Biyokimya 4

BİYOKİMYA I4. Peptidler

F. Zihnioğlu

PeptidPeptidlerlerAmino acid Polipeptid Protein

Aminoasitlerin birinin α-karboksil grubu ile diğer aminoasidin α-amino grubu arasında 1 mol su ayrılmasıyla oluşan kovalent bağa peptid bağı

denir. Bu bağ amid bağı karakterindedir.

Karboksil grubu

Amino grubu

PeptidBağı

DipeptidAA1 AA2

PeptidPeptidlerler

<10 aminoasit : Oligopeptid

<100 aminoasit : Polipeptid

>100 aminoasit : Proteinler

Peptidler yapısına giren aminoasit sayılarına göre;

2 aminoasit : dipeptid3 aminoasit : tripeptid4 aminoasit : tetrapeptid5 aminoasit : pentapeptid

Peptidlerde adlandırma yapılırken karboksil grubu reaksiyona katılan aminoasidin adına –iltakısı eklenir.

N - terminal C - terminal

serin-glisin-tirozin-alanin-Lösin• N-ucu; Serin, C-Ucu; Lösin

• 4 peptid bağı

• 5 AA; penta peptid

• Serilglisiltirozilalanillösin

3 Harfli kısaltma

Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu

Tek Harfli kısaltma

SGYAL

Alanilglisin

AlaAla——GlyGlyNN--terterminalminal CC--terminalterminal

CHCH33

OO

AGAG

CCHH33NN++

HH

CC

OO

CCNN

HH

HH

CC OO––

HH

Alanilglisin ve Glisilalaninyapısal izomerlerdir.

CHCH33

OO

CCHH33NN++

HH

CC

OO

CCNN

HH

HH

CC OO––

HH

HH

OO

CCHH33NN++

HH

CC

OO

CCNN

HH

CHCH33

CC OO––

HH

AlanAlaniillglglisinisinAlaAla——GlyGly

AAGG

GlGlisilisilalaninalaninGlyGly——AlaAla

GGAA

• 40% çift bağı karakteri– Rezonans formülleri– Kısa bağ uzunluğu

Yaklaşık 0.133 nm uzunluğunda – tipik tek bağdan daha kısa ancak çift bağdan uzun

– Çift bağ rotasyona engel olur. Çift bağ karakterine bağlı olarak peptid bağındaki 6 atom her zaman planar(düzlemsel) yapıdadır.

Peptid Bağı ve Yapısı

• Peptid bağı ; protein yapısı ve fonksiyonunda etkin rol oynar.

• Temel özellikler:– 1. Planar(düzlemsel)– 2. Kısmi çift bağ karakterine bağlı olarak; rijit– 3. Hemen hemen her zaman trans konfigürasyonda– 4. Polar. En az 2 hidrojen bağı oluşturabilir.

Peptid Bağı ve Yapısı

Peptid Bağının Planar Yapısı(Amid Düzlemi)

Peptid Grubundaki 6 atom tek bir düzlemde yer alır!

Amid azotu ile karbonil oksijeni arasındaki rezonans nedeni ile peptid bağı planar ve sabittir.

Peptid Bağı Rezonans Formülleri

Peptid iskeleti bağ rotasyonlarındaki limitasyonlar nedeni ile rijittir.

C=O arasındaki çift bağC-N bağının rotasyonunu sağlar

C=N arasındaki çift bağC-N bağının rotasyonunu engeller, ancak O ve N üzerinde yükler oluşur.

Doğru elektron yoğunluğunun bulunduğu araürün. C-N bağırotasyonu için gerekli enerji bariyeri(88kJ/mol) amidgrubunu planar tutmak için yeterli

Peptid Bağı Uzunlukları

Bağ Açıları ve Uzunlukları

Peptid Bağı, ω, φ ve Ψ açıları

Phi, φ: N-Cα bağında rotasyon, +180 den -180°.

Psi, ψ: Cα - C bağında rotasyon, +180 den -180°.Omega, ω : peptid bağında rotasyon, Cα1-{C-N}- Cα2

ω(omega)

“Peptid bağı planar ve sabit”Sadece alfa karbona bağlı bağlar etrafında

rotasyon mümkümdür.

• ω açısı planardır (0º - cis, veya 180 º - trans)• φ ve ψ esnektir, rotasyon bu bağlarda oluşur• Ancak, bir amino asit artığı için φ ve ψ sterik

engeller ile limitlidir.

