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BIOTECNOLOGIA DE LOSMICROORGANISMOS
Aplicaciones de las enzimas ligninolíticas
Dra. Isabel E. Cinto
isa.cinto@gmail.com
El interés en los hongos causantes de pudrición blanca se incrementó ellos últimos 20-30 años asociados a sus numerosas aplicacionesbiotecnológicas
La mayoría de las aplicaciones ligadas a aplicaciones biotecnológicas de hongos de pudrición blanca:
Especies del Hemisferio NorteEspecies del Hemisferio Norte
Gran diversidad de hongos ligninolíticos descriptos en el Hemisferio Sur
Escasos estudios acerca de los sistemas enzimáticos implicados
Utilización de hongos para biorremediación requiere clarificar:Mecanismos enzimáticos empleados para detoxificar contaminantesFactores ambientales que incrementen la capacidad de biodegradación
Aplicaciones ligninasas
Degradación de xenobióticosDegradación efluentes industrialesBiorremediaciónDegradación de colorantes industrialesDecoloración de Demin
Industria de papelBiopulpado de la madera (X,L)Bioblanqueado de la pulpa de madera (X,L)
Investigación y desarrolloBiosensores
Aromáticos clorados
PentaclorofenolInsecticida, herbicida, preservante madera
Dioxinastetraclorodibenzodioxina
triclorofenol
2,4,5-triclorofenoxiacéticoherbicida
Pesticidas
DDTDicloro difeniltricloroacético
Persistente, liposolubleCorto plazo: sistema nervios e hígadoLargo plazo: carcinógeno
LindanoHexaclorohexano
Bifenilos policlorados-PCBs
Usos:Fluidos electricos en transformadores y capacitoresDiluyentes de pesticidad, adhesivos y aceitesRetardantes de llamaLubricantes hidráulicos
Dos estrategias para degradación de xenobióticos:
1)Biotransformación del compuesto por cultivos enteros2) Uso de enzimas (utilizadas mas frecuentemente lacasa y MnP)
Costos compatibles a escala industrial:
1)Producción de los hongos o sus enzimas a sustratos baratos (Ej: residuos agroindustriales)2)Utilización de enzimas no purificadas (pueden estar presente otros factores que favorecen la estabilidad de las enzimas o que actúan como mediadores, mejorando su rendimiento)
Hongos de pudrición blanca, cepas Argentinas
Coriolus versicolor Trametes elegansTrametes trogiiCoriolus versicolor
Fomes spp Trametes villosa Pycnoporus sanguineus
Trametes elegansTrametes trogii
Trametes trogii
Produce Lacasa y MnP
La lacasa es la enzima mayoritaria:
Medio líquido con 1 mM Cu++ , 20 días : 100 U/ml Óptimo de actividad: pH 3.5, 50 ºC
Estabilidad: a pH 4.5, 30 ºC, más de 5 días, 100%
2 isoenzimas, PM 38 y 60 KD
Degrada: colorantes, PAHs, PCBs.
Altas concentraciones de nitrógeno estimulas su crecimiento yproducción de ligninasas excelente candidato paraproducción de ligninasas a gran escala
Degradación de PCBs (200 ppm de aroclor 1150)
Degradación de PAHs(160 ppm de efluente de industria petroquímica con 10% de PAHs)
Trametes trogii
Cromatogramas (gas-líquido) de: (A) Controles, cultivo inactivado por calor; (B) Cultivo, 7 d
Degradación de antraceno Degradación de nitrobenceno
Trametes trogii
Control abiótico Control abiótico
Cultivo, 250 ppm antraceno
GC/masa de los compuestos extraídos.Agregados: al 4º d de crecimiento y extraídos al d.12
Control abiótico Control abiótico
Cultivo, 500 ppm nitrobenceno
Inmovilización de enzimas- Permite el reuso o un uso continuado
Adhesión – uniones iónicas
Material soporte: inorgánicoorgánico naturalsintético
Adhesión – uniones iónicasdiferencia de cargasuniones covalentes
Atrapado – en una matriz porosapolímeros fibrososmicrocápsulas semipermeables
Tener en cuenta:actividadactividadestabilidad
Aplicación:tanquescolumnas
Stereum hirsutumStereum hirsutumen esponja vegetalen esponja vegetal
1,4dimetoxifenol; guayacol; ácido gálico
y 2,4 diclorofenol
Raphanus sativus(rabanito)
Agua destilada
Fenol 10mM
90
10090
100
Los porcentajes de germinación :
96% en agua destilada,
0% en fenol 10mM
91 % en el fenol tratado con S. hirsutum
Productos de degradación
Fig 2: Remoción de fenol 10mM en S. hirsutum inmovilizado en esponja vegetal y en crecimiento libre a lo largo de dos ciclos de 13 días (10 mM = 1000 ppm)
010
2030
4050
6070
8090
13 15 18 20 23 26
Micelio Libre
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 5 7 10 13Días
