L.)OBTENIDAS DE
SEMILLAS TRATADAS CON QUITOSANA
Key words: chitosan, seed, glucans, Oryza sativa, defense mechanisms
INTRODUCCIN
Los elicitores son molculas de origen
bitico, capaces de estimular
mecanismos defensivos en las plantas,
que pueden ser aplicados de forma
preventiva o directa a las plantas .
Estas sustancias desencadenan en las
plantas una serie de mecanismos
defensivos, que provocan una
resistencia sistmica ante el ataque de
los patgenos. Dentro de estos
mecanismos se incluyen el incremento
en la activacin de enzimas tales como
la fenilalanina amonio liasa (PAL), la
cual es clave en la sntesis de
metabolitos defensivos importantes,
donde se destacan las fitoalexinas.
Tambin se inducen otras enzimas
defensivas entre las que se encuentran:-
1,3 glucanasas, quitinasas,
quitosanasas, entre otras.
Entre los elicitores se encuentran los
oligmeros de glucano, cido
galacturnico y quitosana (3). En
cuanto a la quitosana se le ha prestado
especial inters en los ltimos aos por
su doble efecto: inhibir el crecimiento
micelial de algunos hongos
fitopatgenos y activar mecanismos
defensivos en las plantas, lo cual brinda
la posibilidad de utilizar estos
principios activos en el control de
enfermedades en cultivos de inters
econmico. Este elicitor y sus derivados
han demostrado que con la aplicacin
preventiva de estos a las plantas, se
logra adems de la estimulacin en
algunas de las enzimas defensivas, una
disminucin de los sntomas de la
enfermedad.
En este sentido, se ha demostrado que
la quitosana aplicada a plntulas de
tabaco y posteriormente infectadas con
Phytophthora parastica se logra una
induccin de la actividad de las
enzimas PAL y glucanasa, adems de
observarse proteccin . Tambin en
hojas de man se aplic quitosana, se
infect con Puccinia arachidis,
observndose una estimulacin en la
actividad quitinasa y glucanasa y una
disminucin de las lesiones.
En cuanto al cultivo del arroz (Oryza
sativa, L.) se puede plantear, que es el
alimento bsico de ms del 65 % de la
poblacin mundial. En Cuba constituye
el 60 % de la dieta de los cubanos y la
demanda interna slo se satisface
aproximadamente el 33 %. Una de las
causas de los bajos rendimientos de este
cultivo son los daos causados por
enfermedades y en especial, las de
origen fungoso, siendo en el estado de
plntulas, entre los 25 y 35 das despus
de germinada la semilla, donde la
planta muestra la mayor
susceptibilidad. Las prdidas oscilan
entre un 10-30 %, pero su capacidad
destructiva en condiciones favorables
llega a ser hasta un 80 % (6, 7).
Resulta importante destacar, que una
de las vas de transmisin de este
patgeno es por semillas contaminadas,
siendo el tratamiento a la semilla con
fungicidas qumicos uno de los
mtodos ms usado para el control de
la piriculariosis, pero los mismos son
muy costosos y txicos al ambiente.
Toda esta situacin conduce a la
necesidad de utilizar nuevos mtodos,
muchos ms econmicos y ecolgicos,
que se unan a los tradicionales para el
control integrado de las enfermedades
fungosas. Teniendo en cuenta estos
antecedentes el objetivo del trabajo es
determinar la dinmica de algunos
indicadores de resistencia sistmica
inducida: fenilalanina amonio liasa, -1,3
glucanasa, quitinasa y quitosanasa
estimulada por la quitosana en una
variedad de arroz (J-104)
MATERIALES Y MTODOS
Elicitor utilizado. La quitosana con
grado de acetilacin 36.5 % (Q-63),
obtenida en el Laboratorio de
Oligosacarinas del Departamento de
Fisiologa y Bioqumica Vegetal del
Instituto Nacional de Ciencias
Agrcolas (INCA), por desacetilacin
alcalina de quitina de langosta, calidad
farmacutica (8). Estimulacin de los
mecanismos de defensa por la
quitosana. Las semillas de arroz
variedad J-104 despus de
desinfectadas con hipoclorito de sodio
al 3 % durante tres minutos y lavadas
con agua destilada estril, fueron
tratadas con disoluciones de quitosana
a las concentraciones 100, 500 y 1000
mg.L-1 mediante imbibicin durante 15
minutos. Posteriormente, fueron
secadas a temperatura ambiente y ms
tarde sembradas en bandejas plsticas
con suelo Gley Nodular Ferraltico
concrecionario (9), esterilizado
previamente durante una hora en auto-
clave a 121oC, por tres das
consecutivos. Se incubaron las bandejas
en cuarto de crecimiento con
alternancia de luz (16 horas) y
oscuridad (8 horas) a una temperatura
de 22-24oC y a los 18, 25, 32 y 39 das de
germinadas las semillas se
determinaron las diferentes actividades
enzimticas: fenilalanina amonio liasa
(PAL), 1,3 glucanasa, quitinasa,
quitosanasa, que se compararon con un
control (tratado con agua). Extraccin
de enzimas. El material vegetal
utilizado para la extraccin fue hojas de
arroz de las cuales se tomaron 2 g y
maceraron en mortero con nitrgeno
lquido. Se procedi a la extraccin con
una solucin tampn de acetato de
sodio 0.1 mol.L-1 a pH 5,2 para la
determina cin de las actividade -
1,3 glucanasa, quitinasa y quitosanasa y
para determinar la actividad PAL se
utiliz como solucin tampn
tetraborato de sodio 0,1 mol.L-1 y cido
brico 0.1 mol.L-1 a pH 8.8.
