Fizyopatoloji(Klinik Biyokimya)Yrd. Doç. Dr. Serkan SAYINER

Yakın Doğu Üniversitesi, Veteriner Fakültesi

Biyokimya Anabilim Dalı

serkan.sayiner@neu.edu.tr

Klinik Biyokimya dersinde öğreneceklerimiz.

▪ Klinik Biyokimya nedir?

▪ Klinik Biyokimya ilgi alanları

▪ Biyolojik Materyaller

▪ Pre-Analitik Süreç (Teknik ve Biyolojik Faktörler)

▪ Analitik Süreç (Metot seçimi, metot geçerliliği, kalite kontrol)

▪ Post-Analitik Süreç (Sonuçların değerlendirilmesi, referans değer, raporlama)

Klinik Biyokimya dersinde öğreneceklerimiz.

▪ Su-Elektrolit Dengesi

▪ Asit-Baz Dengesi

▪ Klinik Enzimoloji

▪ Karaciğer Fonksiyon Testleri

▪ Pankreas Fonksiyon Testleri

▪ Böbrek Fonksiyon Testleri

▪ Tiroid ve Paratiroid

▪ Glandula suprarenalis, hipofiz

▪ Sindirim Fonk. (Ruminantlar, rumen?)

▪ Plazma ve serum proteinleri

▪ Kan Lipidleri

▪ İskelet Kası

▪ Reprodüktif Endokrinoloji

▪ Tümör Belirteçleri

Başlıca Yararlanılacak Kaynaklar

▪ Karagül H, Altıntaş A, Fidancı UR, Sel T, 2000. Klinik Biyokimya. Medisan, Ankara

▪ Kaneko JJ, Harvey JW, Bruss ML, 2008. Clinical Biochemistry of Domestic Animals, 6th edi. Academic Press-Elsevier

▪ Thrall MA, Weiser G, Allison RW, Campbell TW, 2012. Veterinary Hematology and Clinical Biochemistry, 2nd edi. Wiley-Blackwell

▪ Pineda MH, Dooley MP, 2003. McDonald’s Veterinary Endocrinology and Reproduction, 5th edi. Blackwell Publishing.

▪ Rizzi TE, Valenciano A, Bowles M, Cowell R, Tyler R, DeNicola DB, 2017. Atlas of Canine and Feline Urinanalysis, 1st edi. Wiley-Blackwell

▪ Sink CA, Weinstein NM, 2012. Practical Veterinary Urinanalysis, 1st ed. Wiley-Blackwell

Klinik Biyokimya nedir, ilgi alanları nelerdir ?

Fizyopatoloji ve Klinik Biyokimya’nın Tanımı

▪ FİZYOPATOLOJİ; hastalığa bağlı olarak anormal durumlardan sorumlu tutulan normal regülatör mekanizmalardaki bozukluğun incelenmesidir. Diğer bir ifade ile; Anormal bir iç ortamda hüküm süren fizyolojidir.

▪ KLİNİK BİYOKİMYA; Hastalıkların tanısı ve seyri bakımından vücudu ve onun dışarıya alınmış veya atılmış çeşitli sıvı ve doku parçalarını (biyopsi) inceleyen, sonuçlarından tedavinin ve prognozun izlenmesinde yararlanılan bir bilimdir.

▪ Kısaca; kliniğe özgü bir laboratuvar bilimidir.

▪ Vücut sıvılarının, dokularının ve hücrelerinin analizi ile test sonuçlarının sağlık ve hastalık ilişkisini yorumlamayı amaçlayan ve bu yönde çalışılan klinik patoloji dalıdır.

Klinik Biyokimya

▪ Klinik Biyokimya, molekül düzeyinde normalden sapmış anormal mekanizmaları inceler.

▪ Bu iş için geliştirilmiş laboratuvar teknikleri ve moleküler mekanizmalardan yararlanılır.

▪ Hedefe dolaylı yoldan ulaşır, fakat gelişen teknolojiler sayesinde oldukça hassas ve özgül sonuçlar verir.

▪ Kimyasal analizler başlıca serum ya da plazmada gerçekleştirilir.

Klinik Biyokimya

▪ AMAÇ: Veteriner hekimliği eğitimi alan öğrencilerin gerek teorik ve gerekse olgu tanıtımı üzerinde Temel Biyokimya derslerinde aldıkları bilgilerin olgu üzerinde toplanmasını sağlamak ve gerektiğinde bu bilgileri çağırarak hastalık ya da bozuklukların moleküler mekanizmalarının açıklanmasında ve hastalık tanısında yararlı olabilecek parametrelerin seçiminde ve test sonuçlarının yorumlanmasında kullanabilecek tüm bilgi ve becerilerin kazandırılmasıdır.

▪ Hastalık teşhisine giden yolda klinik biyokimya testleri önemli rol oynar. Hastanelerde yapılan laboratuvar testlerin 3’te 1’i klinik biyokimyasal testlerdir.

Klinik Biyokimya

▪ Hastalık tanı ve prognozunda üstlendiği fonksiyonları yanında koruyucu hekimlik alanında da önemli rolu vardır.

▪ Hayvanların beslenme ve yetiştiricilik problemlerinin, normal olarak kabul edilen değerlerde ırk, fizyolojik ve bölgesel durumlara göre izlenmesinde, hastalıklara zemin hazırlayan koşulların ortaya konmasında da önemli görevi vardır.

