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CELTON PEREIRA DE MOURA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO, ANTICOAGULANTE E HEMORRÁGICO DE HEPARINÓIDES
PRESENTES EM Artemia franciscana
NATAL 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
CELTON PEREIRA DE MOURA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO, ANTICOAGULANTE E HEMORRÁGICO DE HEPARINÓIDES
PRESENTES EM Artemia franciscana
Dissertação de mestrado apresentada ao Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Dra. Suely Ferreira Chavante
Co-orientadora: Dra. Edda Lisboa Leite
NATAL 2004
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Moura, Celton Pereira de. Avaliação do potencial antiinflamatório, anticoagulante ehemorrágico de hiperinóides presentes em Artemia franciscana/CeltonPereira de Moura. – Natal, RN, 2004.
73 f.
Orientadora: Suely Ferreira Chavante. Co-orientadora: Edda Lisboa Leite.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande doNorte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação emBioquímica.
1. Proteínas – Dissertação. 2. Heparinóides – Artemia franciscana –Dissertação. 3. Heparinóides – Propriedades antinflamatórias –Dissertação. 4. Heparinóides – Propriedades anticoagulantes –Dissertação. 5. Heparinóides – Propriedades hemorrágicas – Dissertação.I. Chavante, Suely Ferreira. II. Leite, Edda Lisboa. III. UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BCZM CDU 577.112 (043.3)
Dedico este trabalho
A minha família, em especial a minha avó Marina, e a todos que sempre com
carinho, dedicação e muita paciência, souberam me orientar, apoiar e incentivar em
cada momento de minha vida acadêmica.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me concedido este momento de estudo e trabalho com meus amigos.
Aos meus pais Josué Alves de Moura e Maria do Socorro Pereira de Moura por terem me apoiado e incentivado em todos os momentos de minha vida, juntamente
com minha irmã Tasia Pereira de Moura..
A minha família, por ter me dado a base e a segurança que todos nós precisamos, apoiando-me em todos os sentidos de minha vida, seja ela profissional ou pessoal.
Aos meus amigos Biólogos e em especial: Ana Viviane que me incentivou e estudou junto comigo, Adriana a quem eu tenho muita admiração por ser uma verdadeira
amiga, Vanessa por ter me ensinado no início do trabalho na bancada, Cybelle pela paciência. À Beth, por me mostrar que coragem e espiritualidade andam lado a lado, Janice (farmacêutica) pelos momentos de descontração que muito me ajudaram no
decorrer de meu trabalho. Todos contribuindo sempre com ações e palavras amigas, agradeço-os de coração.
Aos Professores : Elizeu , Hugo, Luiz, Maurício, Fernanda, Selma, João Felipe, Dilma e Jacira, meu muito obrigado pelos conhecimento transmitidos durante esta
minha vida acadêmica . Saúde e sucesso sempre para todos vocês! Agradeço, também, à professora Aurigena pela grande ajuda no tratamento dos dados
estatísticos.
Em especial, Suely Ferreira Chavante por ter me aceito como seu orientando e trabalhado comigo no Departamento de Bioquimica e a professora Edda Lisboa Leite por ter me auxiliado e me orientado no final de meu trabalho; uma pessoa a
quem eu tenho profundo respeito e admiração pela coragem e disposição em estar sempre pronta a ajudar.
À equipe da Universidade Potiguar (UNP), pelo auxílio no fornecimento de material biológico para realização deste trabalho, meus agradecimentos.
À Eliene, pessoa muito amiga, muito humana, você sabe ser feliz, tenho satisfação em ser seu amigo.
À Michelle tenho admiração pela responsabilidade do seu trabalho, mostrando que os jovens são capazes e competentes.
À Creuza e Mônica agradeço pela confiança e por estarem sempre prontas a ajudar.
Marcos, Itamar e Jonas agradeço-lhes a amizade e a confiança.
Aos Amigos do Departamento de Bioquímica do dia a dia que conheci durante estes dois anos : Taciana, Celina, Valquiria, Guiliana, Dácio, Rodolfo, Glória, Carlos,
Raniere, Roseane, Karla, Luciana e Ivan, um forte abraço
À Margarita, nova secretária do Programa de Pós Graduação em Bioquímica, às professoras Selma e Dilma, Coordenadora e Vice-coordenadora do Programa, meu
reconhecimento pelo bom trabalho e obrigado por tudo.
Aos órgãos financiadores CNPq e CAPES que tornaram possível a realização deste trabalho.
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Moura, Celton Pereira de. Avaliação do potencial anti-inflamatório, anticoagulante e hemorrágico de heparinóides presentes em Artemia franciscana / Celton Pereira de Moura. – Natal, RN, 2004. 73 f. : il.
Orientadora : Suely Ferreira Chavante. Co-orientadora : Edda Lisboa Leite.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Departamento de Bioquímica.
1. Heparina – Tese. 2. Heparinóides – Propriedades anti-
inflamátoria - Tese. 3. Artemia – Tese. 4. Crustáceos – Tese. 5 Atividade hemorrágica – Tese. I. Chavante, Suely Ferreira. II. Leite, Edda Lisboa. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 577.112 (043.2)
RESUMO
Heparam sulfato (HS) e Heparina (Hep) são glicosaminoglicanos
(GAGs), heterogêneos e altamente polianiônicos. HS é estruturalmente
relacionado a heparina, mas contém uma quantidade menor de grupos
sulfatados que a Hep. Devido às similaridades estruturais entre estes dois
polímeros, eles têm sido denominados conjuntamente de heparinóides. Ambas
as cadeias ligam-se a uma variedade de proteínas mediadas por vários
processos fisiológicos importantes, incluindo a coagulação sanguínea, adesão
celular e regulação dos fatores de crescimento. O presente estudo descreve a
presença de uma população de heparinóides (F-3.0M) diferenciados presentes
em Artemia franciscana os quais foram isolados por proteólise e fracionados
por cromatografia de troca iônica com variadas concentrações de NaCl. Neste
trabalho, utilizamos modelos “in vivo” para avaliar a homeostasia e a atividade
anti-inflamatória destes heparinoides. A hemostasia foi avaliada por modelo de
escarificação em caudas de ratos Wistar enquanto que o processo inflamatório
foi observado através de peritonite induzida por tioglicolato de sódio a 3%. Os
heparinóides eluidos com 3,0M de NaCl mostraram por eletroforese em
diversos tampões uma única banda com comportamento intermediário entre a
Hep de mamífero e HS. O principal produto obtido da fração F-3.0M de Artemia
franciscana após a degradação enzimática com heparitinases I e II de Flavo
bacterium Heparinum foram dissacarídeos N-sulfatados (�U-GlcNS,6S/
�U,2S-GlcNS e ∆U-GlcNS) e dissacarídeos N-acetilados (∆U, GlcNAc). Estes
heparinóides apresentaram uma baixa atividade hemorrágica somente na
concentração de 400µg/ml, é similar a heparina na concentração de 25µg/ml.
Os resultados sugerem ainda, que esta fração tem baixa ação anticoagulante
APTT (62,2s); não apresentando ação sobre PT, indicando que não tem ação
sobre a via extrínseca da cascata. Os testes de atividade anti-inflamatória,
desta fração tem efeito inibitório sobre a migração dos leucócitos da ordem de
64,5% na concentração de 10 µg/ml (P<0.001).
Palavras Chaves: Heparinóides . Artemia. Coagulação . Anti- inflamatório.
ABSTRACT
Heparan sulfate (HS) and Heparin (Hep) glycosaminoglycans (GAGs) are
heterogeneous and highly charged polysaccharides. HS is structurally related to Hep but is
much less substituted with sulfo groups than heparin and has a more varied structure (or
sequence). Because of structural similiarities between these two polymers, they have been
described together as “heparinoids”. Both chains bind a variety of proteins and mediate
various physiologically important processes including, blood coagulation, cell adhesion
and growth factor regulation. Heparinoids with structural characteristics similar to these
described from HS and/or Hep from mammalian tissues have been isolated from different
species of invertebrates, although only a few heparinoids from unusual sources have been
characterized. The present study describes the presence of unusual heparinoids
population from Artemia franciscana, isolated after proteolysis and fractionation by ion
exchange resin and named, F-3.0M. The study model “in vivo” were hemostasis (rat tail
scarification) and inflamatoty activity. The tests “in vitro” were used for coagulations
assays (PT and APTT). The analyse of the heparinoids eluted with 3,0M NaCl showed
electrophoretic migration in different buffer systems a single band with a behaviour
intermediate between those of mammalian HEP and HS. The main products obtained from
Artemia heparinoids after enzymatic degradation with heparitinases I and II from F.
heparinum were N-sulphated disaccharides (∆U-GlcNS,6S/ ∆U,2S-GlcNS and ∆U-
GlcNS) and N-acetylated disaccharides (∆U, GlcNAc). This heparinoid had a lower
hemorrhagic effect (400µg/ml) when compared to unfractiionated heparins(25µg/ml).The
results also suggest a negligible APTT activity of this heparinoid (62.2s). No action was
observed on PT indicating that F-3.0M haven’t action on the extrinsic pathway. The results
showed that the fraction F- 3.0M have inhibitory effect on migration of leukocytes, 64.5% in
the concentration of 10 µg/ml (P<0.001). The search for new heparin and/or heparan
sulphates analogs devoid of anticoagulant activity is an atractive alternative and may open
up a wide variety of new therapeutic applications.