• Eğer (φ,ψ) tüm artıklar için biliniyor ise, peptidin iskelet yapısı da biliniyor demektir.

• Pozitif (φ,ψ) değerleri Cα dan bakıldığında saat yönünde rotasyonu ifade eder.

Amid Düzlemlerinin Rotasyonu

Yasaklanmış Yapılar(sterik engelleme)

(φ,ψ)=(0,180), iki karbonil oksijeni birbirine çok yakın (φ,ψ)=(180,0), iki amid grubu çakışır;(φ,ψ)=(0,0), karbonil oksijeni amid grubu ile çakışır.

Mümkün olan iki konfigürasyon vardır, her ikisi de planardır.

Trans istemli konfigürasyon; özellikle büyük R grupları ileCis çoğunlukla PRO artıkları, ancak trans form 4:1 daha istemli

Peptid konformasyonları

Trans peptid grubu Cis peptid grubu

Prolin, izleyen amino asit artığına göre trans veyacis polipeptid formu oluşturabilir. Beş üyeli halka yapısının varlığı, φ açısının(N ve Cα arasındaki açı)

yaklaşık olarak -65o dir.

Prolin izomerleri

Bağ rotasyonu; protein katlanmasıve 3 boyutlu yapı için önemlidir.

Ramachandran DiyagramlarıPhi ve psi açılarının mümkün olan tüm kombinasyonlarını içerir.

Bazı açılar proteinlerin spesifik sekonder yapılarının tayini için tanımlayıcıdır.

Φ(phi) ye karşı ψ(psi) diyagramları

Ramachandran Plot

Beyaz = sterikçe izin verilmeyen konformasyonlar(atomlar van der Waals yarıçapları toplamından daha fazla birbirlerine yaklaşırlar)Mavi = sterikçe izin verilen konformasyonlar

Peptidlerin de serbest aminoasitler gibi karakteristik bir titrasyon eğrisi ve izoelektriknoktası mevcuttur.

Örneğin; GluGlyAlaLys tetrapeptidinde çok asidik pH’da pKa nın altında tüm iyonize olan gruplar protonlanmış formda bulunur ve net yükü +2 dir. Bundan sonra NaOH ile titre edilir ve protonlar uzaklaştırılırsa farklı gruplara pH değerine göre pKa değerlerinin üzerinde protonlarını kaybederler.

Net yükün 0 olduğu pH, izoelektrik noktadır.

Peptidlerin Titrasyon Eğrisi ve İzoelektrik Nokta

Bir tetrapeptid;Glu-Gly-Ala-LysN-terminal: Glu, C-terminal: Lys aminoasitleri3 peptid bağıGlutamilGlisilAlanilLizin

Bir tetrapeptidin poliamfolitik davranışı

PEPTİD YAPI ANALİZİ

♣Aminoasit bileşenlerinin tayini

♣ Aminoasit dizi analizi

♣ Polipeptid zincirinin yapısı

♣ R-gruplarının pozisyonları

♣ Çoklu peptid zincirlerin varlığı

♣ Protein olmayan bileşenlerin belirlenmesi

Genelde asit hidrolizi; 6 N HCl ile 110oC de azot altında 24 saatte aminoasitlerine hidrolizlenirler.

Aminoasit karışımı; a) Klasik aminoasit analizörü

b) HPLC yada

c) Gaz-sıvı kromatografisi ile analizi yapılır.

Aminoasit Bileşenlerinin Tayini

a) Non-kovalent bağların parçalanması (pH, sıcaklık, kimyasal modifikasyon, denaturantlar (üre, GdnHCl, SDS)

b) Kovalent bağların parçalanması; disülfitbağların parçalanması (zincir içi veya zincirlerarası) (performik asit oksidasyonuveya merkaptoetanol ile indirgeme)

Doğal Yapının Bozundurulması

Peptidlerin hidrolizi çeşitli yollarla olur: 1) Asit veya baz hidrolizi:

Tüm peptid bağlarının hidrolizi, örn:6 N HCl, 110 oCveya kısmi hidroliz

2) Enzimatik; proteolitik enzimler(proteazlar)

3) Kimyasal; Spesifik peptid bağlarının CNBr ile parçalanması örn: Met’nin C-ucundan hidrolizi

Peptid Hidrolizi ve Fragmantasyon

Bazı proteolitik enzimlerin dizi spesifikliği

CNBrReaksiyonu

N-terminal belirlenmesi1) Sanger metodu(2,4-DNFB)

2) Edman degradasyonu(PITC)

3) Dansil metodu(Dansyl-Cl)

4) EnzimatikYönt.(aminopeptidaz)

1)Hidrazinoliz (Hidrazin ile parç.)