▪ Klinik Biyokimya ve Biyokimya, klinik hekimliği ve bir çok bilim dalı ile direkt ilişki içerisindedir.

Biyokimya

ve

Klinik

Biyokimya

Genetik

Moleküler

Biyoloji

Toksikoloji

İmmunolojiMikrobiyoloji

Viroloji

Endokrinoloji

Fizyoloji

Farmakoloji

Veteriner

Hekimliği

Beşeri

Hekimliği

Anamnez

Muayene

Diagnostik Servis

Laboratuvar Hizmeti

Klinik Biyokimya

Görüntüleme Fizyolojik Testler (EEG, EKG, Solunum gibi)

Acil Testler Temel testler Özel Testler

Hematoloji Histopatoloji Sitoloji İmmunoloji Mikrobiyoloji

Klinik Biyokimyada incelenen Biyolojik Moleküller

Metabolitler

▪ Metabolik aktivite sonucu oluşan moleküllerdir.

▪ Konsantrasyon ölçümleri metabolizma hakkında bilgi verir.

▪ Serum veya plazmada konvansiyonel olarak mg/dL veya g/dL, SI birimlerine göre mmol/L düzeyindedirler.

▪ Klinik biyokimya analizlerinin yaklaşık % 60’ ını oluştururlar.

▪ Ör.: Üre, Kreatinin, Albümin, Protein-Total, Bilirubin, Kolesterol

Enzimler

▪ Normalde hücre içi protein molekülleridir.

▪ Plazmada bulunan fonksiyonel enzimler hariç (!).

▪ Kandaki yüksek aktivitleri genellikle hücresel dejenerasyonu ifade eder, plazmada bulunan fonksiyonel enzimler hariç.

▪ Klinik biyokimyasal analizlerin % 30’ unu oluşturular.

▪ Ör.: AST, ALT, GGT, CK, LDH ....

Mineraller

▪ Makro ve mikro (iz veya eser) elementler.

▪ Vücut sıvıları ve dokuların enerji, ozmotik basıncı, asit baz dengesi, sinirsel fonksiyon, enzim aktivasyonunda kofaktör olmak gibi önemli görevleri vardır.

▪ Ör.: P, Ca, Na, K, Cl, Zn, Cu, Co, Fe ....

Süt humması Kaynak: UWaterloo

Hormonlar, Vitaminler ve Diğerleri

▪ Vücut sıvılarında ve dokularında eser miktarda bulunurlar.

▪ Serum veya plazma düzeyleri ng veya nmol seviyesindedir.

▪ Üstlendikleri fonksiyonlar son derece önemlidir.

▪ Biyokimyasal analizlerin yaklaşık % 10’ unu oluşturular.

▪ Ör.: Steroid hormonlar (Progesteron gibi), 25-OH Vitamin D3,Total T4

Biyolojik MateryallerKAN, İDRAR,DIŞKI, LENF, TER, GÖZYAŞI, SİNDİRİM SALGILARI, PONKSİYON SIVILARI, BOS, GENİTAL SALGILAR, TAŞLAR ve DOKULAR

Kan

▪ Damar sistemi içinde dolaşan biyolojik bir sıvıdır.

▪ İçeriği: Erimiş halde moleküller + asılı halde hücresel bileşenler

Kaynak: FisherBioservices

Kan

▪ Kimyasal Bileşimi: % 85’i su, % 15’i katı madde içerir.

▪ Oranlar hayvanlar arası, metabolizma durumu, patolojik durumlara göre değişir.

▪ Görevleri

▪ Kan taşıyıcı sistemdir.

▪ Doku ve organlarda pH, osmotik basıncı denge halinde tutmak.

▪ Beden sıcaklığını korumak.

▪ Enfeksiyonlara karşı savunma mekanizmasını sağlamak.

▪ Oksijen taşımak.

Kan

▪ Kan örneği alımı ne zaman alınmalıdır ?

▪ Genellikle en son besin alımından 12 saat sonra (???).

▪ Serum, plazma ve tam kan farkı.

▪ Plazmada fibrinojen bulunur.

▪ Hangi tüpten ne elde edilir?

Kan

▪ Kan alımı: Arter, Vena, Kapiller Damarlar ?

Kaynak: WikiMedia

Kan

▪ Kan alımı: Arter, Vena, Kapiller Damarlar?

▪ Ruminantlar: Vena jugularis, vena caudalis mediana (coccyeal vena)

▪ Kedi ve köpekler: Vena cephalica antebrachii, vena saphena lateralis, vena saphena medialis, vena jugularis

▪ Tavuklar: Vena ulnaris

▪ Tavşan: Vena auricularis

▪ Rodentler: Vena caudalis, kalp, juguler vena

▪ Diğer Reptiller: Vena jugularis, vena caudalis, vena cephalica, servikal venöz sinüs

▪ Hangi tüpe, ne kadar almamız gerektiğini önceden belirlemeliyiz.

Kan

Kaynak: Town Center Vet

Kan

Kaynak: FlickrKaynak: The Cat Clinic Kaynak: Metzer Farms

Kan

Kaynak: Zwarg ve ark., 2014 Kaynak: Reptiles Magazine

İdrar

▪ İdrar nedir ?

▪ Böbreklerden salgılanan kanın veya plazmanın ultrafiltradır.

▪ Kan glomeruluslardan süzülür (~1700 L).