Para ambas extracciones se us 1 g de
tejido por cada 2 mL de solucin
tampn. Determinacin de las
actividades enzimticas Determinacin
de la actividad PAL. Se tom 0.9 mL de
L-Fenilalanina 1 mg.mL-1 (Merck
calidad bioqumica) se le adicion 0,1
mL de extracto enzimtico, se incub a
40oC durante 30 minutos. La reaccin
se detuvo con 0.25 mL de cido
clorhdrico 5 N, se colocaron las
muestras en bao helado y se le
adicion 5 mL de agua destilada. Los
valores de absorbancia se determinaron
a 290 nm. Se defini como una unidad
de actividad enzimtica equi- valente a
la produccin de 1 mmol de cido
transcinmico producido por minuto
por mg de protenas (10).
- 1,3
glucanasa. A 0.2 mL de sustrato
laminarina 1 mg.mL-1 (Sigma para
anlisis) (11) se le adicion 0,1 mL de
tampn acetato de sodio 0.1 mol.L-1 a
pH 5,2 y 0,1 mL de extracto enzimtico,
las muestras se incubaron a 40oC
durante 30 minutos. Se determin la
actividad enzimtica por medicin del
nivel de produccin de azcares
reductores (12) y se expres en
trminos de actividad especfica como
mol de glucosa producido minutos-
1.mg-1 de protenas.
Determinacin de la actividad
quitinasa. Para este ensa- yo se
procedi adicionando 2 mL de tampn
de cido ctrico 0,1 mol. L-1 e hidrgeno
fosfato de sodio 0,1 mol.L-1 pH 5,2 a 1
mL de extracto enzimtico y a un 1 mL
de quitina coloidal 0.5 % (Sigma con
fines analticos). Se incubaron las
muestras a 37oC durante 20 minutos
con agitacin continua. La reaccin se
detuvo al calentarla a ebullicin por 5
minutos. Se determin el incremento de
azcares reductores (2) se ley la
absorbancia a 420 nm. La actividad
enzimtica se expres como moles de
azcares reductores por minuto por mg
de protenas.
Determinacin de la actividad
quitosanasa. A 0.5 mL de quitosana al
0.5 % en buffer de acetato de sodio 0,1
M a pH 5.2, se le aadi 0.5 mL de
muestra. La mezcla se incub a 37oC
durante 24 horas, posteriormente para
detener la reaccin se colocaron las
muestras en bao Mara a 100oC
durante cuatro minutos (2). Se ley la
absorbancia a 420 nm. La actividad
enzimtica se expres como moles de
azcares reductores por minuto por mg
de protenas.
En todos los casos se registraron las
actividades especficas de las enzimas
para ello se determin la concentracin
de protenas presente en los extractos
(13). Anlisis estadstico. Se utiliz un
diseo completamente aleatorizado y
con tres repeticiones por tratamientos.
Las medias se compararon con el
empleo de la prueba de Rangos
Mltiples de Duncan para un 5 % de
significacin, as como se determinaron
los errores estndar para cada
momento evaluativo. El experimento se
repiti dos veces con resultados
coincidentes.