Key Words : Heparinoids. Artemia. Coagulation. Anti-inflamatory.
LISTA DE TABELAS:
Tabela 1 - Principais diferenças entre heparina e heparam sulfato.................... 05
Tabela 2 - Relação molar dos componentes haparina e heparam sulfato de F-
3,0M de Artemia franciscana ............................................................ 44
Tabela 3 - Relação molar dos constituintes das frações de GAGS de Artemia
franciscana ....................................................................................... 51
LISTA DE ILUSTRAÇÕES:
Figura 1 - Principal unidade dissacarídica de repatição da heparina ................ 05
Figura 2 - Esquema de distribuição filogenética dos GAGS em Invertebrados . 07
Figura 3 - Esquema da Cascata de Coagulação ............................................... 12
Figura 4 - Interação da heparina não fracionada com a antitrombina ............... 14
Figura 5 - Rolamento de Leucócitos e distribuição celular das moléculas de
adesão (TIBS) ................................................................................. 20
Figura 6 - Crustáceos da espécie Artemia franciscana utilizado neste estudo.. 24
Figura 7 - Esquema de extração e fracionamento dos heparinóides de Artemia
franciscana ........................................................................................ 31
Figura 8 - Esquema de fracionamento da fração F-3,0M de por Artemia
franciscana precipitações crescentes em acetona ............................ 32
Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose da F-3,0M de Artemia franciscana em
diversos sistemas de tampões .......................................................... 43
Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0.05 pH 9,0 dos
polissacarídeos de Artemia franciscana após fracionamento com
acetona ............................................................................................. 47
Figura 11 - Eletroforese em gel de agarose em tampão Tris-acetato das frações
de Artemia franciscana obtidas após fracionamento com acetona ... 48
Figura 12 - Eletroforese em gel de agarose no sistema Ba/PDA das frações
obtidas após tratamento da F-3,0 com acetona ................................ 49
Figura 13 - Caracterizaçcão da fração F-3,0M de Artemia franciscana pelas
enzimas HEPARITINASE I e HEPARITINASE II ............................. 54
Figura 14 - Caracterizaçcão das sub frações F-3,0M de Artemia franciscana pelas
enzimas HEPARITINASE I e HEPARITINASE II ............................. 55
Figura 15 - Avaliação da atividade anticoagulante pelo teste de tromboplastina
parcial ativada (APTT) in vitro da fração F-3,0 de Artemia franciscana,
haparam sulfato e de heparina padrão bovina ................................ 57
Figura 16 - Ação anticoagulante, tempo de protrombina (PT) da heparina padrão
bovina, heparam sulfato e fração F-3,0 de Artemia franciscana ...... 58
Figura 17 - Efeito hemorrágico de F-3,0M de Artemia e da heparina de pulmão
bovino padrão .................................................................................. 59
Figura 18 - Efeito da fração heparina padrão na migração de leucócitos em ratos
Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio ................. 62
Figura 19 - Efeito da heparina desaminada na migração de leucócitos em ratos
Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio .................. 63
Figura 20 - Efeito da fração F-3,0M de Artemia franciscana na migração de
leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de
sódio ................................................................................................ 64
LISTA DE ABREVIATURAS:
aPTT tromboplastina pacial ativada
CETAVLON brometo de cetiltrimetilamonio
CS condroitim sulfato
Da Dalton
DS dermatam sulfato
g gravidade
Glc AU ácido glucurônico
Hep Heparina
HepDEA Heparina desaminada
HNF Heparina não fracionada
HBPM Heparina de baixo peso molecular
HS Heparam sulfato
IL interleucina
nm nanômetro
PDA 1,3 diaminopropano
rpm rotações por minuto
PT tempo de protrombina
TNFα Fator de Necrose Tumoral alfa
V volume
∆ Di-4S Dissacarídeo insaturado 4 sulfatado
∆ Di-6S Dissacarídeo insaturado 6 sulfatado
∆ presença de insaturação
∆U- GlcNS, 6S: O-ácido α-D-glico(enopiranosilurônico)-(1-4)-2-desoxi-2-sulfamino-
D-glicopiranose 6-O-sulfato (dissacarídeo insaturado dissulfatado).
∆U- GlcNS: O-ácido α-D-glico (enopiranosilurônico)-(1-4)-2-desoxi-2-sulfamino-D-
glicopiranose (dissacarídeo insaturado N-sulfatado).
∆U- GlcNAc: O-ácido α-D-glico (enopiranosilurônico)-(1-4)-2-desoxi-2-acetamido-
D-glicopiranose (dissacarídeo insaturado N-acetilado).
Ditri: Dissacarídeo trisulfatado.
Didi: Dissacarídeo disulfatado.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 15
1.1 GLICOSAMINOGLICANOS 15
1.2 HEPARINÓIDES 16
1.3 HEPARINÓIDES EM INVERTEBRADOS 19
1.4 AÇÕES BIOLÓGICA E FARMACOLÓGICA DOS HEPARINÓIDES 22
1.5 CASCATA DE COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA 24
1.6 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 27
1.7 HEPARINAS NÃO FRACIONADAS (HNF) E HEPARINAS DE BAIXO PESO
MOLECULAR (HBPM) 29
1.8 RESPOSTA INFLAMATÓRIA 31
1.8.1 Princípios da Resposta Inflamatória 31
1.9 PROPRIEDADE ANTIINFLAMATÓRIA DOS HEPARINÓIDES 34
2 OBJETIVOS 37
3 MATERIAIS E MÉTODOS 38
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO 38
3.1.2 Artemia franciscana 39
3.1.2 Enzimas 39
3.1.3 Animais utilizados nos ensaios in vivo 39
3.2 PADRÕES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS UTILIZADOS COMO
REFERÊNCIA DE MOBILIDADE ELETROFORÉTICA 40
3.2.1 Monossacarídeos 41
3.2.2 Outros Materiais 41
3.3 APARELHOS 42
3.4 MÉTODOS 43
3.4.1 Extração dos Polissacarídeos Sulfatados de Artemia franciscana 43
3.4.2 Fracionamento dos Heparinóides com diferentes concentrações de
Acetona 44
3.4.3 Eletroforese em Gel de Agarose 47
3.4.4 Sistema 1,3 - diaminopropano acetato (PDA) 48
3.4.5 Sistema Descontínuo Acetato de Bário/PDA 48
3.4.6 Sistema Tris-acetato 49
3.5 DEGRADAÇÕES ENZIMÁTICAS 49
3.6 CROMATOGRAFIAS EM PAPEL 50
3.7 ANÁLISES QUÍMICAS 50
3.8 PERITONITE INDUZIDA POS TIOGLICOLATO DE SÓDIO 51
3.9 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 52
3.10 ATIVIDADE HEMORRÁGICA 53
3.11 MÉTODOS ESTATÍSTICOS 55
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 56
4.1 ELETROFORESE DA FRAÇÃO F - 3,0M 56
4.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA F - 3,0M DE ARTEMIA FRANCISCANA 58
4.3 FRACIONAMENTO DA F- 3,0M EM ACETONA 59
4.4 COMPORTAMENTO ELETROFORÉTICO DAS SUB FRAÇÕES DE
ARTEMIA FRANCISCANA PROVENIENTE DO FRACIONAMENTO COM
ACETONA 60
4.5 DOSAGENS QUÍMICAS E CROMATOGRAFIA EM PAPEL DAS
FRAÇÕES 64
4.6 CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FRAÇÕES
DE ARTEMIA FRANCISCANA 65
4.6.1 Por Degradação Enzimática 65
4.6.2 Efeito in vitro dos Heparinóides de Artemia franciscana na
coagulação sangüínea 70
4.6.3 Atividade Hemorrágica 72
4.6.4 Efeito da Fração F - 3,0M no Processo Inflamatório 73
5 CONCLUSÕES 80
REFERÊNCIAS 81
APÊNDICE 88
Introdução 15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Glicosaminoglicanos
Os glicosaminoglicanos sulfatados (GAGS) são um conjunto de
macromoléculas que estão amplamente distribuídas em todos os filos de animais
que apresentam organização tissular (DIETRICH et al., 1983). Estes compostos
são polissacarídeos não ramificados constituídos por resíduos alternados de ácido
urônico e de hexosamina cuja estrutura básica é formada por unidades
dissacarídicas repetitivas de D-glucurônico ou L-idurônico unidas através de
ligações glicosídicas a D-glucosamina ou D-galactosamina ou seus derivados
acetilados. Estes açúcares apresentam ainda, grupos sulfatos que juntos com os
grupos carboxilas do ácido urônico conferem a estas moléculas características
polianiônicas. Os pontos mais relevantes da estrutura dos GAGS dizem respeito
ao grau de sulfatação e as proporções de tipos de dissacarídeos constituintes
fortes indicativos de sua grande heterogeneidade estrutural (CONRAD, 1998).