▪ Proksimal tubuluslarda elektrolitler, glikoz ve amino asitler geri emilir.

▪ Distal tubuluslarda Na, Cl ve H2O geri emilir (ADH?).

İdrar

▪ Görevleri;

▪ Ekstrasellüler ve intrasellüler sıvılar arasındaki dengenin korunması.

▪ Asit-baz dengesini korumak.

▪ Artık metabolit ürünlerin vücuttan uzaklaştırılması.

▪ İçeriği;

▪ Su (~%95) ve tuzlar (Na, Cl, K, Ca, Mg ...)

▪ Asit ve bazlar (H+, OH-)

▪ Metabolizma sırasında yıkılma ürünleri (Üre, Ürik asit, kreatinin gibi)

▪ Toksik veya detoks edilmiş maddeler

▪ Kanda hiper düzeye geçmiş maddeler (Glikoz, aseton, bilirubin gibi...)

Kaynak: NatureWorlds

İdrar

▪ Örnek alımı

▪ Steril ve yeteri kadar alınmalıdır.

▪ Yerden alım?

▪ Spot idrar (serbest yakalama)

▪ Kateter yardımı ile

▪ Sistosentez

Kaynak: University of Minnesota

İdrar

▪ İdrar Analizleri

1. Fiziksel Analiz: Herhangi bir işlem yapılmadan gerçekleştirilir.

▪ Renk,koku, bulanıklık

▪ Miktar, Özgül ağırlık/Dansite, pH

2. Kimyasal Analiz:

▪ Glikoz, Protein, Keton, Bilirubin, Ürobilinojen, Nitrit, Kan

3. Mikroskopik Analiz: İdrar tortusunun incelenmesidir. Santirfüj sonrası elde edilen sedimentten 400 kat (40X) büyütme ile yapılır.

▪ Organik sedimentler

▪ İnorganik sedimentler

İdrar

Dışkı

▪ Gaita veya feçes olarak da isimlendirilir.

▪ Fiziksel ve kimyasal muayenesi ile metabolizma ve olası bir patolojik durum hakkında bilgi kazanılabilir.

▪ Kanama (GGK-FOB), safra pigmentleri, organik asitlerin tayini, pankreatik amilaz, elastaz, yağ damlacıkları, nişasta aranması gibi testler ile dışkı muayenesi yapılabilir.

▪ Bunlar dışında hücre, parazit aranması gibi muayenelerde yapılabilir.

Diğer Biyoloijk Materyaller

▪ Lenf

▪ Ter

▪ Gözyaşı

▪ Humor aköz

▪ Sindirim Salgıları

▪ Tükürük / Salya

▪ Ponksiyon Sıvıları (Sinovyal sıvı, kist sıvısı, amniyon sıvısı, BOS)

▪ Taşlar (Böbrek, Safra, Pankreas)

▪ Dokular

Kaynak: TodaysVet.Pra.

Analitik

Süreç Post-Analitik

Süreç

Pre-Analitik SüreçTeknik ve Biyolojik Faktörler

Pre-Analitik Süreç

▪ Hayvanın geçmişi (anamnez) ile başlayıp, talep edilen analiz/lerin başlayacağı ana kadar geçen süreçtir.

▪ Tıbbi laboratuvarlarda, kan örneklerinin alınması özel eğitimli personeller tarafından gerçekleştirilip, hastalar talep edilen testlere göre yönlendirilerek uygun koşullar altında örneklerin alınması sağlanmaktadır.

▪ VETERİNER LABORATUVARLARINDA ise pre-analitik süreç daha sınırlı bir kapsama sahiptir. Özellikle kan alma süreci kliniklerde gereçekleştirildiği için pre-analitik sürecin bir kısmı tamamen laboratuvarun kontrolü dışında olmaktadır.

Pre-Analitik Süreç

▪ Pre-Analitik evre veteriner hekimliğinde ikiye ayrılır.1. Laboratuvar öncesi : Hayvanın hazırlanması, örnek alma ve lab.a

transportu kapsar.

2. Laboratuvar içi: Örnek laboratuvara ulaştıktan sonra başlar.

▪Veteriner klinik laboratuvarlarında ortaya çıkan hataların 2/3’sinin preanalitik süreç ile ilgili olduğunu bilinmektedir (Hooijberg ve ark., 2012).

Pre-Analitik Süreç

▪Örnek alımı sırasında;1. Hayvanların açlık veya tokluk durumu,

2. Yaptıkları seyahatten ötürü stres altında olmaları,

3. Yeni bir klinik ortamına getirilmelerinin gerginliğini taşıyabilecekleri dikkate alınmalıdır.

Pre-Analitik Süreç

Hatalı alınmış veya kalitesi düşük örnekler nedeniyle;

• Sonuçlarda hata,

• Örneğin tekrar alınması,

• Sonuçların hatalı değerlendirmesi,

• Personel ve finansal kaynakların verimsiz kullanılması gibi olumsuz durumlar ortaya çıkacaktır.

Pre-Analitik Süreç

1.TEKNİK FAKTÖRLER

2.BİYOLOJİK FAKTÖRLER

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

▪Teknik faktörler, istenen test veya testlere göre örneğin uygun teknik ve materyal kullanılarak alınması, muhafazası ve laboratuvara iletilmesi gibi unsurları içermektedir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Doğru Kan Alma Tüpünün Seçimi ▪ TAM KAN: Antikoagülan madde içeren tüplere alınan kandır.