RESULTADOS Y DISCUSIN
La enzima PAL es una de las primeras
que se activa en el metabolismo
secundario y a partir de ella se
desencadena rpidamente una serie de
mecanismos como la va de los
fenilpropanoides que da lugar a la
sntesis de fitoalexinas, ligninas, cido
benzoico, cido saliclico, siendo este
ltimo considerado una importante
seal en la amplificacin de las
respuestas defensivas sistmicas (14,
15). Los resultados de la actividad de la
enzima PAL en plntulas de arroz
provenientes de semillas tratadas con
quitosana se muestran en la Figura 1.
Como se puede observar, se apreciaron
mayores niveles de actividad PAL en
las plantas suplementadas con las
diferentes dosis de elicitores que en el
control, con diferencia significativa
entre los tratamientos aplicados. Este
comportamiento se mantuvo desde la
primera evaluacin realizada a los 18
das despus de germinada la semilla
de arroz y hasta los 39 das, tiempo en
que se realiza la ltima evaluacin.
Se debe destacar que los mayores
valores de actividad PAL se alcanzaron
aproximadamente entre 0,12 y 0.14
moles de cido transcinmico
producido.mg-1 de protenas.minuto-1
con la dosis de 1000 mg.L-1 para todas
las evaluaciones, mientras que a las
concentraciones de 100 y 500 mg.L-1
fueron significativamente inferiores,
aunque mejores que el tratamiento
control. Los resultados sugieren que la
tendencia al mayor incremento de la
actividad PAL ocurre entre los 25 y 32
das, despus de germinada la semilla.
El hecho de que a la mayor
concentracin de quitosana se encontr
la mayor actividad PAL pudiera
explicarse teniendo en cuenta que a
1000 mg.L-1 la solucin es ms viscosa,
por lo que debe adherirse mejor a la
semilla y su liberacin debe ser ms
lenta que el resto de las concentraciones
cuya viscosidad es menor. Esto trae
como consecuencia que las sustancias
activas se mantengan ms tiempo en
contacto con las semillas y plntulas de
arroz (16). En cuanto a los resultados de
la actividad de la enzima-1,3 glucanasa
se muestran en la Figura 2
La dosis 1000 mg.L-1 y en menor
medida la de 500 mg.L-1 de quitosana
fueron las que provocaron la mayor
estimulacin enzimtica, con
diferencias significativas con el resto de
los tratamientos. Se debe destacar que a
los 25 das despus de germinada la
semilla se alcanz la mayor
estimulacin de la actividad1,3
glucanasa para la concentracin 1000
mg.L-1.
Algunos autores (1), en trabajos
relacionados con la actividad de esta
enzima ante la aplicacin de quitosana,
han observado un incremento de la
actividad de la misma en el tiempo. Por
ejemplo, en hojas de man encontraron
un incremento de la actividad
enzimtica a partir del segundo da
despus de la aplicacin del elicitor y el
mximo de induccin se mostr a los 10
das despus del tratamiento. Sin
embargo, en otras investigaciones
realizadas (4) se observ que a las 24
horas despus del tratamiento a
plntulas de tabaco a travs de la raz,
provoc un aumento de la actividad-1,3
glucanasa cuatro veces mayor respecto
al control.
En la Figura 3 se pueden apreciar los
resultados de actividad quitinasa, otra
de las enzimas analizadas, en las
plntulas de arroz obtenidas de
semillas tratadas con quitosana. Como
se puede observar las plantas tratadas
con las diferentes dosis del elicitor
mostraron una mayor ac- tividad
quitinasa que las correspondientes a las
plantas controles en la mayora de las
evaluaciones realizadas. Cuando se
aplica la quitosana, se evidencia que la
mayor estimulacin de la actividad de
la enzima se produce con la dosis de
1000 mg.L-1 para todas las evaluaciones
y 500 mg.L-1 en la ltima evaluacin,
con diferencias significativas con el
resto de los tratamientos. Se debe
sealar que los mayores valores de
actividad enzimtica se encontraron a
los 39 das despus de germinada la
semilla de arroz para todos los
tratamientos.
CONCLUSIN
De forma general, se puede plantear
que las plantas obtenidas de semillas de
arroz tratadas con quitosana a la dosis
de 1000 mg.L-1 lograron la mayor
estimulacin en todas las actividades
enzimticas evaluadas (PAL,- 1,3
glucanasa, quitinasa y quitosanasa)
desde los 18 hasta los 39 das despus
de germinada la semilla. Por lo que se
demostr la capacidad que presenta la
quitosana de estimular la actividad de
algunas enzimas relacionadas con la
defensa y que esta estimulacin se
diferencia en cuanto a la magnitud,
rapidez en alcanzar los valores mayores
de actividad y la dosis utilizada. Lo
cual sugiere, la posibilidad de que este
elicitor pueda ser empleado en la
proteccin de plntulas de arroz contra
algunos patgenos fngicos.