2) LiBH4 ile indirgeme

3) Enzimatik(Karboksipeptidaz)

C-terminal belirlenmesi

• Frederick Sanger tarafından geliştirilmiştir.• İnsulin dizisinin belirlenmesi için

kullanılmıştır.– (6 kDa protein)

• 12 yıl bu metod ile uğraşmış• 1958 yılında Nobel ödülü

N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu

Sanger metodundaki anahtar reaktif;1-fluro-2,4-dinitrobenzen

“Sanger Reaktifi”“nukleofilik aromatik substitüsyon”

FFOO22NN

NONO22

N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu

1-Floro-2,4-dinitrobenzen N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer.

Sanger Metodu(devam)

FFOO22NN

NONO22

NNHCHHCH22CC NNHCHCOHCHCO

CHCH33

NNHCHCHCHC

CHCH22CC66HH55

HH22NNCHCCHC

OO OOOOOO

CH(CHCH(CH33))22

––++

OO22NN

NONO22

NNHCHHCH22CC NNHCHCOHCHCO

CHCH33

NNHCHCHCHC

CHCH22CC66HH55

NNHCHCHCHC

OO OOOOOO

CH(CHCH(CH33))22

––

- HF

Kuvvetli Asit(HF) hidrolizi ile tüm peptid bağlarıparçalanarak amino asit karışımı oluşur. Bu karışımda sadece N-terminalde yer alan amino asit 2,4-DNP amino asit türevidir.

OO22NN

NONO22

NNHCHHCH22CC NNHCHCOHCHCO

CHCH33

NNHCHCHCHC

CHCH22CC66HH55

NNHCHCHCHC

OO OOOOOO

CH(CHCH(CH33))22

––

HH33OO++

OO

OO22NN

NONO22

NNHCHCOHHCHCOH

CH(CHCH(CH33))22

HH33NNCHCOCHCO––

CHCH33

++HH33NNCHCH22COCO––

OO OO

++

OO

HH33NNCHCOCHCO––

CHCH22CC66HH55

++++ ++

++

Sanger Metodu(devam)

2,4-DNP Valin

Edman Degradasyonuve Peptidlerin Otomatik

Dizi Analizleri

N-terminal belirlenmesi Edman Metodu

Edman Metodu(Degradasyonu)

peptidpeptid

İşaretleme (PITC)

İşaretleme (PITC)

ParçalamaParçalama

Diğer döngüDiğer döngü

BaBağğlanma adlanma adıımmıı

DDüüzenlenme adzenlenme adıımmıı

1. N-terminal amino asit tayin yöntemi2. Sıralı olarak yapılabildiği için, aynı örnek

üzerinde dizi analizlenebilir. Genelde N-terminalden başlıyarak 20 AA(20 döngü) bu metod ile belirlenebilir.

3. 10-10 g örnek yeterlidir.4. Otomatize edilebilir.

Edman Degradasyonu (devam)

Edman degradasyonundaki anahtar reaktif;“fenil izotiyosiyanat”

(PITC)

NN CC SS

Edman Degradasyonu (devam)

Fenil izotiyosiyanat N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer.

peptidpeptidHH33NNCHCCHC

OO

RR

++NNHHCC66HH55NN CC SS ++

Edman Degradasyonu (devam)

peptidpeptidCC66HH55NNHCHCNNHHCHCCHC

OO

RR

NNHH

SS

feniltiyokarbamoilfeniltiyokarbamoil ttüürevirevi (PTC)(PTC)

PTC türevleri daha sonra TFA(susuz ortam) ile muammele edilerek N-terminal AA peptidden ayrılır.

Edman Degradasyonu (devam)

peptidpeptidCC66HH55NNHCHCNNHHCHCCHC

OO

RR

NNHH

SS

TFATFA

peptidpeptidHH33NN++

++CC66HH55NNHH CC

SSCC

NN CHCH

RR

OO

tiyazolontiyazolon

TiyazolonTiyazolon oluoluşşum um kokoşşullarullarıında, nda, tiyazolontiyazolon

tekrar dtekrar düüzenlenerek zenlenerek NN--terminal amino terminal amino asitinasitinfeniltiyohidantoinfeniltiyohidantoin (PTH)(PTH)

ttüürevi olurevi oluşşur.ur.