▪ Başta tam kan sayımı (hemogram) olmak üzere çoğunlukla hematolojik testlerde (kan grubu tayini, kan frotisi, direkt coombs test, immunolojik testler gibi) kullanılmaktadır.

▪ Memelilerde sıvı formda tripotasyumlu (K3) veya dipotasyum (K2) tuzu şeklinde kuru formda (tüp içerisine püskürtülmüş) etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) kullanılmaktadır. Günümüzde en çok plastik K2EDTA tüpleri kullanılmaktadır.

▪ Bazı memelilerde, özellikle kedilerde, EDTA trombositlerin kümeleşmesine (agregasyon) neden olmaktadır.

▪ Kuş, sürüngen ve diğer türlerde ise lityum heparin içeren kan alma tüpleri kullanılması önerilmektedir.

▪ Sınırlı kullanım alanı alan bir diğer heparinli tüp ise koyu yeşil kapaklı sodyum heparin içeren kan alma tüpüdür.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

▪ SERUM ve PLAZMA: Birçok biyokimyasal parametrenin analizi için serum veya heparin plazma kullanımı önerilmektedir.

▪ Bu tüplerde antikoagulan madde bulunmamaktadır.

▪ Serum elde etmek için en çok kullanılan tüpler altın renk kapaklı ve içerisinde ayrışmayı kolaylaştıran ve kan hücresel elemanları ile serum arasına girerek tekrar karışmasını engelleyen jel (tiksotropik jel) ve tüp çeperinde pıhtılaşma aktivatörleri bulunmaktadır. Bu tüplere aynı zamanda serum separatör tüpleri (SST) denmektedir.

▪ Serum elde etmek için kullanılan bir diğer tüp çeşidi ise içinde jel olmayan tüplerdir. Bu tüplere düz kuru tüp ismi de verilmekte ve genellikle kırmızı kapağa sahiptirler.

▪ Biyokimyasal test parametrelerinde heparin plazma ve serum için genellikle benzer sonuçlar elde edilir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

▪ Pıhtılaşma faktörlerinin analizinde ise içerisinde antikoagulan olarak sitrat bulunan tüpler kullanılmalıdır. Bu tüpler açık mavi renkli kapağa sahiptirler.

▪ Bu tüpler dışında daha farklı ve özel amaçlar için kullanılan tüpler de bulunmaktadır. Örneğin gri kapaklı sodyum florid/potasyum oksalat içeren tüpler glikoz ve keton madde analizinde tercih edilmektedir. Bu tüplere glikoz tüpü de denmektedir.

▪ Bunun yanında veteriner alanında pek kullanılmayan ama insan hekimliğinde kullanım alanı bulunan tüpler de bulunmaktadır.

▪ Ör. eser element analizleri için koyu mavi kapaklı kontamine edici metal içermeyen tüpler.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Doğru Kan Alma Tüpünün Seçimi▪ Kan alma tüpleri cam veya plastik materyalden üretilmektedir.

▪ Günümüzde güvenlik nedenlerinden dolayı plastik tüpler daha çok kullanılmaktadır.

▪ Kan örnekleri alınmadan önce tüp üzerindeki etiket bilgisi okunarak son kullanım tarihi kontrol edilmelidir ve süresi dolmuş tüpler kullanılmamalıdır.

▪ Plastik antikoagülan tüplerde ise ayrıca kanın ne kadar alınması gerekliliğini belirten tüp üzerindeki işaret belirlenmelidir.

▪ Son kullanım tarihi geçmiş ve/veya hatalı miktarda alınan kan sonuçları etkileyecektir ve klinik laboratuvarlarda sıkça karşılaşılan pre-analitik hatalardır.

!

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

KAN ALMA TEKNİKLERİ VE YOLLARI

▪ Büyük hayvanlarda, genellikle rutin hematolojik ve biyokimyasal testler için farklı büyük damarlardan kan alınması arasında büyük fark yoktur.

▪ Kemirgenler ve kedilerde farklı damarlardan alınan kan örneklerinden elde edilen sonuçlarda farklılık olabilir.

▪ İneklerde kuyruk damarlarından toplanan kan örnekler venöz ve arteryel kanın karışımı şeklinde olabilir ve bu da kan gazları ölçümünde etkili olabilir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

▪ Kedi ve köpeklerde kulak arkasından alınan örnekler, geniş damarlardan alınanlara göre farklılık göstermektedir.

▪ Doğru teknik ve materyal kullanılmazsa veya yanlış venipunktür tekniği uygulanması doku zedelenmesi, hematom oluşması, pıhtılaşma başlangıcının etkilenmesi, hemoliz ve enzim değerlerinde hatalı sonuçlara (artışlar) neden olabilir.

!

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

İDRAR ÖRNEKLERİ

▪ Hayvanlardan idrar alınması genellikle takip edilerek urinasyon sırasında hayvan sahibinin temiz bir kap içine toplaması ile yapılır (free-catch sampling).

▪ Örneğin alınacağı kap mutlaka steril idrar toplama kabı olmalıdır.

▪ Bakteriyolojik tetkikler uygulanacaksa katater veya sistosentez gibi aseptik teknikler kullanılmalıdır.

▪ Hayvanlarda spot idrar örneği toplanabilirken, 24 saatlik idrar örneği toplanması oldukça zordu.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

TÜKÜRÜK ÖRNEKLERİ▪ Veteriner rutinde kullanımı yaygın değildir.