REFERENCIAS
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R. Chitosan induces resistance
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arachidis Speg. Crop Protection, 1998,
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Paz-Lago, D.; Gutirrez, A. y Luzardo,
L. Relevancia biolgica de la
activacin de la resistencia sistmica del
tabaco inducida por la pared celular
fngica. Cultivos Tropicales, 1998, vol.
19, no. 3, p. 25-27
RESUMEN.
El chinene es un rbol frutal
nativo de Mesoamrica y forma
parte de la familia Lauraceae. Su
consumo, como buena fuente
nutricional es reconocido en
regiones tropicales de Mxico y
Centroamrica. Sin embargo,
poco se conoce sobre su
contenido nutrimental. Para ello,
se llevaron a cabo anlisis de
cidos grasos en pulpa de
chinene por dos aos
consecutivos utilizando
cromatografa de gases. Se
obtuvieron concentraciones de
cido oleico, y palmitico
parecidas a las encontradas en
aguacate. Las concentraciones de
cido oleico fueron comparables
con las del aguacate Hass. En
otro estudio, se midieron
morfolgicamente frutos de
chinene provenientes de varias
comunidades de la regin central
de Veracruz, Mxico. Result una
gran variacin en tamao, peso,
y contenido de pulpa. Asimismo,
el patrn de crecimiento de los
frutos fue caracterizado por una curva
simple sigmoide con un acumulado de
1635.11 unidades calor arriba de 6 oC,
desde el amarre de fruto hasta la
cosecha.
PALABRAS CLAVE ADICIONALES:
Chinin, cido oleico, frutales
subutilizados, curvas de crecimiento
del fruto, unidades calor, ndice de
cosecha.
ABSTRACT.
Chinene is a fruit native from
Mesoamerica and belongs to the
Lauraceae family. Chinene pulp
consumption is recognized as a good
nutritional source in tropical regions of
Mexico and Central America. However,
little is known about its nutrient
content. Lipid analyses of chinene fruit
pulp were carried out during two
consecutive years using gas
chromatography. Oleic and palmitic
acid concentrations were comparable to
those found in Hass avocado cultivar.
In other study, the chinene morphology
from several locations of the central
region of Veracruz, Mexico, was
measured. Large variation in size,
weight and pulp content was found.
CARACTERSTICAS MORFOLGICAS Y BIOQUMICAS DE
FRUTOS DE CHINENE (Persea schiedeana Nees.)
The pattern of fruit growth follow a
simple sigmoid curve with 1635.11
accumulated heat hours above 6 oC
from set to harvest.
ADDITIONAL KEY WORDS: Chinin,
oleic acid, neglected fruits, fruit growth
curves, heat units, harvest index
INTRODUCCIN
El chinene (Persea schiedeana Nees.) de
la familia Lauraceae es un rbol frutal
nativo de Mesoamrica que se
distribuye desde Mxico hasta Panam
(Smith et al., 1992). Es poco conocido en
las zonas urbanas, y su nmero se ha
reducido debido al establecimiento de
plantaciones de caf y de otros cultivos
en el estado de Veracruz.
En Mxico, tambin se le conoce como
chinin, aguacate de manteca, escalar o
paga, y en Guatemala es chucte o
coyo. Asimismo, es nombrado como
supte y yas en Honduras y Costa Rica,
respectivamente. Este rbol que se
encuentra en algunas fincas cafetaleras,
se aprovecha principalmente por la
sombra que proporciona. A la fecha, no
existen plantaciones comerciales de
chinene (Herrera et al., 2005). Su fruto
en Mxico se consume untando la
pulpa del fruto en tortillas de maz. Se
han observado frutos de chinene que
presentan pulpa con buenas
caractersticas organolpticas
adecuadas para su comercializacin en
mercados de mayor exigencia, y
competencia comercial. En algunas
pocas del ao el precio del chinene ha
rebasado al del aguacate Hass en
mercados regionales de Veracruz y
Tabasco.
El rbol del chinene tolera
inundaciones (Smith et al., 1992) por lo
tanto ha sido estudiado para controlar
enfermedades de la raz del aguacatero
(Zentmyer et al., 1988), sin embargo, los
estudios relacionados con las
caractersticas de los frutos de chinene
son escasos. De manera que no se ha
caracterizado el crecimiento del fruto y
tampoco se ha cuantificado su
contenido nutrimental. Estudios de este
tipo permitiran determinar indicadores
de madurez para eficientar la cosecha y
promover el consumo de esta fruta por
sus cualidades culinarias.