Os glicosaminoglicanos desempenham inúmeras funções essenciais ao
organismo e dentre elas pode-se citar: resistência a infecções, auxílio no controle
da divisão celular, reconhecimento e adesão celular, lubrificação das articulações,
etc. (NADER & DIETRICH, 1989; DIETRICH, 1984; ESKO 1991). Estas funções
variam de acordo com as particularidades estruturais destes compostos e com o
tipo de tecido onde estão presentes.
Introdução 16
De uma forma geral, podemos afirmar que a grande maioria dos
glicosaminoglicanos está associada às proteínas formando os proteoglicanos.
Tendo-se como principal exceção o ácido hialurônico, glicosaminoglicano não
sulfatado, presente nos tecidos sob a forma de cadeia exclusivamente
polissacarídica. O condroitim sulfato, dermatam sulfato, heparina e heparam
sulfato apresentam-se ligados covalentemente ao esqueleto protéico através da
unidade tetrassacarídica glucuronil-galactosil-galactosil-xilose. A extremidade não
redutora do glicosaminoglicano é livre e a outra extremidade encontra-se unida
por meio de uma ligação do tipo O-glicosídica a um resíduo de L-serina ou L-
treonina do esqueleto protéico. Diferentemente o queratam sulfato encontra-se N-
ligado a uma glicoproteína. (FRANSSON, 1983; POOLE, 1986; RODÉN &
SCHWARTZ, 1975).
1.2 Heparinóides
Tanto heparina como heparam sulfato são glicosaminoglicanos sulfatados
formados por unidades alternadas de ácido urônico e glucosamina, unidos por
ligações glicosídicas α-1,4 ou β-1,4. Estes dois polímeros são misturas de
compostos polidispersos, estruturalmente similares e são denominados
conjuntamente de heparinóides (CASU, 1989; CONRAD, 1998;).
Os blocos constitutivos dos heparinóides, apresentam unidades
dissacarídicas, em que o resíduo de ácido urônico, pode ser do tipo β-D-
Introdução 17
glucurônico (GlcA) ou α-L-idurônico (IdoA), que podem ou não estar sulfatados na
posição 2 (GlcA-2S ou IdoA-2S). Os resíduos de α-D-glucosamina podem ser N-
sulfatados (GlcNS) ou N-acetilados (GlcNAc). Há ainda, a possibilidade dos
resíduos de GlcNS serem O-sulfatados em C3 ou C6, ou ainda em ambos C3 e
C6; enquanto os resíduos de GlcNAc podem ser O-sulfatados em C-6.
Considerando-se que cada unidade dissacarídica apresenta um dos 4 possíveis
resíduos de ácido urônico (GlcA, GlcA-2S, IdoA ou IdoA-2S) ligado a um dos 6
resíduos de glucosamina (GlcNS, GlcNS,6-OS, GlcNS-3S, GlcNS-3,6diS, GlcNAc
ou GlcNAc, 6S) existe ainda, uma enorme possibilidade de combinações entre
esses monômeros, o que justificaria a heterogeneidade estrutural apresentada
pelas cadeias de heparina e de heparam sulfato (CASU, 1985; CXHARLE &
SCOTT, 1993). Na figura 1 temos a principal unidade dissacarídica da heparina.
Essa grande variabilidade dificulta uma definição estrutural mais precisa de
heparam sulfato e heparina; embora, muitos critérios estejam sendo usados para
distingui-los. Assim, admite-se que a diferença estrutural entre heparina e
heparam sulfato seja, essencialmente, quantitativa com pouca ou nenhuma
distinção qualitativa. Em geral, a heparina contém mais ácido idurônico e mais
glic-N-sulfato, e menos N-acetil e ácido glucurônico do que o heparam sulfato.
Outro modo de se distinguir heparina de heparam sulfato, está na sua
suscetibilidade a enzimas heparinases e heparitinases que são liases extraídas de
Flavobacterium heparinum (CONRAD, 1998). Na tabela 1 estão relacionadas as
diferenças principais entre estes dois compostos.
Introdução 18
Figura 1- Principal unidade dissacarídica de repetição da heparina.
As heparinas têm mais altas relações IdoaA/ GlcA do que as encontradas
nos heparam sulfatos e contêm elevados teores de dissacarídeos altamente
sulfatados. Entretanto, a distinção entre estes dois polímeros é muito mais
complexa que esta diferença. Diversas pesquisas têm estabelecido algumas
formas para se distinguir heparina de heparan sulfato
Casu, 1989 sugeriram que o termo heparina deve ser restrito a um
heparinóide em que mais de 80% dos resíduos de GlcN são N-sulfatados e o
número de O-sulfatos são maiores que o número de N-sulfatos. Por outro lado,
todos os outros heparinóides podem ser referidos como heparam sulfato. Já
segundo Gallagher et al; 1989, todo heparam sulfato tem cerca de 50% de seus
resíduos GlcN N- sulfatados e uma razão de O-sulfato para N-sulfato igual ou
menor que 1. Entretanto, na opinião de Nader e Dietrich 1989, heparam sulfato e
heparina são distinguíveis por meio de uma combinação de suas propriedades
físicas e biológicas.
Tabela 1. Principais diferenças entre heparina e heparam sulfato.
Introdução 19
Características Heparam
sulfato
Heparina
Solubilidade em acetato de potássio 2 M (pH 5,7; 4°C)
sim
não
Tamanho 10 70 kD 10 12 kD
Relação Sulfato/hexosamina 0,8 1,8 1,8 2,4
GlcN NS 40 60% 85%
Conteúdo de IdoA 30 50% 70%
Ligação com a antitrombina 0 0,3% ~30%
Sítio de síntese Virtualmente em todas as células
mastócitos
Fonte : Jeffrey Esko e Varki, 1998.
1.3 Heparinóides em Invertebrados
O primeiro relato de um heparinóide em invertebrados foi feito por Thomas
em 1951. Este autor, empregando o método clássico de Charles & Scott (1933)
para a extração de GAGs, obteve em tecidos de molusco Spisula solidissima um
composto ácido que continha uma considerável atividade anticoagulante.
Subseqüentemente, com a realização de novos estudos foram consideradas, cada
vez mais, as semelhanças de compostos polianiônicos extraídos dos moluscos
com a heparina de mamífero e outros glicosaminoglicanos.
Introdução 20
O primeiro trabalho envolvendo uma metodologia mais específica para a
pesquisa de GAGS, inclusive com utilização das liases de F. heparinum, foi
realizado por CÁSSARO & DIETRICH, 1977. Neste trabalho, os autores relataram
a ocorrência de heparina em um grande número de espécies principalmente em
moluscos e crustáceos.
Posteriormente, Dietrich et al., 1985 e 1989 demonstraram a presença de
heparina nos extratos do molusco Anomalocardia brasiliana. A caracterização
deste composto envolvia análise de sua composição química, propriedades físico-
químicas, atividades farmacológicas e, especialmente, a susceptibilidade para as
enzimas heparinase e heparitinase II de Flavobacterium heparinum, bem como, os
produtos por elas formados (NADER et al,1999). Comparativamente, a heparina
desse molusco apresentou-se semelhante à de mamíferos, mostrando apenas
algumas variações quantitativas, como a alta atividade anticoagulante (320
U.I./mg), alto peso molecular (27-43 kDa) e maior grau de afinidade pela
antitrombina, assemelhando-se a heparina de mucosa intestinal bovina. A
presença de heparina neste molusco despertou a busca deste composto em
outros moluscos tais como: Donax striatus e Tivela mactroides. Além da
abordagem experimental já citada foi utilizada espectroscopia de ressonância
magnética nuclear, concluindo-se, mais uma vez, que a heparina de invertebrados
é virtualmente indistinguível da heparina de vertebrados (DIETRICH et al,1989).
Em 1995, a mesma equipe fez um estudo comparativo do mecanismo de
ação anticoagulante da heparina entre mamíferos e moluscos. Analisando alguns
passos da ação sobre a cascata da coagulação, constatou-se que a heparina de
Introdução 21
molusco tem a mesma ação na inibição do fator Xa e na trombina, ao se ligar à
antitrombina, apresentando uma atividade inibitória da trombina quatro vezes
maior que a heparina de mamíferos, quando este efeito é mediado pelo cofator II
da heparina (PAIVA,et al.,1995).
Devido aos relatos sobre a ocorrência de heparinoides em invertebrados,
Medeiros et al., (2000) desenvolveram um extenso trabalho de investigação dos
glicosaminoglicanos de filos de invertebrados para os quais havia pouca ou
nenhuma informação. Assim, foram isolados os GAGS de 23 espécies de 13 filos,
sendo a heparina encontrada em 12 dessas espécies (Figura 2).
Figura 2- Esquema de distribuição filogenética dos GAGS em invertebrados.
Introdução 22
A distribuição de heparina em invertebrados foi estudada no molusco A.
brasiliana foi estruturada por meio de abordagens bioquímicas e histológicas. O
estudo levou os autores a concluírem que a heparina encontra-se distribuída em
células semelhantes aos mastócitos, no palpo labial, intestino, manto e ctenídeo,
órgãos que estabelecem contacto com o meio externo. Os resultados sugeriram
mais uma vez, que a função da heparina em moluscos estaria relacionada com os
processos de defesa independentes do sistema imune (SANTOS et al., 2002,
NADER et al., 2004).