▪ Kortizol gibi bazı parametrelerin ölçümü ve kedilerin lösemi (FeLV) tanısında kana alternatif olabilmektedir.

DIŞKI▪ Dışkının fiziksel ve kimyasal incelenmesi ile bazı metabolik ve patolojik

durumlar saptanabilir.

▪ Dışkı örneği temiz bir kap içine alınıp taze halde laboratuvara gönderilmelidir.

▪ Bunlara örnek olarak gizli kan, hazım fermentleri ve vahşi hayvanlarda endokrin belirteçler (hormonlar) verilebilir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

BEYİN-OMURİLİK SIVISI (BOS)

▪ İçerik olarak organik ve anorganik maddeleri seruma göre daha düşüktür. Proteinlerden oldukça fakirdir. Kana göre glikoz yaklaşık % 60, Ca ise % 50 oranında daha düşüktür.

▪ Kedi ve köpeklerde BOS örneğinin alındığı bölge önem arz etmektedir. Lumbal bölgeden alınan BOS’da, atlanto-oksipital bölgeden alınan göre protein konsantrasyonu iki kat daha fazladır.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

SİNOVİYAL SIVI

▪ Sinoviyal örneklerin alındığı eklem bölgesine göre kimyasal ve hücresel bileşenlerde farklılıklar görülebilir. Hatalı alım tekniğine bağlı olarak iatrogenik hemoraji görülebilir.

PERİTONAL SIVI

▪ Atlarda, protein analizi ve hücre sayımı laparotomi veya kastrasyon sonrası yükselebilir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

SICAKLIK▪ Genel olarak, örnekler oda sıcaklığında 2 saat

dayanıklıdır ve analiz sonuçları optimal düzeyde tespit edilebilir.

▪ Bilirubin gibi ışığa duyarlı analitler için de örnek, karanlık ortamda muhafaza edilmelidir.

▪ Tam kan ile çalışılacak hematolojik testlerde örneklerin dondurulmaması gereklidir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

SICAKLIK

▪ Uzun süre saklanması gerekiyorsa –20 ºC’ de muhafaza edilmelidir.

o Her bir test parametresinin dondurma işlemi ile ne kadar süre muhafaza edilebileceğinin bilinmelidir.

o Örneğin serumda albümin, -20º C’ de 2 ay muhafaza edilebilirken, plazma amonyak sadece 7 gün dayanıklıdır.

▪ İdrar ve dışkı örnekleri her zaman taze olarak laboratuvara ulaştırılmalı ve çalışmaya alınmalıdır.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

SANTRİFÜJ ▪ Ağırlıkları önemli derecede farklı olan maddelerin yer

çekimine bağlı olarak ayırım işlemi olup bu işlem için kullanılan aletlere santrifüj denir.

▪ Serum ve plazma ayırmak için santrifüj ekipmanı kullanılır, uygulanan kuvvet RCF (relatif santrifügal kuvvet) olarak ifade edilir ve yer çekimi kuvveti olan “g”’ nin çarpanları olarak verilir.

▪ Plazma ve serumun ayrılmasında önerilen santrifüj kuvveti ve süresi 1500-2000g x 10 dakikadır.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

SANTRİFÜJ

▪ RCF mi RPM mi ?

oRCF=1.118 x 10-5 x r x rmp2

▪ Sitolojik örneklerde hücre konsantrasyonunu artırmak ve hücre morfolojisini korumak için daha düşük g kuvveti kullanılır.

▪ İdrarda ise hücre ve kristaller sayıları ile hız arasında ilişki olmadığından dolayı 400-3900 g x 5 dakika kullanılabilir

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Kaynak: Kaneko ve ark., 2008

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

ANALİZ ÖNCESİ ÖRNEK KONTROLLERİ▪ Örnek kalitesi önemlidir ve mutlaka kontrol edilmelidir

▪ İlk önce transport koşulları değerlendirilir

▪ Hemoliz, lipemi, ikterus gibi durumların varlığına bakılır

▪ HEMOLİZ, eritrositlerin hücre zarının parçalanması sonucu hemoglobin molekülünün dışarıya çıkması olayıdır ve derecesine göre serum rengi pembeden kırmızıya kadar renk değişikliği göstermektedir. İnsan ve veteriner laboratuvarlarında pre-analitik sürece ait en sık gözlemlenen hata hemolizdir.

▪ Özellikle spektrofotometrik analizlerde hatalı sonuçlara neden olmaktadır.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Hemolitik İndeks

Kaynak: EclinPath

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Hemoliz İndeksi Hatalı Artma Hatalı Azalma

≥ 49 Direkt Bilirubin

≥ 80 Fe Direkt Bilirubin, Safra Asitleri

≥ 200 AST, Kolinesteraz, CK, Fe, LDH, K HCO3-, Direkt Bilirubin, Safra Asitleri

≥ 300AST, Kolinesteraz, CK, Fe, LDH, K,

P

HCO3-, Direkt Bilirubin, Safra Asitleri,

GGT

≥ 400

AST, Kolinesteraz, CK, Fe, LDH, K,

P, Mg, Total Protein, TrigliseritlerHCO3

-, Direkt Bilirubin,GGT, Safra

Asitleri, Amilaz

≥ 600

AST, Kolinesteraz, CK, Fe, LDH, K,

P, Mg, Total Protein, Trigliseritler,

Kolesterol

HCO3-, Direkt Bilirubin,GGT, Amilaz,

Safra Asitleri, ALP

≥ 800

AST, Kolinesteraz, CK, Fe, LDH, K,

P, Mg, Total Protein, Trigliseritler,

Kolesterol

HCO3-, Direkt Bilirubin,GGT, Amilaz,

Safra Asitleri, ALP, NEFA

Not: Türler arası farklar olabilir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

▪ LİPEMİ, serum veya plazmada lipidlerin normalin üstünde miktarlarda bulunması durumudur.