Los objetivos del presente estudio
fueron: 1) evaluar parmetros
morfolgicos en frutos de chinene
comercializados en el mercado regional
de Coscomatepec, Veracruz, 2)
determinar la curva de crecimiento del
fruto y obtener las unidades calor como
dos posibles parmetros de estimacin
de cosecha, 3) determinar el contenido
de cidos grasos y fibra de la pulpa de
los frutos.
MATERIALES Y MTODOS
Variabilidad de calidad del fruto
Frutos de chinene con madurez de
consumo en el mercado de
Coscomatepec, Veracruz, provenientes
de los municipios de Calcahualco,
Comapa, Crdoba, Excola, Fortn de las
Flores, Ixhuatln del Caf, Tepatlaxco y
Tomatln fueron seleccionados en
agosto del 2004. A cada uno se les
determin: peso fresco (g), dimetro
(mm) proximal, medio y distal,
longitud (cm), peso de la semilla (g),
peso de la pulpa (g), peso de la cscara
(g), y dimetro y longitud de la semilla
(cm). Con estos datos, se efectu un
anlisis cannico discriminante (Cruz-
Castillo et al., 1997) utilizando el
programa de computo SAS-8e.
Dinmica de crecimiento del fruto e
ndice de madurez
A una semana del amarre, un total de
300 frutos promediando 10 mm de
longitud fueron seleccionados al azar
en la parte media de cinco rboles que
medan 14 m de altura con una edad
aproximada de 20 aos. Semanalmente
se registr la longitud y dimetro (mm)
del fruto utilizando un vernier digital,
desde el 15 de abril de 2005 hasta la
cosecha. Debido a la cada de frutos
ocasionada por el viento en las ltimas
cuatro mediciones slo se midieron 50
frutos en tres rboles. Para calcular la
velocidad de crecimiento se utiliz la
frmula de Schechter et al. (1993): VCF
= ( TF2 TF1 ) / ( T2 T1 ) Donde: VCF
= Velocidad de crecimiento de la
longitud y/o dimetro del fruto
(mm.da-1); TF2 = Tamao de fruto en
un tiempo 2 (dimetro o longitud en
mm); TF1 = Tamao de fruto en el
tiempo 1 (mm); T2 = Tiempo del ltimo
registro (lectura 2) en das; y T1 =
Tiempo del registro anterior al ltimo
(lectura 1).
Determinacin de unidades calor
Las unidades calor (uc) con relacin al
ritmo de crecimiento del fruto tambin
fueron determinadas para obtener un
estimado de madurez y momento de
corte. stas fueron consideradas como
la cantidad de temperatura acumulada
medida en grados centgrados que
necesita el fruto para completar su
cosecha. Las temperaturas fueron
obtenidas cada 30 min diariamente con
un sensor Dataloger que fue colgado
dentro de un rbol a unos 8 m de
altura. El total de los datos fue
promediado por da y la suma de todas
las temperaturas promedio superiores a
6 C fue expresada como la cantidad de
uc requeridas para el crecimiento de
frutos medidos, de acuerdo con el
mtodo residual de Ortiz (1987). Frutos
tropicales almacenados abajo de 6 oC
presentan daos por fro (Kasmire y
Thompson, 1992), por esta razn se
escogi esa temperatura para obtener
las uc. Los valores promedio de lecturas
tomadas semanalmente para las
variables de longitud y dimetro de
fruto fueron graficados en funcin del
tiempo, calculando la media y el error
estndar con ayuda del programa
estadstico de cmputo Sigma Plot 10.0
(Systat software Inc., 2002).
Anlisis nutrimental
Fueron seleccionados seis frutos de
chinene con cscara verde y seis con
cscara negra colectados en Huatusco,
Veracruz, y otros seis con cscara verde
colectado en Teapa, Tabasco a los
cuales se les extrajo la pulpa para
determinar el contenido de cidos
grasos y fibra.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Variabilidad de calidad del fruto
En el Cuadro 1 se muestran los
promedios de todas las variables
medidas sobre los frutos. Se observaron
frutos con longitudes de 11 hasta 16.2
cm. Los dimetros distales del fruto
fueron desde 51.6 hasta 60.8 mm, y el
peso de los frutos vari de 160.1 hasta
254.7 g. Los frutos del mercado regional
de Coscomatepec provenientes de
municipios ubicados en la regin
central del estado de Veracruz fueron
diversos.