Outros glicosaminoglicanos sulfatados também tem sido detectados em
ascidias e esponjas estes por sua vez possuem atividade anticoagulante.
(PAVÃO et al., 1995 , SPILLMAN et al. ,1995 ).
1.4 Ações Biológica e Farmacológica dos Heparinóides
Apesar do surgimento de vários fármacos anticoagulantes nos dias atuais,
a heparina continua sendo muito estudada e analisada por vários pesquisadores
sobre óticas diferentes. Uma das funções mais bem estabelecidas da heparina é
sua reconhecida ação anticoagulante, a qual é amplamente utilizada na medicina
a mais de meio século (MURRAY, 1936).
Farmacologicamente, é inegável sua ação anticoagulante por potencializar
a ação inibitória da antitrombina sobre as demais serino-proteases constituintes da
cascata de coagulação. Embora sua função fisiológica ainda não seja muito bem
conhecida, seria um erro inferir que sua ação anticoagulante se aplicaria também
Introdução 23
a nível fisiológico, uma vez que este composto se localiza de forma restrita dentro
de grânulos de mastócitos. Além disso, a heparina está presente também, em
células de animais que não apresentam sistema de coagulação, como é o caso
dos moluscos. Os coelhos, por sua vez possuem sistema de coagulação, mas não
possuem a heparina nos seus tecidos (BJORK & LINDAHL, 1982; FARRED et al.,
1998; SANTOS, 2002).
O heparam sulfato é encontrado na superfície celular de uma variedade de
células e na membrana basal. Funções biológicas atribuídas a esses compostos
são decorrentes de sua capacidade de interagir com proteínas devido ao seu
caráter polianiônico bastante alto. Como polieletrólitos são capazes de controlar a
difusão de várias macromoléculas, tais como, fatores de crescimento e
neurotransmissores (SILVA, 2003)
Atualmente, é extremamente importante a realização de estudos mais
detalhados acerca de outras atividades farmacobiológicas além das já
observadas para heparinas de mamíferos. Por exemplo, a ligação da heparina a
lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias causando bacteremia em pacientes com
bactérias Gram-negativas e ainda estimulando a ligação de LPS com células
CD14 induzindo a cascata de sinalização que resulta na ativação de alguns
mediadores inflamatórios, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
(PLAYFORD et al., 1999; HEINZELMANN et al., 1999).
Experimentos realizados com linhagens de camundongos demonstraram
que as relações inversas de heparina a títulos de anticorpos implicavam em maior
resistência à infecção quando os teores de heparina estavam altos. Sugeriu-se
Introdução 24
assim, de forma explícita, a participação da heparina nos mecanismos de defesa
do organismo (STRAUS et al, 1984). Com base também em outros estudos foi
evidenciado que a heparina possui uma ação inibitória do sistema complemento
atuando nos componentes terminais do referido sistema. O sistema complemento
auxilia o sistema imune na defesa do organismo contra possíveis infecções. Tal
efeito é atribuído a massa molecular destes compostos e às suas características
estruturais, ou seja, diretamente relacionado com o aumento do número de
resíduos de sulfato e de ácido glucurônico ou idurônico, sugerindo-se assim, que
estes resíduos seriam essenciais para uma total atividade sobre o sistema imune
(WESTON & PARISH, 1991).
1.5 Cascata de coagulação sangüínea
O processo de coagulação envolve duas vias denominadas de vias
intrínseca e extrínseca. O mecanismo extrínseco de coagulação inicia-se em
presença de fator tecidual que é liberado e posto em contato com o sangue
somente após uma injúria vascular. Quando os coágulos são formados em área
de fluxo sangüíneo lento ou em resposta a um vaso sangüíneo com membrana
anormal, sem que tenha havido injúria tissular, esta via é denominada de
mecanismo intrínseco. Ambos os mecanismos convergem num mecanismo
comum final no qual participam diversos fatores de coagulação, proteínas inativas
que se tornam ativas e que são determinantes para a ativação de protrombina em
trombina e a conversão do fibrinogênio em fibrina conforme mostra a figura 3.
Introdução 25
(WILCOX et al. 1989; MORAES, 2001). O plasma possui várias proteases
capazes de inibir a geração da fibrina, sendo a antitrombina (AT) um dos mais
importantes por bloquear a atividade da trombina além dos fatores XIIa, XIa, IXa,
e fator Xa, (PETITOU et al., 1999; HARENBERG et al., 1995; AVCI et al., 2003)
figura 3. Um outro inibidor natural da cascata de coagulação é a proteína C, que
uma vez ativada pelo complexo formado entre a trombomodulina e a trombina,
esta proteína inicia uma via anticoagulante natural pela clivagem dos fatores Va e
VIIIa, cofatores pertencentes a via intrínseca. (RAND et al., 1996; DI CERA, 1998).
O mecanismo estabelecido a partir da ativação da proteína C favorece a mudança
de função da trombina que passa de procoagulante para anticoagulante como
descrito por (DI CERA, 1998).
Inúmeros autores atribuem a atividade anticoagulante apresentada por
polissacarídeos sulfatados naturais como a heparina, por exemplo, a uma
seqüência pentassacarídica especifica destes compostos, com grupos N e O-
sulfatados capazes de formar sítios de ligação para a AT (LINDAHL & KJELLÉN,
1989; CHOAY, 1989). Sabe-se ainda que a heparina não apenas causa uma
mudança conformacional na AT, sua ação implica também, na formação de uma
superfície catalítica na qual a trombina e a AT se ligam (DANIELSSON et al.,
1986). Apesar de apresentar-se amplamente difundida na clinica como
anticoagulante, a heparina apresenta uma série de desvantagens relacionadas a
sua utilização, tal como uma possível contaminação por ser de origem animal
podendo também provocar a trombocitopenia (HIT). (HIRSH, 1991; BEIJERING &
CATE, 1997).
Introdução
26
Figura 3- Esquema da cascata da coagulação
1.6 Atividade anticoagulante
XXIIIIaa
XXIIII
XXII
IIXX
PPrroottrroommbbiinnaa ((IIII))
Fibrinogênio ((II))FFIIBBRRIINNAA
XXIIaa
XXaa
IIXXaa VVIIIIaa VVIIIIIIaa
VVaa
IIII
VVIIII
IIIaaI
TTrroommbbiinnaa
Superfície “Ativa”
Traumatismo
VVIIAA IINNTTRRÍÍNNSSEECCAA
VVIIAA EEXXTTRRÍÍNNSSEECCAA
VVIIAA FFIINNAALL CCOOMMUUMM
XXXX
Antitrombina
Proteína C
(Trombomodulina )
TPA
Plasminogênio Plasmina
Introdução 27
O plasma possui várias proteases capazes de inibir a geração da fibrina,
sendo a antitrombina (AT) um dos mais importantes inibidores por bloquear a
atividade da trombina, do fator IXa e fator Xa ( DAVIE, FUJIHAWA & KISiEL,
1991). A interação entre a região pentassacarídica da heparina e a AT pode ser
observada na figura 3. Um outro inibidor natural da cascata de coagulação é a
proteína C, que uma vez ativada pelo complexo formado entre a trombomodulina
e a trombina, inicia uma via anticoagulante natural pela clivagem dos fatores Va e
VIIIa, cofatores pertencentes a via intrínseca (RAND et al., 1996; DI CERA, 1998).
O mecanismo estabelecido a partir da ativação da proteína C favorece a mudança
de função da trombina que passa de procoagualnte para anticoagulante como
descrito por DI CERA em 1998.
Inúmeros autores atribuem a atividade anticoagulante apresentada por
polissacarídeos sulfatados naturais como a heparina, por exemplo, à seqüência
pentassacarídica destes compostos com grupos N e O-sulfatados capazes de
formar sítios de ligação com a antitrombina (LINDHAL & KJELLÉN, 1991; CHOAY,
1989). Sabe-se ainda que a heparina não apenas causa uma mudança
conformacional na AT, sua ação implica também, na formação de uma superfície
catalítica na qual a trombina e a AT se ligam (DANIELSSON et al 1986 ;
PETITOU, et al., 1999). Apesar de apresentar-se amplamente difundida na clínica
como anticoagulante, a heparina apresenta uma série de desvantagens
relacionadas à sua utilização, tal como uma possível contaminação por ser de
origem animal, podendo também provocar a trombocitopenia (HIRSH, 1991;
BEIJRING, et al., 1997). PETITOU & VAN BOECCKEL, 2004 analisando
Introdução 28
recentemente um pentassacarídeo sintético, análogo a região pentassacarídica da
heparina, que interage com a AT propuseram que novos fármacos lançados no
mercado, tais como, idraparinux e novos oligossacarídeos deverão agir de forma
mais seletiva em modo de ação do que a heparina e com menores chances de
promoverem a trombocitopenia.
Figura 4- Interação da heparina com a antitrombina.