▪ Bu durum hiperlipidemili hastalarda veya tok karna örnek alınan hastalarda görülür. Lipemik serum ve plazmanın rengi beyazdan süt rengine kadar değişiklik göstermektedir. Lipemik örneklerle yapılan spektrofotometrik ölçümlerde hemolize benzer şekilde sapmalar meydana gelmektedir.

Kaynak: CLSI

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

Lipemik İndeksi Hatalı Artma Hatalı Azalma

≥ 50 Safra asitleri

≥ 100 Safra asitleri, direkt bilirubin Na, K, Cl

≥ 200 Safra asitleri, direkt bilirubin Na, K, Cl

≥ 500 Safra asitleri, direkt bilirubin, Mg Na, K, Cl, HCO3-

≥ 1000 Safra asitleri, direkt bilirubin, Mg, Amilaz Na, K, Cl, HCO3-

Not: Türler arası farklar olabilir. Trigliseritlerin konsantrasyonuna göre de değişebilir.

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

▪ İKTERİK serum veya plazma artan bilirubin konsantrasyonlarına bağlı olarak şekillenir ve biyokimyasal testlerde fotometrik ölçümlerde hatalı okumalar veya sapmalar olabilir.

İkterik İndeksi Hatalı Artma Hatalı Azalma

≥ 9 Kolesterol, Trigliseridler, Kreatinin, Safra Asitleri

≥ 19Kolesterol, Trigliseridler, Kreatinin, Safra Asitleri,

Total Protein

≥ 40 MgKolesterol, Trigliseridler, Kreatinin, Safra Asitleri,

Total Protein, GGT, Lipaz, Ürik Asit

≥ 55 MgKolesterol, Trigliseridler, Kreatinin, Safra Asitleri,

Total Protein, Lipaz, Ürik Asit, Amilaz

Not: Türler arası farklar olabilir.

Kaynak: Jashnani ve ark., 2012

Pre-Analitik Süreç – Teknik Faktörler

▪ Hematolojik tetkikler için EDTA veya heparinli tüplere alınan kanlarda en sık görülen hata, pıhtı varlığıdır. Hemolizle birlikte laboratuvarlarda en çok görülen örnek red nedenlerindedir.

▪ Pıhtılar gözle görülebilir düzeyde olabileceği gibi, dikkatli kontrol edildiğinde dahi gözden kaçabilen miktopıhtılar şeklinde de olabilir.

▪ Mikropıhtılar özellikle hücre sayımı ve pıhtılaşma faktörlerini etkileyebileceği gibi cihaz problarını tıkayarak da zaman kaybı ve ek harcamalara neden olabilmektedir.

▪ Mikropıhtılar ve mikroskopik trombosit kümeleri/yığınları özellikle kedi örneklerde sık görülür. Köpeklerde ise daha nadirdir.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪Biyolojik faktörler: Teknik faktörlere göre daha kapsamlı unsurlar barındırır.

▪Bunlar arasında aç/tokluk, stress, egzersiz, tür (bazen ırk), gebelik, cinsiyet, süt verimi, iklim, zapturapt ve çevresel koşullar gibi faktörler yer almaktadır.

▪ Biyolojik faktörlerin özellikle veteriner hekimliğinde kontrol altına alınması oldukça zordur.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ BESLENME

▪ İnsan hekimliğinde genel olarak bir gece açlık (12 saat) önerilmektedir.

▪ Benzer uygulama hayvanlar için de geçerlidir. Özellikle postprandial lipeminin engellenmesi ile bir çok analit için klinik olarak değerlendirilmeye elverişli sonuçlar alınabilir.

▪ Bu durum bazı monogastrik hayvanlarda (kedi ve köpek) uygulanabilmekte, ruminantlarda ise güç uygulanmakta veya uygulanamamaktadır (genellikle).

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ BESLENME

▪ Köpeklerde açlık üre veya trigliserid konsantrasyonları tokluk düzeylerinden düşük çıkabilir.

▪ Postprandial etki ile kanda glikoz konsantrasyonu, pankreatik enzimler, safra asitleri, insulin gibi analitlerin düzeyleri değişiklik göstermektedir.

▪ Yeni doğanlarda, kolostrum nedeniyle serum total protein, immunoglobulin düzeyleri ile ALP ve GGT aktiviteleri yetişkinlere göre oldukça yüksektir.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ STRES

▪ Akut durumlarda adrenomedullar veya subakut, kronik durumlarda kortikal hücreleri aktive etmek süretiyle ortaya çıkan bir durum olarak tanımlanabilir.

▪ Bireysel farklılıklar veya türlere bağlı olarak ulaşım, zaptı-rapt ve çevre gibi faktörler birer stres kaynağıdır.

▪ Kedilerde stresli bir kan alımı hiperglisemiye (450 mg/dl ye kadar) ve lenfositoza neden olabilir.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ STRES

▪ Köpeklerde ulaşım stresine bağlı olarak ALP aktiviteleri artış gösterebilir, yine strese bağlı hiperglisemi görülebilir.