Rem
oció
n de
Fen
ol (%
)
Micelio Inmovil izado
Segundo ciclo: reagregado de fenol 10mM
Aplicaciones a la Industria Papelera
Madera
Chips
Pulpa de papel
Biopulpado(xilinasas, ligninasas)
Pulpado mecánico+NaHO + Na2S
Efluentes tóxicos (licor negro)Pulpa de papel(marrón)
Pulpa de papel(blanca)
Refinado, laminado
Papel
Bioblanqueado(xilinasas, ligninasas)
Blanqueado(productos clorados y peróxido)
Efluentes tóxicos
Biorremediaciónligninasas
Empleo de hongos ligninolíticos y sus enzimas en el proceso de fabricación de papel
Bipulpado (previo al pulpado mecánico-químico:<energía, < tiempos decocción, químicos entran más facilmente porque la madera adquiere unaestructura más abierta, mas porosa)
El organismo elegido debe ser capaz de atacar selectivamente a la ligninadejando casi intactos a los carbohidratos, en un período de tiemporazonable (acorde con los niveles de producción de las plantas) y ser kisuficientemente robusto para desarrollarse en condiciones que varíanconsiderablemente dentro del sistema de biopulpado.
Empleo de hongos ligninolíticos y sus enzimas en el proceso de fabricación de papel
Bioblanqueado El uso de hemicelulasas (xilanasas) libera la ligninareduciendo el uso de compuestos clorados. El preblanqueo xon xilanasases utilizado actualmente en varias plantas productoras de papel.Recientemente se ha comenzado a probar el sistema lacasa-mediador enRecientemente se ha comenzado a probar el sistema lacasa-mediador enbioblanqueo.
Se reduce el uso de químicos.
Biorremediación
•Debe encararse de modo multifacético•El medioambiente es heterogéneo•Prenta gran complejidad•Actividad interdisciplanaria: microbiologíaIngenieríaIngenieríaGeologíaQuímica
•Tiene múltiples aplicaciones, aguas subterráneas, sedimentos, lodos, suelos, en tratamientos líquidos, gases y sólidos•Puede ser aplicada a grandes extensiones
Biorremediación
Antes de tomar una desición debemos preguntarnos:
¿el contaminante es biodegradable?
¿la biodegradación ocurre en el lugar naturalmente?
¿las condiciones ambientales son apropiadas para la biodegradación?
Si el contaminante no es totalmente degradado ¿Qué haremos después?
Factores que limitan la biorremediación:
Factores ambientales: pH, temperatura, oxígeno, humedad, fuente de carbono y energía, etc
Microorganismos: concentración de biomasa, diersidad de población, actividad enzimatica, etc
Sustrato: características físico-químicas, estructura molecular y
Biorremediación
Sustrato: características físico-químicas, estructura molecular y concentración
Biodisponibilidad del contaminante, puede limitar la remediación de 3 formas:•La cantidad del contaminante es baja e insuficiente para generar laenergía que induzca a la biodegradación•La biodegradaciónse produce pero no es suficiente para un aumento demasa microbiana importante•Contaminante induce la degradación y la tasa de crecimiento delmicroorganismo y la biorremediación es exitosa
Laboratorio
Selección del organismo
Estudio de su fisiología
Industria
Necesidad de tratamiento
Efluentes(toxicidad, color,
metales, mat. org.)Estudio de su fisiología(crecimiento, producción de
enzimas, capacidad de decoloración,absorción de metales pesados, etc.)
Medioambiente
metales, mat. org.)
Evaluación del métodoDesarrollo
EscaladoPiloto
Conclusiones
Los tratamientos de biorremediación en la actualidad utilizanmayoritariamente bacterias.
Para aplicar hongos en dichos tratamientos aún se debe reducir el costo dela producción enzimática, para hacerlos competitivos frente a las tecnologíastradicionales. Esto puede lograrse:•Optimizando la producción enzimática en medios baratos•Optimizando la producción enzimática en medios baratos•Obteniendo enzimas recombinantes, expresadas en levaduras o bacterias.
Aunque se ha comprobado la capacidad de los hongos ligninolíticos paradegradar distintos contaminantes ambientales, falta establecer el rol precisode las enzimas involucradas en esos procesos y los factores que regulan suproducción y actividad.
Objetivos: Aportar conocimiento que contribuyan al desarrollo detecnologías de biorremediación utilizando hongos ligninolíticos o susenzimas
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