1.7 Heparinas não fracionadas (HNF) e heparinas de baixo peso molecular
(HBPM)
Introdução 29
A alta incidência de enfermidades coronarianas no mundo inteiro e os
custos que estas geram em termos de recursos hospitalares, ambulatoriais e a
incapacidade resultante para o trabalho, têm induzido a investigações na área de
heparinóides.
Durante décadas a heparina não fracionada (HNF) tem sido o fármaco de
escolha no tratamento da enfermidade tromboembolítica venosa (ETV). A ação
inibitória é exercida mediante a inativação dos fatores da coagulação ativados:
calicreína, factores XIIa, XIa, IXa, Xa e trombina (IIa). (DAVIE, et al, 1991).
Com o avanço da pesquisas neste campo, verificou-se que as heparinas de
baixo peso molecular (HBPM) eram também importantes anticoagulantes. Estas
foram desenvolvidas a partir da década de 1970 estimuladas por três
observações: 1) Atividade antifator II menor que a atividade antifator X (JONHSON
et al.,1976; ANDERSSON et al., 1976). 2) A relação custo benefício mais
favorável (CARTER et al.,1984) 3) As HBPM atuais possuem diferentes pesos
moleculares, variando de 4.000 a 6.500 tendo portanto um terço do tamanho da
heparina não-fracionada e apresentando baixos efeitos colaterais (HIRSH &
LEVINE, 1994 ).
No entanto, um dos questionamentos com relação ao uso a HBPM é a
variabilidade de pesos moleculares. Uma grande base de dados pré clínicos é
atualmente levada em consideração apesar de serem usadas pequenas doses
deste tipo de heparina (30-40 mg ou 2.500 a 4000 unidades anti Xa). Tendo em
vista a possibilidade de seu uso terapêutico utilizando-se doses maiores, estudos
Introdução 30
foram realizados por FAREED et al., 2004 avaliando os aspectos bioquímicos e
farmacológicos de heparinas de baixo peso molecular. A justificativa deste estudo
foi baseada em diferenças na eficácia clínica da heparina quando é administrada
na angina instável. MOUSA 2002; HIRSH et al., 1994 tem direcionado seus
estudos para as propriedades clínicas das heparinas de baixo peso molecular.
Todas as HBPM são obtidas a partir da heparina não fracionada por um dos
seguintes métodos: a) despolimerização com ácido nitroso; b) tratamento com
heparinase; c) clivagem com peróxido de hidrogênio ou benzilação seguida de
despolimerização alcalina (BARROWCLIFFE et al.,1988).
Atualmente, as heparinas não fracionadas e fracionadas possuem diversas
aplicações na terapêutica e são utilizadas profilaticamente em cirurgias de lesão
da medula espinhal e traumas múltiplos, assim como, no tratamento de
tromboembolismo venoso e angina instável (NADER et al., 1999; AVCI et al.,
2003; MORAES 2001).
Outro estudo recente realizado com heparina não fracionada, heparina de
baixo peso molecular e hirudina, demonstrou que estes 3 compostos atenuavam
de forma similar os efeitos da adesão endotelial de leucócitos na pós isquemia.
(HABAZETTL et al., 2004).
1.8 Resposta inflamatória
Introdução 31
A injúria e morte celular podem ser determinadas por processos externos e
internos às células, os quais promovem uma reação complexa em tecidos
vascularizados denominada inflamação. A resposta inflamatória nos tecidos
conjuntivos vascularizados inclui a participação do plasma, células circulantes,
vasos sangüíneos e constituintes celulares e extracelulares dos tecidos
conjuntivos. Esta reação, que fundamentalmente apresenta-se como uma
resposta de proteção utilizada pelo organismo para livrar-se da causa e das
conseqüências da injúria celular, caracteriza-se pelo acúmulo de fluídos e de
células do sangue nos tecidos extravasculares (COTRAN et al.,1999).
1.8.1 Princípios da resposta Inflamatória
A resposta inflamatória é caracterizada pela dor, rubor, calor e edema no
sítio da infecção. Tais alterações são refletidas nos três tipos de mudanças nos
vasos sangüíneos locais. A primeira delas é o aumento do diâmetro vascular,
levando a um aumento no fluxo sangüíneo local resultando em calor e rubor e em
uma redução na velocidade do fluxo sangüíneo, especialmente nas superfícies
dos pequenos vasos sangüíneos locais. A segunda ocorre nas células endoteliais
que circundam os vasos sangüíneos as quais são ativadas para expressar
moléculas de adesão celular que promovem a união dos leucócitos circulantes. A
combinação da taxa e do fluxo sangüíneo reduzido e moléculas de adesão
induzidas, permitem aos leucócitos aderirem ao endotélio e migrarem para os
tecidos, em um processo denominado extravasamento. Todas essas mudanças
Introdução 32
são produzidas pelas citocinas liberadas pelos macrófagos ativados. Uma vez
tendo início à inflamação, as primeiras células atraídas ao local da injúria são
geralmente os neutrófilos, seguidos pelos monócitos, que se diferenciam em
macrófagos nos tecidos. Na última etapa da inflamação, outros leucócitos como os
eosinófilos e linfócitos chegam ao local infectado (ROBBINS & COLTRAN, 1998).
A terceira mudança nos vasos sangüíneos locais é o aumento da
permeabilidade vascular. Em vez de permanecerem firmemente juntas, as células
endoteliais que limitam as paredes dos vasos sangüíneos se desprendem,
permitindo a saída de fluido e proteínas do sangue ocorrendo o seu acúmulo no
local do tecido atingido. Essas mudanças são induzidas por uma variedade de
mediadores inflamatórios liberados como conseqüência do reconhecimento de
patógenos, esses incluem os mediadores lipídicos da inflamação- prostaglandinas,
leucotrienos e o fator ativador de plaquetas (PAF)-que são rapidamente
produzidos pelos macrófagos por meio de vias enzimáticas que degradam os
fosfolipídeos de membrana. Suas ações são seguidas por aquelas das citocinas e
das quimiocinas- (citocinas quimioatraentes) que são sintetizadas e secretadas
pelos macrófagos em resposta aos agentes promotores do processo inflamatório.
A citocina fator de necrose tumoral-α (TNF-α), por exemplo, é um potente ativador
de células endoteliais. Ocorre também que o sistema de coagulação sangüínea
participa do mecanismo da resposta inflamatória onde a cascata de enzimas
plasmáticas induzidas pelo dano aos vasos sangüíneos, estimula à formação do
coágulo, que evita à entrada de qualquer microrganismo na corrente sangüínea
Introdução 33
limitando desta forma a dispersão de qualquer agente infeccioso dentro do
organismo hospedeiro (ABBAS; POBER; LITCHEMAN, 2003).
No processo inflamatório estão envolvidas diversas moléculas
denominadas de moléculas de adesão. A adesão dos leucócitos ao tecido tipo
(endotélio vascular), é o passo inicial que desencadeia a resposta inflamatória.
Este processo é intensamente regulado por interações especificas receptor-
ligante, e ocorrem em seqüência ordenada de eventos. Inicialmente, os leucócitos
ficam ancorados numa interação de baixa afinidade, em seguida, deslocam-se
linearmente sobre o endotélio ativado num processo de rolagem, ancoram-se
firmemente e por último extravasam para o local da infecção (Figura 5). Todos
estes estágios são realizados por três classes distintas de moléculas de adesão:
as selectinas, integrinas e imunoglobulinas.
Neste ponto em especial estudos relataram que a heparina também atua
como componente anti-inflamatório e que a mesma possui afinidade com a L e
P-selectina impedindo a fase inicial do processo de inflamação uma vez que a
heparina liga-se a elas inibindo-as, por se ligarem a domínios relacionados ao
SLex (HAYWARD, NOSSULI & LEFER 1997; KOENIG,1997).
Porém, nenhum efeito sobre a E-selectina foi comprovado, visto que
experimentos realizados em grupos de animais com gene nocauteado para
expressão da L- e P- selectina mas expressavam a E-selectina, quando tratados
com heparina desenvolviam o processo inflamatório de modo mais tardio.
Contudo para que estas interações fossem efetivas, seria necessário, se
conhecer os sítios específicos da molécula de heparina que tem afinidade para
Introdução 34
Figura 5 - Rolamento de leucócitos e distribuição celular das moléculas de adesão
(TIBS). Fonte: www.glycoforum.org
1.9 Propriedades antiinflamatória dos heparinóides
heparinóides, compostos altamente
acídicos, portanto, negativamente carregados, justificam sua interação com
proteínas diversas, tais como AT e moléculas de adesão. Esta interação requer na
estrutura primária destes polímeros sítios (motivos) específicos; (LAWRENCE et
a morfogênese, inflamação, defesa do hospedeiro, e metabolismo energético.
(BERNFIELD et al., 1999)
ligar-se a estas moléculas de adesão, uma vez que, a heparina pode provocar
efeitos colaterais do tipo hemorrágico e de trombocitopenia, invibializando sua
utilização como componente antiinflamatório (XIE et al., 2000).