Edman Degradasyonu (devam)

CC66HH55NNHH CCSS

CC

NN CHCH

RR

OO

CCCCNN

HNHN CHCH

RR

OOSS

CC66HH55

peptidpeptidHH33NN++

++

PTH AA türevi izole edilir ve tanımlanır.

Zarar görmeden kalan peptid(1 AA eksik), tekrar Edman degradasyonunatabi tutulur.(2.,3.,döngüvb.)

CCCCNN

HNHN CHCH

RR

OOSS

CC66HH55

Edman Degradasyonu (devam)

PTH- Amino asit türevi

Dansil Metodu ile N-terminal Analizi

Bir çok peptidde N-terminal, N-formil veya N-asetilgrupları ile bloke edilmiş formda bulunurken C-terminal ise amidlere modifiye olmuştur.

N-Formil grubu

N-Asetil grubu

C terminal amidi

Amino asitler arasında peptid bağı oluşturmak zor değildir.Esas önemli olan amino asitleri doğru dizide birleştirmekÖrn: fenilalanin ve glisin karışımında gelişigüzel peptid bağı oluşumu 4 tane dipeptidoluşumu ile sonlanır.Phe—Phe, Gly—Gly, Phe—Gly, Gly—Phe

Peptid Sentezi

1. Olasılık sayısını sınırlamak için bir amino asitinamino azotu ile diğer amino asitin karboksil grubunu “koruma” altına almak gerekir.

NN--KorunmuKorunmuşşfenilalaninfenilalanin

CC--KorunmuKorunmuşşglisinglisin

NNHCHCOHHCHCOH

CHCH22CC66HH55

OO

XX HH22NNCHCH22CC

OO

YY

Peptid Sentezi

2. İki korunmuş amino asidin bağlanması

Peptid Sentezi

NNHCHHCH22CC

OO

YYNNHCHCHCHC

CHCH22CC66HH55

OO

XX

NNHCHCOHHCHCOH

CHCH22CC66HH55

OO

XX HH22NNCHCH22CC

OO

YY

3. N-terminaldeki amino grubu ve C-terminaldeki karboksil grubu korumasının kaldırılması

NNHCHHCH22COCO

OO

HH33NNCHCCHC

CHCH22CC66HH55

OO++ ––

PhePhe--GlyGly

NNHCHHCH22CC

OO

YYNNHCHCHCHC

CHCH22CC66HH55

OO

XX

Peptid Sentezi

Peptid Sentezi: Amino Grubunun KorunmasıAmino Gruplarının Amid Formunda Korunması* Amino grupları amidlere dönüştürülerek korunabilirler. * Benziloksikarbonil (C6H5CH2OCO—) yaygın olarak kullanılan koruyucu gruptur ve Zkısaltması ile ifade edilir.* Z-koruması amino asidin benziloksikarbonilklorür ile muammele edilmesi ile gerçekleştirilir.

CHCH22OCClOCCl

OO

++ HH33NNCHCOCHCO

CHCH22CC66HH55

OO––++

1. 1. NaOHNaOH, H, H22OO

2. H2. H++

NNHHCHCOHCHCOH

CHCH22CC66HH55

OO

CHCH22OCOC

OO

(82(82--87%)87%)

Amino Gruplarının Amid Formunda Korunması

benziloksikarbonil klorür(Z)

Phe

NNHHCHCOHCHCOH

CHCH22CC66HH55

OO

CHCH22OCOC

OO

KKıısaltma:saltma:

ZZNNHHCHCOHCHCOH

CHCH22CC66HH55

OO

veya veya ZZ--PhePhe

Amino Gruplarının Amid Formunda Korunması

Benziloksikarbonil koruyucu grubunun en büyük avantajı kolayca uzaklaştırılabilmesidir.

a) hidrojenolizb) HBr(asetik asitte) ile parçalama

Z- Korumasının kaldırılması

Z-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: Hidrojenoliz

NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33

CHCH22CC66HH55

OO

CHCH22OCOC

OO

HH22, Pd, Pd

HH22NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33

CHCH22CC66HH55

OO

CHCH33 COCO22

(100%)(100%)

NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33

CHCH22CC66HH55

OO

CHCH22OCOC

OO

HBrHBr

HH33NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33

CHCH22CC66HH55

OO

CHCH22BrBr COCO22

(82%)(82%)

++

BrBr ––

Z-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: HBr ile Parçalama

NNHHCHCOHCHCOH

CHCH22CC66HH55

OO

(CH(CH33))33COCCOC

OO

KKıısaltma:saltma:

BocBocNNHHCHCOHCHCOH

CHCH22CC66HH55

OO

veyaveya BocBoc--PhePhe

Peptid Sentezi: Amino Grubunun Korunmasıtert-Butoksikarbonil Koruyucu Grup

NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33

CHCH22CC66HH55

OO

(CH(CH33))33CCOCOC

OO

HBrHBr

HH33NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33

CHCH22CC66HH55

OO

COCO22

(86%)(86%)

++

BrBr ––CHCH22CC

HH33CC

HH33CC

Boc-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: HBr ile Parçalama

Karboksil grupları genelde ester formunda korunur. Metil ve etil esterlerinden korumanın kaldırılması bazik ortamda hidroliz ile gerçekleştirilir. Benzil esterler hidrojenoliz ile parçalanırlar.

Peptid Sentezi: Karboksil Grubunun Korunması

Karboksil Gruplarının Ester Formunda Korunması

Benzil EsterlerininHidrojenolizi

NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCOCHCH22CC66HH55

CHCH22CC66HH55

OO

CC66HH55CHCH22OCOC

OO OO

HH22, Pd, Pd

HH33NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO

CHCH22CC66HH55

OO

CC66HH55CHCH33 COCO22

(87%)(87%)

++ –– CHCH33CC66HH55

Katı(solid) faz sentezinde başlangıç materyali inert katı bir destek materyaline bağlanır. Reaktantlar çözeltiye eklenir. Reaksiyon; katı ve solüsyon arasındaki arayüzede gerçekleşir. Başlangıç materyali katıdestek üzerine bağlı olduğundan oluşan her ürün de katı destek materyaline bağlı olarak kalır.Saflaştırma; katı destek materyalinden basit bir yıkama ile yan ürünlerin uzaklaştırılması ile gerçekleşir.

Katı-Faz Peptid Sentezi: Merrifield Metodu

Katı Destek Materyali

Stiren ve divinilbenzen kopolimeriYukarıda polstiren gösterilmiştir, divinilbenzenile çapraz bağlama ile daha rijit bir polimer elde edilmektedir.Polimerik desteğin klorometilmetil eter ve SnCl4ile muammele edilmesi ile benzen halkalarında ClCH2 yan zincirlerinin oluşmasını sağlar.

CHCH22 CHCH22 CHCH22 CHCH22CHCH CHCH CHCH CHCH

CHCH22 CHCH22 CHCH22 CHCH22CHCH CHCH CHCH CHCH

CHCH22ClCl

Klorometil grubu bir benzil halojenürdür ve nukleofiliksübstitüsyona reaktiftir(SN2).

Katı Destek Materyali

Klorometillenmiş destek materyaline Boc-korumalıC-terminal amino asit ilave edilir, nükleofiliksübtitüsyon oluşur ve Boc-korumalı amino asit reçineye ester olarak bağlanır.

Merrifield Yöntemi

BocBocNNHHCHCOCHCO

RR

OO––+

Daha sonra Boc koruyucu grup HCl ile uzaklaştırılır.

Amino grubunun aktivasyonu (DCC) sonrası ikinci amino asidin bağlanması

BocBocNNHHCHCOCHCO

Merrifield Yöntemi

RR22

OO––

Boc koruyucu grubun uzaklaştırılması

Bir sonraki amino asidin eklenmesi ve döngünün

tekrarlanması

Merrifield Yöntemi

Sentezlenen peptidin katı destek materyalinden ayrılması

(CF3CO2H de hazırlanmış HBr)

Merrifield yöntemi otomasyona uygun

Bir nanopeptid (bradykinin),1962 yılında, 8 günde 68% verim ile sentezlenmiştir.

Ribonukleaz (124 amino asit), 1969369 reaksiyon; 11,391 adım

Kimyada Nobel Ödülü: 1984

Merrifield Yöntemi

Fizyolojik Öneme Sahip Küçük Peptidler