▪ Sığırlarda fiziksel yorgunluk, susuzluk, kötü beslenme gibi etkiler ulaşım ile birleşince ortaya çıkan stres nedeniyle glikokortikoid düzeyleri yükselir ve lökositozgörülür.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ İLAÇ ETKİLERİ

▪ İlaçlar veya metabolitleri, analitleri etkileyebilmektedir.

▪ Örneğin adrenokortikoid uyarıcılar ALP aktivitesinde yükselişe neden olurlar.

▪ Hayvanlarda glikokortikoid ve nonsteroidal anti-inflamatuvar ilaçların etkileri araştırılmış ve hem hematolojik (örneğin lökositoz) hem de biyokimyasal değişimler (örneğin artan ALP aktivitesi) bildirilmiştir.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ BİYOLOJİK RİTİMLER

▪ Üreme döngüleri de dahil olmak üzere biyolojik ritimler veya hormonal siklüslara bağlı olarak analitler değişkenlik gösterebilir.

▪ Yine belirli bir analitin sirkadyen ritimleri türlere göre farklılık gösterebilir. o İnsan, maymun ve ratlarda kortizol düzeyleri sabah daha yüksek

iken, çelişkili olarak bazı kaynaklarda köpeklerde neredeyse hiçbir değişiklik olmadığı, bazılarında ise özellikle gruplar halinde yaşayan köpeklerde değişimler olabileceği bildirilmektedir.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ YAŞ VE CİNSİYET

▪ Yaş ve cinsiyete bağlı fizyolojik varyasyonlar nedeniyle serum biyokimyasında değişimler gözlenebilir.

▪ Köpeklerde yapılan çalışmalarda bazı hematolojik ve biyokimyasal parametrelerin yaşa bağlı olarak önemli düzeyde değiştiği, cinsiyete bağlı olarak ise serum fosfor ve Ca/P oranının farklı olduğu bildirilmiştir.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

▪ EGZERSİZ

▪ Fiziksel eforun tipine ve yoğunluğuna bağlı olarak farklı etkiler görülebilir.

▪ Özellikle düzenli olarak egzersiz yapan yarış atları ve köpeklerinde yapılan çalışmalarda yüksek hematokrit, c-reaktif protein (CRP), laktat ve potasyum ile amonyakkonsantrasyonu gibi hematolojik ve biyokimyasal değişimler görülmüştür.

▪ Özellikle yoğun fiziksel aktivite sonrası örnek almadan önce hayvan dinlendirilmelidir.

Pre-Analitik Süreç – Biyolojik Faktörler

Pre-analitik sürece etki eden faktörler laboratuvar analizlerini direkt olarak etkilemektedir.

Bu faktörleri tamamen kontrol etmek imkansızdır.

Önemli olan kontrol altında tutarak, asgari seviyeye çekebilmektedir.

Analitik SüreçMETOT SEÇİMİ (ANALİZ YÖNTEMLERİ), METOT GEÇERLİLİĞİ, KALİTE KONTROL, ANALİTİK CİHAZLAR ve ÇALIŞMA PRENSİPLERİ

Analitik Süreç

▪ Örneklerin çalışıldığı ve sonuçların elde edildiği süreçtir.

▪Süreç içerisinde;

▪ Örneklerin analize hazırlanması,

▪ Cihazların hazırlanması,

▪ Reaktifler/kimyasalların hazırlanması/kontrolü

▪ Kalibrasyonlar,

▪ İç kalite kontoller (Dış kalite kontroller ?),

▪ Analiz takibi,

▪ Sonuçların elde edilmesi,

▪ Kontrolü (gerekirse tekrarı) ve uzman onayı yer almaktadır.

Analitik Süreç

1. KALİTATİF YÖNTEMLER

2. KANTİTATİF YÖNTEMLERi. Kolorimetrik/Fotometrik yöntemler

• (metabolitler ve enzimler)

ii. Potansiyometrik yöntemler

• (Mineral iyonlar ve gazlar)

iii. İmmunolojik yöntemler

•RIA, ELISA, IFA..... (Hormonlar, vitaminler vb)

Analitik Süreç

▪ İncelenecek maddelere göre klinik biyokimyasal analizler

1. Metabolitlerin miktar tayini

2. Enzimlerin aktivitelerinin tayini

3. Vitaminlerin miktar tayini

4. Hormonların miktar tayini

5. Dinamik testleri

Analitik Süreç

▪ Kullanılan reaktiflere göre klinik biyokimyasal analizler

1. Hazırlanacak reaktiflerle yapılanlar

2. Hazır reaktifler ve kitlerle yapılanlar

3. Ayıraçlı şeritler ya da daldırma çubukları (dipstick) ile yapılanlar

▪ Elle işleme ve otomatlaşma gereksinimine göre klinik biyokimyasal analizler

1. Manuel analizler. Elle işlenen metodlar

2. Otomatik sistemlerle yapılan analizler

Analitik Süreç

▪Kolorimetrik-Fotometrik Yöntemler▪ Renk oluşum doğrudan madde konsantrasyonu ile ilişkilidir.

Diğer bir ifade ile ışığı absorbe eden renk, maddenin kendisinin rengi ile yani konsantrasyonu ile ilgilidir.