Las primeras cuatro funciones
cannicas fueron significativas (P0.05)
y cubrieron el 88 % de la variabilidad
de los datos. stas fueron interpretadas
considerando los valores absolutos
mayores para cada variable medida y
municipio dentro de la funcin (Cruz-
Castillo et al., 1997).
La primera funcin cannica
comprendi 34 % de la variabilidad y
resaltaron frutos de mayor longitud de
semilla (Cuadro 2). Frutos de color caf
y negro de comunidades en Tepatlaxco
y Tomatln, respectivamente, fueron
los mejores descritos por esta funcin
(Cuadro 3). En contraste, los frutos
verdes de Comapa presentaron semillas
con menor longitud (Cuadro 3). Esto
indica que los frutos estudiados no
llegaron al mercado con parmetros de
valor comercial. Cuando se caracteriza
la calidad del fruto y existe una previa
seleccin de rboles por tamao y/o
peso del fruto, las primeras funciones
resaltan estas variables (Cruz-Castillo et
al., 1997; Alavz-Lpez et al., 2000). Los
frutos de chinene estudiados fueron
cosechados de rboles propagados por
semilla creciendo en forma silvestre o
en traspatios y una variable de poca
importancia comercial como la longitud
de la semilla ocup gran parte de la
variabilidad de los datos.
En la segunda funcin cannica se
presentaron principalmente frutos de
menor peso con un dimetro distal
sobresaliente (Cuadro 2), y los frutos de
Tepatlaxco alcanzaron los mayores
valores medios estandarizados (Cuadro
3). En la tercera funcin, destacaron
frutos de mayor peso asociados a un
alto peso de su cscara (Cuadro 2) y los
frutos negros de Calcahualco se
distinguieron en este aspecto (Cuadros
1 y 3). Frutos pequeos con poca
longitud y peso destacaron en la
funcin cuatro que cubri solamente el
10 % de la variabilidad (Cuadro 2), y los
verdes de Comapa alcanzaron el mayor
valor medio absoluto (Cuadro 3) con un
peso de 163.3 g y una longitud de 12.7
cm (Cuadro 1). Estos resultados son
tiles para futuros estudios donde se
considere seleccionar rboles de
chinene para mejoramiento gentico, ya
que a la fecha no existen cultivares de
chinene registrados.
Dinmica del crecimiento e ndices de
madurez del fruto
El crecimiento del fruto de chinene fue
de tipo simple sigmoidal (Figura 1).
Curvas de crecimiento de este tipo
tambin han sido determinadas en el
aguacate (Schroeder, 1953; Blumenfeld
y Gazit, 1974; Coger, 1985). Esta curva
se caracteriz por un crecimiento
acumulado que present una actividad
inicial alta y cambios significativos
constantes entre lecturas, marcando un
aumento rpido y progresivo en la
longitud y dimetro hasta los 91 das
despus del amarre de fruto (DDAF).
Este crecimiento acelerado disminuy
alrededor del da 84 DDAF y 91 DDAF,
para las variables longitud y dimetro
respectivamente (Figura 1).
En la Figura 2 se muestra la velocidad o
tasa de crecimiento diario de frutos de
chinene. La tasa de crecimiento
aument rpidamente durante los
primeros das de desarrollo (0-21
DDAF), seguido por una leve
disminucin (28 DDAF), para despus
continuar acelerando hasta alcanzar
cierta estabilizacin en la velocidad de
crecimiento en los das subsecuentes
(42-97 DDAF). Este comportamiento
puede atribuirse a que el aumento de la
velocidad de crecimiento es ocasionado
por la divisin y elongacin celular en
los periodos iniciales de fruto
(Schroeder, 1953; Schechter et al., 1993).
Mientras que la ligera disminucin
sealada arriba puede ser efecto de
competencia de carbohidratos con otros
frutos (Khne y Schutte, 1991) o por
influencia del medio ambiente (Ryugo,
1993). Esta curva es til cuando se
pretende maximizar el entendimiento
de los procesos de divisin y
elongacin celular con relacin a las
fases de crecimiento y a la
susceptibilidad de stas con el medio
ambiente. La tasa de crecimiento del
fruto de chinene coincidi con la del
aguacate Pinkerton (Sippel et al.,
1993).
CONCLUSIN
La morfologa de frutos de chinene en
varias regiones de Veracruz es diversa
en cuanto a longitudes de la semilla,
peso y dimetro distal. El patrn de
crecimiento de los frutos de chinene
corresponde al tipo simple sigmoidal.