As características estruturais dos
al., 2004). Estas interações específicas implicam em diversos eventos envolvendo
Introdução 35
grande influência sobre
inúmeras moléculas, tipos celulares e processos relevantes na inflamação. Este
GAGS
inflamatório o heparam sulfato presente na matriz e na
superf
nquica e doenças inflamatórias do intestino. Diversos
estudo
de reperfusão,
O heparam sulfato da superfície celular tem
liga-se a proteínas da matriz, citocinas e quimiocinas. Estas interações
modulam efeitos na maturação de células inflamatórias: 1) a ativação, rolamento
de leucócitos e a estrita adesão ao endotélio, bem como extravasamento e
quimiotaxia. (GOTTE, 2003). Segundo este autor, o complexo papel do heparam
sulfato na inflamação é refletido pelas múltiplas funções de seus carreadores
fisiológicos, os sindecans.
Durante o processo
ície de células endoteliais liga-se a quimiocinas, estabelecendo um
gradiente de concentração local. Foi visto também que os proteoglicanos de
heparam sulfato de células endoteliais e da superfície de leucócitos possuem
também um papel chave em sua interação adesiva direta com moléculas de
adesão como as selectinas e beta 2 integrina (ROPS et al., 2004)
Por outro lado, o efeito da heparina como anti-inflamatório, tem sido
analisado em diversos modelos de inflamação com animais, e em pacientes com
artrite reumatóide, asma brô
s têm indicado que a heparina e o heparam sulfato são ligantes para a L e
P-selectina.
Entretanto, oligossacarídeos de heparina e outros heparinoides podem
inibir P e L- selectina ligando-se a compostos relacionados as SLex ou células
HL60. No entanto não estão bem definidos os determinantes estruturais que se
ligam a P e L-selectinas. Na prática clínica a isquemia da injúria
Introdução 36
observ
m heparinas de mamíferos seria interessante a nosso ver, verificar a
ação d
adas em várias condições como infarto do miocárdio, é importante, neste
processo, se destacar o papel dos grupos sulfatos presentes nos heparinóides
(XIE et al., 2000).
Baseado nestes relatos, e considerando que estes estudos foram
realizados co
e heparinóides obtidos do invertebrado Artemia franciscana no processo
inflamatório.
Objetivos 37
2. OBJETIVOS
No filo crustáceo, tem sido relatada a ocorrência de tipos incomuns de
glicosaminoglicanos, como por exemplo, híbridos de heparina e heparam sulfato
os quais foram observados em algumas espécies de lagosta e camarão. A Artemia
franciscana é um crustáceo primitivo dentro da sequência evolutiva de sua classe,
por isto, torna-se importante o estudo desta espécie para a compreensão da
ocorrência filogenética, destas moléculas durante a evolução.
Com a intenção de ampliar o conhecimento sobre a estrutura e função
biológica destes heparinóides o presente trabalho tem como objetivo:
1-Determinar a estrutura dos heparinóides, presentes na espécie do
crustáceo Artemia franciscana empregando-se análises químicas, degradações
enzimáticas com liases espécificas.
2-Avaliar atividades farmacológicas in vitro e em vivo destes compostos
naturais em relação a sua atividade anticoagulante, hemorrágica e anti-
inflamatória.
Material e Métodos 38
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MMAATTEERRIIAALL BBIIOOLLÓÓGGIICCOO
Figura 6. Crustáceo da espécie Artemia franciscana
corresponde a animal adulto que mede 10 a 12 mm de co
Filo: Arthropoda
Classe: Crustacea
Sub classe:Branchiopoda
Ordem: Anostraca
Família: Artemiidae
Gênero: Artemia
Espécie: Artemia franciscana
utilizado neste estudo. A figura
mprimento.
Material e Métodos 39
3.1.2 Artemia franciscana
A biomassa congelada de Artemia franciscana foi adquirida junto à empresa
distribuidora Henrique Lage Salineira do Nordeste, Macau/RN. O material foi mantido
a –20°C até o momento do processamento. A biomassa utilizada neste estudo
corresponde, principalmente, a pré adultos e adultos desta espécie, capturados com
uma malha seletiva (1 mm) nos evaporadores das salinas.
3.1.3 Enzimas
Foram utilizadas neste estudo as enzimas heparitinases I e II provenientes de
Flavobacterium heparinum gentilmente cedidas pela Profa. Helena B. Nader
(UNIFESP) e Maxatase, (protease alcalina P126) foi adquirida da BIOCON do Brasil
Indústria Ltda (Rio de Janeiro, RJ).
3.1.4 Animais utilizados nos ensaios in vivo
Para a realização do ensaio hemorrágico foram utilizados ratos Wistar
machos, adultos de 4 a 6 meses de idade, com peso entre 250 e 350g, oriundos do
biotério da Universidade Potiguar (UNP). Os animais utilizados no experimento
receberam água e dieta “ad libitum” e foram mantidos em condições controladas de
iluminação e temperatura (23 a 25°C).
Material e Métodos 40
3.2 Padrões de polissacarídeos sulfatados utilizados como referência de
mobilidade eletroforética.
Condroitim 4–sulfato (extraído da cartilagem de baleia) e dermatam
sulfato (extraído de pele de porco) adquiridos de Miles Laboratories
Inc. (Elkhart, IN, EUA).
Heparina da mucosa intestinal bovina foi adquirida daSigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).
Heparina desaminada da mucosa intestinal suína foi adquirida da
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).
Heparam sulfato (de pâncreas bovino) preparado na Opocrin
Laboratories (Modena, Itália).
Os dissacarídeos insaturados N-6- dissulfatado (∆U, 2S-GLcNS,
6S), N-sulfatado foram obtidos por degradação enzimática de
heparam sulfato de pâncreas bovino com heparitinases I e II,
conforme descrito por Nader et al, 1990.
Heparina desaminada foi adquirida da Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO, EUA).
Material e Métodos 41
3.2.1 Monossacarídeos
D–glucosamina, D–galactosamina, N-acetil-D–galactosamina, N-
acetil-D–glucosamina, D–galactose, D-manose, D-glucose, ácido
D–glucurônico, adquiridos da British Drug House (BDH) Chemicals
Ltda. (Poole, Inglaterra) e Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,
EUA).
3.2.2 Outros materiais
Ácido sulfúrico, acetona e tioglicolato de sódio foram adquiridos da
Merck (Darmstadt, Alemanha).
Agarose (Standard-Low-Mr) adquirida da Bio Rad Laboratories
(Richmond, CA. EUA).
Azul de Toluidina; ácido isobutírico, vermelho de cresol e coomasie
briliant blue R 250 foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis,
Mo, EUA.
Cloreto de sódio, ácido acético, ácido clorídrico da Reagen
Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil).
Carbazol, 1,3–diamino propano adquiridos da Aldrich Chemical Co.
Inc. (WI, EUA).
Maxatase (protease alcalina P 126) da BIOCON do Brasil indústria
Ltda (Rio de Janeiro, RJ, Brasil).
Material e Métodos 42
Brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON) da Britsh Drug House
Chemical Ltda. (Poole, Inglaterra).
Papel Whatman nº 1 foi adquirido por meio da R. Balston Ltda
( Maidstone, England)
Todos os demais reagentes utilizados foram da melhor qualidade disponível.
3.3 Aparelhos
Além dos aparelhos habitualmente empregados em nosso laboratório
podemos citar os seguintes equipamentos disponíveis no Departamento de
Bioquímica:
Agitador orbital, modelo 255, FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil).
Liofilizador da EDWARDS do Brasil (São Paulo, SP, Brasil.
Fontes de corrente contínua regulável, desenvolvidas Bio Rad.
Banho maria e estufas de temperaturas constantes, FANEM Ltda.
(São Paulo, SP, Brasil).
Câmaras para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido
por Jaques et al (1968) (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP,
Brasil).
Microscópio Olympus modelo BX-40. (Tokyo, Japão).
Espectrofotômetro U-200 da Hitachi Koki Co., Ltd. (Tóquio, Japão).
Medidor de pH, Orion Research model 701 A/ digital lonalyzer
(Cambridge, MA, EUA).
Coagulômetro modelo: Quick time da (DRAKE Ltda).
Material e Métodos 43
3.4 Métodos
3.4.1 Extração dos polissacarídeos sulfatados de Artemia franciscana.
A biomassa (3kg) de A. franciscana foi submetida a delipidação com 3
volumes de acetona, durante 24 horas, à temperatura ambiente. O pó cetônico
obtido foi homogeneizado com NaCl 1,0 M, sendo o pH ajustado para 8,0 pela
adição de NaOH. Após adição de maxatase na proporção 4g/Kg, a mistura foi
submetida à proteólise sob uma camada de tolueno e mantida 24 horas a 60°C, sob
agitação periódica. Em seguida, a suspensão foi filtrada e do proteolisado obtido foi
retirada uma alíquota de 10 ml para análise do conteúdo total de polissacarídeos e o
restante foi adicionado a resina iônica Amberlite IRA 900 (100 mg/Kg de tecido) para
complexação dos polissacarídeos. A suspensão permaneceu sob agitação à
temperatura ambiente durante 24 horas. O sobrenadante, denominado F-1,0 M, foi
removido por filtração e a resina foi tratada com NaCl 2,0 M e NaCl 3,0 M com o
objetivo de eluir os compostos mais fortemente aderidos. Os heparinóides presentes
na fração F-3,0M foram precipitados com 2 litros de metanol, coletados por
centrifugação e submetidos às análises subseqüentes (Figura 7). A F-3,0 M foi a
fração escolhida neste trabalho para os estudos de caracterização parcial da
estrutura e análises farmacológicas.