▪ Fotometreler, kolorimetreler ve spektrofotometreler bu prensibe göre çalışırlar.

▪ Başta metabolitler olmak üzere geniş kullanım alanı vardır.

Analitik Süreç

▪KOLORİMETRİ, renk ölçülmesi esasına dayanan miktar tayin yöntemidir. Bir çözeltide konsantrasyonu belli olmayan bir madde tarafından oluşturulan rengin aynı maddenin bilinen konsantrasyondaki çözeltisinin rengi ile karşılaştırılması suretiyle konsantrasyon tayinidir.

▪FOTOMETRİ, belirli bir spektrumdaki ışık şiddetinin ölçülmesine dayanan miktar tayin yöntemleridir.

Analitik Süreç

▪SPEKTROFOTOMETRİ, ışık kaynağı ile prizma arasına yerleştirilen renkli maddenin ışık spektrumunun bazı renklerini absorplaması ve konsantrasyona göre spektrumda zayıf veya kuvvetli bant göstermesi özelliğine dayanan miktar tayin yöntemidir.

Analitik Süreç

▪Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.

Analitik Süreç

Kaynak: Wiki

Beer-Lambert YasasıBir çözeltiden geçen ışık miktarı,

ışığın çözelti içinde katettiği yol ve

çözelti konsantrasyonu ile logaritmik

olarak ters orantılı, absorplanan ışık

miktarı ise doğru orantılıdır.

Transmittens (T) = I/I0Absorbans (A) = -log (T)

A = εcl

εcl = -log (T)ε: Molar absorbsiyon katsayısı (L/mol/cm)

C: Çözelti konsantrasyonu (mol/L)

l: Işığın çözelti içinde kattettiği yol (cm)

Analitik Süreç

Analitik Süreç

Kaynak: ChemWiki.UC.Davis

Analitik Süreç

Analitik Süreç

Analitik Süreç

Spekttrofotometre Animasyon: Youtube

Analitik Süreç

▪Potansiyometrik Yöntemler▪ Miktarı belirlenecek maddenin spesifik seçici

elektrotlarının kullanımı esasına dayanır.

▪ Analiz edilecek sıvıya daldırılan bir elektrot ve referans sıvıyı içeren bir elektrot arasında ölçülen potansiyel fark bu maddenin konsantrasyonu ile orantılıdır.

▪ Sıklıkla mineral iyonlar ve gazların ölçümünde kullanılır.

Analitik Süreç

▪ ISE (İYON SEÇİCİ

ELEKTROTLAR/ELEKTROKEMİSTRİ)

▪ Özel elektrotlar yardımı ile numunelerde iyon farkının bir membranda (zarda) meydana getirdiği potansiyel farkının ölçülmesine dayanan analiz yöntemidir. Ölçülen her bir element için ayrı bir elektrot vardır.

Kaynak: AOB Lab

Analitik Süreç

▪ELEKTROFOREZ▪ Asit ortamda katyon

olarak bazik ortamda ise anyon olarak davranan maddelerin elektrik alanda farklı hızlarda göçme özelliklerine dayanan miktar tayin ve ayırma yöntemidir.

Analitik Süreç

Analitik Süreç

▪KROMATOGRAFİ▪ Porlu ortamda hareketli

bir çözücü içinde, solütlerin farklı hızlarda göçme özelliklerine dayanan miktar tayin ve ayırma yöntemidir.

Kağıt KromatografiKağıt Kromatografi

HPLC

Analitik Süreç

▪ İmmunolojik Metotlar▪ RIA, ELISA, FIA, ECLIA, IFA

gibi...

▪ Hormon ve vitamin analizlerinde başlıca uygulanır.

Post-Analitik SüreçSONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ, REFERANS DEĞER, RAPORLAMA

Post-Analitik Süreç

▪Analiz sonuçlarının;

▪ Kalite kontrol kriterlerine göre değerlendirildiği,

▪ Ölçüm birimi ve referans değerlerin gözden geçirildiği,

▪ Analiz raporunun oluşturulduğu,

▪ Son kontrollorun yapıldığı ve,

▪ Hasta sahibi veya veteriner hekime ulaştırıldığı aşamadır.

Kaynaklar

▪ eClinPath: www.eclinpath.com

▪ Hooijberg E, Leidinger E, Freeman KP. An error management system in a veterinary clinical laboratory. J Vet Diagn Invest. 2012; 24: 458–468.

▪ Jashnani KD, Karwande A, Puranik G. Icteric donor plasma: To transfuse or to discard?. Indian J Pathol Microbiol 2012;55:604-5

▪ Karagül H, Altıntaş A, Fidancı UR, Sel T, 2000. Klinik Biyokimya. Medisan, Ankara

▪ Kaneko JJ, Harvey JW, Bruss ML, 2008. Clinical Biochemistry of Domestic Animals, 6th edi. Academic Press-Elsevier

▪ Pineda MH, Dooley MP, 2003. McDonald’s Veterinary Endocrinology and Reproduction, 5th edi. Blackwell Publishing.

▪ Thrall MA, Weiser G, Allison RW, Campbell TW, 2012. Veterinary Hematology and Clinical Biochemistry, 2nd edi. Wiley-Blackwell

Sorularınız ?

Bir sonraki konu;

Su-Elektrolit Dengesi

Biyokimya & Klinik Biyokimya

ve Laboratuvar dünyası hakkında daha

fazlası için

www.biyokimya.vet

@biyokimya.vet