El punto de madurez fisiolgica de los
frutos de chinene es entre 91 y 97
DDAF. Por otra parte, durante la fase
comprendida entre el amarre de fruto y
el momento de madurez (97 DDAF) el
fruto requiri un acumulado de 1635.11
unidades calor. En dos aos
consecutivos los anlisis de cidos
grasos del chinene revelaron
concentraciones de cidos oleico y
palmtico comparables a las del
aguacate.
AGRADECIMIENTO
Al Sistema Nacional de Recursos
Fitogenticos de la SAGARPA, Mxico,
por el financiamiento del presente
estudio (proyecto 60 Red Aguacate).
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RESUMEN.
En el Centro Nacional de Sanidad
Agropecuaria (CENSA), se
sembraron en condiciones
semicontroladas seis posibles
radiomutantes de tomate con sus
respectivos donantes, con el objetivo
de evaluar la variabilidad gentica
de estos mediante el empleo de
marcadores RAPD. Los 14
cebadores utilizados generaron 80
bandas polimrficas, determinando
un total de 90 bandas. Estos
resultados sugieren la existencia de
una gran diversidad gentica dentro
del material analizado,
diferencindose molecularmente
cuatro genotipos de sus respectivas
variedades donantes.
Palabras clave: Lycopersicon
esculentum, variacin gentica,
marcadores genticos, RAPD
ABSTRACT.
In the National Center of Agricultural
Health (CENSA), seeds from six
possible tomato radiomutants with
their respective donating varieties were
sown in glasshouses, with the objective
of evaluating their genetic variability
by means of RAPD markers. The 14
primers used generated 80
polymorphic bands, determining a total
of 90 bands. These results suggest the
existence of a great genetic diversity
inside the analyzed material,
molecularly differing four genotypes
from their respective donating varieties.
Key words: Lycopersicon esculentum,
genetic variation, genetic markers,
RAPD
INTRODUCCIN
Ha sido demostrada la importancia
de los marcadores morfolgicos y
bioqumicos (1, 2) en la evaluacin
de las diferencias entre genotipos de
tomate, para la discriminacin de
variedades de esta hortaliza, a travs de
programas de mejoramiento gentico,
para su adaptacin a las condiciones
climticas. Sin embargo, los marcadores
morfolgicos y bioqumicos no son
capaces de detectar suficiente
polimorfismo entre variedades o
especies prximas, debido a que son
EMPLEO DE MARCADORES RAPD PARA EL ANLISIS DE LA VARIABILIDAD GENTICA EN GENOTIPOS DE
TOMATE (Lycopersicon esculentum, Mill.)
resultados de la expresin genotpica,
del ambiente y de la interaccin entre el
genotipo y el ambiente (3), por lo que es
imprescindible caracterizar con la
mayor acuciosidad posible la
diversidad gentica que presenta cada
coleccin. Los avances de la tecnologa
del ADN recombinante han permitido
el desarrollo de los marcadores basados
en el ADN, consiguiendo estabilidad en
la identificacin de especies y
variedades (4). En este sentido, un
mtodo muy efectivo es la aplicacin de
marcadores moleculares como RAPD,
RFLP, AFLP, etc., que suministran un
buen diagnstico sobre la estructura de
las poblaciones silvestres o sobre la
diversidad de las colecciones
establecidas (5). En el presente trabajo
se emplearon los marcadores RAPD
con el objetivo de corroborar si los
genotipos seleccionados, por su alto
potencial productivo en condiciones de
bajos suministros de agua, se
diferencian molecularmente de sus
respectivas donantes
MATERIALES Y MTODOS
Las semillas de los genotipos de tomate
seleccionados en condiciones de bajos
suministros de agua en el Instituto
Nacional de Ciencias Agrcolas (INCA),
se colocaron conjuntamente con sus
respectivas variedades donantes (Tabla
I) en cajuelas con suelo Ferraltico Rojo
esterilizado, mantenidas en casa de
cristal en condiciones semicontroladas a
temperatura de 230C +/- 20C y a una
humedad relativa entre 80-85 %, con un
fotoperodo natural en el Centro
Nacional de Sanidad Agropecuaria
(CENSA)..
A los 30 das de germinadas las
semillas, se tomaron las hojas jvenes y
se realiz una extraccin de ADN (6) a
todo el material vegetal mencionado
anteriormente. La calidad del ADN se
constat por electroforesis de los
extractos en geles de agarosa al 0.8 % y
solucin amortiguadora de corrida TBE
0.5X (45mM Tris-Borato, 1mM EDTA
pH 7), teidos con bromuro de etidio (5
mg.mL-1) y observados en un
transiluminador (Bioblock Scientific).