Material e Métodos 44
3.4.2 Fracionamento dos heparinóides com diferentes concentrações de
acetona.
A fração F-3,0M obtida após extração dos polissacarídeos do tecido do
crustáceo A. franciscana, foi submetida a fracionamento com volumes
crescentes de acetona. Na fração foi adicionada acetona na proporção de 1:1
(v/v) e mantido a 4°C. Após 18 horas, o precipitado foi coletado e denominado
F0,5. Ao sobrenadante foi adicionado acetona na proporção de 2:1 (v/v) e o
mesmo procedimento anteriormente descrito foi realizado. O precipitado obtido
foi identificado como F-0,6; repetiu-se o mesmo procedimento para se obter as
frações F-0,9 e F-1,2.
Material e Métodos 45
Atividade anticoagulante, Hemorrágica e Anti-inflamatória
PÓ CETÔNICO
PROTEOLISADO
MAXATASE 60°C, 24 h
RESINA + PS
RESINA + PS
FRAÇÃO
NaCl 2.0 M
RESINA
Fracionamen
Eletroforeses e Dosag
DELIPIDAÇÃO
ANIMAL
FRAÇÃO 2.0
Figura 7. Esquema de extração e fracionamento dos heparinóides de A . f
polissacarídeos sulfatados.
NaCl 3.0 M
3.0
to com Acetona
ens químicas
ranciscana. PS :
Material e Métodos 46
Fração F- 3,0M
0.5V ACETONA 4°C 18h 10.000 rpm10 min
F- 0.5
F 1.2
1.2 V ACETONA 4°C 18h 10.000 rpm10 min
F 0.9
0.9V ACETONA 4°C 18h 10.000 rpm10 min
F 0.6
0.6V ACETONA 4°C 18h 10.000 rpm10 min
F 0.5
Figura 8. Esquema de fracionamento da fração F-3,0M de A . franciscana por
precipitações crescentes em acetona.
Material e Métodos 47
3.4.3 Eletroforese em gel de agarose
O gel de agarose (0,6%) diluído em tampão 1,3 diamino propano acetato
(PDA) 0,05 M, pH 9,0 foi colocado sobre lâminas de vidro medindo (7,5x 5,0x 0,2 cm)
ou (7,5x 10x 0,2 cm). Alíquotas de 5 µl (aproximadamente 5 µg de amostra) foram
aplicadas em canaletas no gel e submetidas à eletroforese (5 V/cm durante 1 hora)
em caixa resfriada a 4ºC. A origem correspondia ao polo negativo (DIETRICH &
DIETRICH, 1976).
Os padrões de glicosaminoglicanos, condroitim sulfato, dermatam
sulfato e heparam sulfato foram utilizados como referência de mobilidade na
eletroforese. Após o tempo previsto de migração eletroforética para o sistema de
tampão PDA, os compostos foram precipitados no gel de agarose pela submersão
da lâmina por um tempo mínimo de duas horas, à temperatura ambiente, em
CETAVLON 0,1% (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamônio). Após a precipitação
dos polissacarídeos, o gel foi secado sob uma corrente contínua de ar quente e
corado com azul de toluidina 0,1%, numa solução de ácido acético 1% e etanol 50%.
O excesso de corante foi removido em solução descorante, (ácido acético 1% em
etanol 50%). A etapa de descoloração do gel de agarose foi então repetida até que o
fundo da lâmina descorasse completamente. Em seguida, o gel foi então posto para
secar a temperatura ambiente. As bandas de migração eletroforética dos
polissacarídeos de A. franciscana e dos padrões de glicosaminoglicanos sulfatados
foram reveladas pela atividade metacromática específica de cada composto.
Material e Métodos 48
3.4.4 Sistema 1,3- diaminopropano acetato (PDA).
As amostras foram aplicadas em lâminas de gel de agarose (0,6%) no
tampão PDA 0,05M, pH 9.0. O sistema PDA, de acordo com o grau de interação da
diamina com os polissacarídeos sulfatados, permite discriminar por ordem
decrescente: condroitim sulfato, dermatam sulfato e, juntos, heparam sulfato e
heparina. O gel foi submetido a 100 V em cuba refrigerada a 4°C e como indicador
de corrida utilizou-se o vermelho de cresol. Após a corrida o gel foi fixado com
CETAVLON (0,1%) por, no mínimo, 2h, seco sob corrente de ar quente e corado
com azul de toluidina 0,1% em ácido acético 1% e etanol 50%. Depois de retirado o
excesso com solução descorante, o gel foi seco a temperatura ambiente e os
polissacarídeos sulfatados foram quantificados por densitometria a 525 nm.
3.4.5 Sistema descontínuo Acetato de Bário/PDA.
As amostras foram aplicadas em lâmina de gel de agarose em tampão
acetato de bário 0,04 M, pH 5,8 e esta submetida a 75 V, durante 10 min. Em cuba
refrigerada a 4°C e em seguida transferida para outra cuba (com tampão PDA), onde
é mantida em repouso durante 15 min a 4° e depois submetida a 100 V. Nesse
sistema a heparina foi fracionada em seus componentes: lento, intermediário e
rápido, ocorrendo diferenciação dos outros polissacarídeos sulfatados que
apresentam comportamento eletroforético como no sistema PDA.
Material e Métodos 49
Os procedimentos de fixação e coloração empregados no sistema
Ba/PDA são os mesmos utilizados para tampão PDA.
3.4.6 Sistema Tris – acetato.
A eletroforese em tampão Tris-Acetato (0,05M, pH 8,0) foi também
empregada na identificação dos polissacarídeos sulfatados. Neste método, os
polissacarídeos sulfatados são discriminados pelo número de cargas negativas que
possuem. Assim sendo é a heparina que apresenta maior migração eletroforéica.
Portanto, este tipo de eletroforese serve para diferenciar os heparam sulfatos das
heparinas presentes nos extratos de polissacarídeos sulfatados.
3.5 Degradações enzimáticas.
Após tratamento com acetona, as amostras foram submetidas a incubações
com liases específicas provenientes de F. heparinum, heparitinase I e heparitinase II.
Inicialmente, 100µg de cada uma das frações foram solubilizados em tampão etileno-
diaminoacetato (EDA) e adicionados 5 µl de enzima de forma a obter como volume
final da solução 30 µl. A incubação foi realizada durante 18 horas em banho-maria
regulado a 25°C, e os produtos de degradação foram analisados por cromatografia
em papel.
Material e Métodos 50
3.6 Cromatografias em papel
As amostras foram aplicadas em papel Whatman n°1 sob corrente de ar quente
e submetidas a cromatografia descendente de papel. O solvente utilizado foi ácido
isobutírico: amônia 1,25 N na proporção de 5: 3,6 (v/v) ou na proporção de 5:3 (v/v),
no caso das demais amostras. Após 48 horas no caso da incubação com
heparitinase I e II, o cromatograma foi seco á 60°C. As amostras detectadas por
ultra-violeta foram em seguida reveladas com reagente de nitrato de prata em meio
alcalino (TREVELYAN et al. 1950).
3.7 Análises químicas
Ácidos urônicos
O conteúdo de ácido urônico foi estimado pela reação do carbazol
descrita por Dische (1974), utilizando-se como padrão o ácido D-glucurônico
sendo as leituras realizadas a 525 nm.
Proteínas
O conteúdo de proteínas foi determinado com o reagente de coomassie
blue R segundo o método de Spector (1978) e a leitura realizada a 595 nm,
empregando como curva padrão soro albumina bovina.
Material e Métodos 51
Hexosaminas
A hexosamina total foi determinada pela reação de Élson-Morgan, 1955
modificada, após hidrólise ácida com HCl 4N durante 6h a 100°C em ampolas
seladas e evaporação do ácido a vácuo sob NaOH.
Sulfato
O teor de sulfato total foi determinado após hidrólise ácida (HCl 6N, 6
horas, 100ºC) por turbidimetria pelo método da gelatina-bário (Dodgson &
Price, 1962). O sulfato de sódio (1 mg/ml) foi utilizado como curva padrão
sendo submetido às mesmas condições das amostras em estudo.
3.8 Peritonite induzida por tioglicolato de sódio
Todos os grupos experimentais e controles foram formados por 10 ratos da
linhagem Wistar com dois meses de idade pesando 150-200g. Os animais foram
pesados para calcular as doses individuais de heparinóides. Foram empregadas as
seguintes concentrações: 5, 10, 15, 20, 25 µg/Kg, para os diferentes tipos de
heparinóides testados. Os compostos nas diferentes concentrações foram pesados e
dissolvidos em 1 ml de solução salina a 0,9% e aplicados subcutaneamente nos
animais. O grupo controle foi submetido ao mesmo procedimento sendo que os
animais receberam 1 ml de solução salina 0,9% estéril sem heparinóides
Após 30 minutos, os animais receberam intraperitonealmente uma injeção
contendo uma solução de tioglicolato de sódio a 3% conforme metodologia proposta
Material e Métodos 52
por Xie et al, (2000). Os animais foram então mantidos com “água” e dieta ad libitum.