La concentracin se estim por la
medicin de la densi- dad ptica a 260
nm en un espectrofotmetro Ultrasepec
Plus Spectrophotometer Pharmacia
LKB.
La reaccin de amplificacin se realiz
en un volu- men total de 25 uL que
contena: 10 mM Tris-HCl a pH 8,3;
50mM KCl, 2mM MgCl2, 0.001 % de
gelatina, 100uM de cada dNTPs , 5
pmoles de cebador (Kits OPA y OPF de
la firma comercial Operon
Technologies), 100ng de ADN
genmico y 2U de Taq ADN polimerasa
(Amplicen). La amplificacin se
produjo en un termociclador marca
Techme de la firma Progene progra-
mado para 45 ciclos de 1 min. a 94C, 1
min. a 36C y 2 min. a 72C, y un ciclo
de 10 min. a 72C. Los productos de la
PCR se visualizaron por electroforesis
en gel de agarosa al 1.5 % en solucin
amortiguadora TBE 0.5X y se tieron
con bromuro de etidio, antes de ser
observados en un transiluminador. Se
informaron los productos de la PCR,
tomando las bandas ms intensas, como
presentes [1] o como ausentes [0] en
cada genotipo, creando as una matriz
de valores binarios que se analiz a
travs de la aplicacin del software
computacional CLATAX (7), para
determinar el grado de similitud
utilizando el coeficiente de similitud de
Nei y Li (8), entre el material gentico
analizado, para luego construir un
dendrograma mediante el algoritmo
UPGMA por medio del paquete
STATISTICA (9).
RESULTADOS Y DISCUSIN
A partir del anlisis molecular basado
en los 14 cebadores empleados, se puso
de manifiesto que estos generaron 90
bandas producto de la amplificacin
(Tabla II), de las cuales 80 fueron
polimrficas para un promedio de 5.7
bandas por cebador. Es de destacar que
casi la totalidad de los cebadores
usados fueron muy informativos, con
excepcin del OPA 13, que no detect
polimorfismo entre el material gentico
estudiado.
El cebador OPA 12 y todos los
cebadores OPF, excepto OPF 01,
alcanzaron el 100 % de bandas
polimrficas, resultando tiles en la
determinacin de polimorfismo. Se
destac el cebador OPF 13 por el gran
nmero de bandas generadas, de las
cuales el 100 % fueron polimrficas. De
acuerdo con la literatura consultada, los
porcentajes de polimorfismo gentico
alcanzados en este trabajo son altos, en
comparacin con los que se han
obtenido normalmente en tomate
(Lycopersicon esculentum Mill),
mediante los marcadores
morfoagronmicos y bioqumicos (2,
10), marcadores de RAPD (3, 11) y por
medio de otros marcadores moleculares
(12, 13, 14)..
Con el procedimiento no-jerrquico (K-
means) del Anlisis de Conglomerados,
basado en los ndices de similitud, se
identificaron al menos dos grupos de
diferente diversidad gentica (Figura
1): el primer grupo formado por el
genotipo R17-500 y su variedad
donante Amalia y el segundo por el
resto de los genotipos analizados. Este
ltimo grupo se dividi a su vez en tres
subgrupos, donde el genotipo R19-500
y su variedad donante INCA-9-1
integraron el primer subgrupo, los
genotipos R15-500 y R20-300 formaron
el segundo subgrupo y el tercero estuvo
compuesto por R16-300 y R4-300.
Las similitudes encontradas entre R17-
500 y R19-500, y sus respectivas
variedades donantes Amalia e INCA-9-
1, pudieran deberse a que los cebadores
empleados en este estudio conllevan a
no esclarecer la situacin, al no am-
plificar otras regiones que acentan
ms las diferencias, ya que los
marcadores RAPD son dominantes
porque solo se amplifica un producto o
variante allica: aquel que cumple los
requisitos de complementariedad entre
el cebador y las cadenas de ADN a una
distancia=2 kb (15).
CONCLUSIN
Los resultados alcanzados en este
trabajo permiten reafirmar el poder de
la tcnica de RAPD, para el estudio de
la diversidad en la secuencia de una
poblacin y corroboran la efectividad
del uso de rayos gamma 60Co, para la
induccin de variabilidad gentica y la
seleccin realizada para la obtencin de
genotipos de tomate con alto potencial
productivo en condiciones de bajos
suministros de agua.
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Universidad Tcnica de Ambato
Facultad de Ciencia e ingeniera en
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