Três horas após a aplicação do tioglicolato de sódio 3% os animais foram
sacrificados e submetidos à lavagem da cavidade peritoneal com 10 mL de solução
salina contendo EDTA 2mM. O líquido peritoneal e o sangue total de cada animal
foram colhidos, e acondicionados em tubos de hemólise contendo EDTA.
Os leucócitos presentes no líquido coletado na cavidade peritoneal dos
animais foram corados pela solução de Turck e então contados em câmara de
Neubauer, enquanto os leucócitos presentes no sangue total foram contados por
cotagem diferencial.
3.9 Atividade anticoagulante
A atividade anticoagulante das frações foram avaliadas por aPTT e PT.
a) APTT- Tempo de tromboplastina parcialmente ativada.
Foram colocadas em um tubo de ensaio e misturadas cuidadosamente, 9
partes de sangue recentemente colhido com 1 parte de citrato de sódio. O sangue
contendo o anticoagulante foi centrifugado a aproximadamente 300 rpm a fim de
serem separadas a parte sólida da líquida. O plasma obtido foi então acondicionado
em tubode ensaio. Foram utilizados no ensaio 0,1 mL de plasma e 0,1 mL de
cefalina líquida (ativada com complexo caolin). Os reagentes foram homogeneizados
e incubados por 3 min. a 37°C. Pipetou-se 0,1mL de cloreto de cálcio aquecido a
37°C. A leitura foi realizada em coagulometro a fim de se observar a formação ou
não da rede de fibrina.
Material e Métodos 53
b) PT- Tempo de pró-trombina
O plasma foi obtido da mesma forma que mencionado para APTT. Adicionou-
se ao plasma 0,1 ml do reagente REPLASTIN (tromboplastina extraída do cérebro de
coelho). Incubou-se 0,1 ml de cloreto de cálcio 25 mM previamente aquecido a 37°C.
O tempo de PT foi avaliado em um coagulometro.
3.10Atividade hemorrágica
O método utilizado para realização da atividade hemorrágica foi o
desenvolvido por CRUZ & DIETRICH em 1967, com algumas modificações propostas
por DIETRICH et al., 1999.
Através do trabalho desses autores foi observado que a aplicação da heparina
no local da lesão (escarificação) causava a ruptura do sistema hemostático, mesmo
após várias lavagens da cauda com solução salina. Este efeito foi denominado de
efeito hemorrágico residual da heparina.
Para observar esse efeito das frações em estudo, foram feitas raspagens na
parte terminal das caudas dos ratos, seguida de uma escarificação (10 X 1 X 0,5
mm) com uma lâmina de tricotomia na porção distal da cauda.
Em seguida a cauda escarificada foi introduzida em tubos de ensaio de 3mL
contendo 2 ml de solução salina tamponada (NaCl 0,85%; NaHCO3 0,1 mM a pH 7,0,
37°C), para acompanhar o sangramento foi utilizada uma potente lupa. Após esse
procedimento inicial o experimento consistiu em mergulhar, verticalmente, a cauda
Material e Métodos 54
escarificada em solução salina e acompanhar o processo de sangramento. A seguir,
por estímulo mecânico (friccionando uma gaze sobre a escarificação), obteve-se
novo sangramento, e a cauda foi, então, mergulhada numa solução salina nova. A
quantidade de proteína liberada da lesão, neste processo, serve como controle para
ensaios posteriores. O tempo de sangramento normal é de 60±20 s, enquanto que a
proteína total liberada é de 1500±500 µg. Para os experimentos, foram realizadas
três reaberturas da lesão, com intervalos de 10 minutos, tomando-se uma média
referente a um controle de sangramento.
Após os três estímulos mecânicos, a cauda foi mergulhada numa solução
contendo drogas a serem analisadas. Decorridos determinados períodos regulares
de tempo, a cauda foi retirada da solução e lavada intensamente com solução salina,
e o efeito hemorrágico residual observado, mergulhando-se a cauda numa nova
solução salina sem droga.
Os resultados foram expressos pela razão entre a soma cumulativa da taxa de
proteínas liberadas da lesão antes e após o contato com a droga.
Material e Métodos 55
3.11 Métodos Estatísticos:
Nas análises estatisticas dos modelos experimentais de inflamação em ratos da linhagem
Wistar foram utilizados os seguintes testes:
• Teste de Kolmogorov-Smirnov, para avaliar a distribuição normal dos grupos
analisados com p>0,10
• Estatística de Bartlett para verificar a homogeneidade das variâncias.
• Análise de variância (ANOVA) com nível de significância de 5%.
• Teste de Tukey, para determinar que grupos que diferem entre os valores obtidos para
os grupos controle e experimental (comparações múltiplas).
Resultados e Discussão 56
4. Resultados e Discussão
4.1 Eletroforese da fração F-3,0 M
Os GAGS são polímeros aniônicos requerendo nas etapas de purificação
complexação com resinas de troca iônica ou precipitação com CTV. O
procedimento de eluição é geralmente feito com concentrações crescentes de
NaCl e posterior precipitação com álcool metílico ou etílico. Glicosaminoglicanos
extraídos de A. fraciscana após proteólise foram complexados com resina de troca
iônica (LEWATIT) e eluídos com concentrações variadas de NaCl (1,0; 2,0 e 3,0
M). As frações obtidas nas concentrações de NaCl (1,0 e 2,0 M) foram analisadas
por Chavante em 1997. Neste estudo, a autora se propunha a verificar a estrutura
de um heparam sulfato deste micro-crustáceo e para isto escolheu a fração F-2,0
M por possuir maior rendimento. Tendo em vista que a F-3,0 M apresentava um
perfil eletroforético homogêneo indicando a ausência de contaminantes,
resolvemos caracterizar este polímero e avaliar suas atividades farmacológicas.
Vários sistemas de tampão foram utilizados para avaliar o perfil de
migração da F- 3,0 M de A franciscana. Na figura 9 podemos observar que a F-
3,0M é um composto metacromático que migra entre o dermatam e heparam
sulfato. Como este polissacarídeos apresenta uma única banda polidispersa e de
migração atípica resolvemos fazer então uma purificação adicional em acetona
para verificarmos a presença ou não de outros componentes nesta fração.
Resultados e Discussão 57
PDA
CS DS HS
Figura
em diversos s
8,0; Tris –acet
bário 0,04 M p
CSDS
0 0
P F-3,09. Eletroforese em gel
istemas de tampões.
ato, tampão tris acetato
H 5,8.
TRIS- ACETATO
de
PDA
0,0
P F-3,
HS
agarose da F-3,0 M de Artemi
, tampão diamino propano aceta
5 M , pH 8,0; Bário PDA, tamp
Bário/PDA
a
to
ão
P F-3,
CS DS HS
franciscana
0,05 M pH
acetato de
Resultados e Discussão 58
4.2 Composição Química da F-3,0 M de Artemia. franciscana.
A fração F-3,0M foi submetida à analise de seus componentes por meio de
dosagens colorimétricas e turbidimétricas para (SO4) como descrito em métodos.
Tabela 2- Relação molar dos componentes constituintes da F-3,0M de Artemia
franciscana, heparina e heparm sulfato.
Frações Ácidos Urônicos Hexosamina Sulfato
F-3,0M 0,9 1,0 1,7
Heparina 1,6 1,0 2,6
Heparam Sulfato 1,4 1,0 1,1
• Heparina comercial de intestino bovino. • Heparam Sulfato de pâncreas bovino.
A fração F-3,0M apresentou composição característica de GAGS o quê
somando-se aos dados das eletroforeses indicou a presença de GAGS nesta
fração.
Comparando-se as dosagens de F-3,0M a heparina e heparam sulfato
observa-se que elas não se assemelham em valores molares, indicando que os
componentes de F-3,0M são compostos tipo heparinóides.
Resultados e Discussão 59
4.3 Fracionamento da F 3,0 M em acetona
O fracionamento em acetona é uma metodologia de fácil execução e repro-
dutibilidade. Segundo Johson, 1982, compostos hidrofílicos como proteínas e
polissacarídeos, GAGS e outros, são prontamente precipitáveis com solventes
mais apolares que o etanol, como por exemplo, a acetona.
Fracionamentos prévios feitos por Nader, 1996, comprovaram que os
GAGS podem ser fracionados com êxito com este solvente em diferentes
concentrações. O acompanhamento do material fracionado geralmente é feito por
eletroforese em gel de agarose em diferentes sistemas de tampões, dosagens
colorimétricas, hidrólises químicas e/ou enzimáticas com cromatografias em papel
dos hidrolisados das frações.
A fração F-3,0M quando fracionada em acetona originou 4 sub- frações por
nós denominadas de 0,5, 0,6, 0,9 e 1,2. Estas sub-frações foram posteriormente
caracterizadas por eletroforese e pelas análises químicas.
Resultados e Discussão 60
4.4 Comportamento eletroforético das sub-frações de Artemia franciscana
proveniente do fracionamento com acetona
Uma das formas de caracterização e de acompanhamento de um processo
de purificação dos GAGS é a eletroforese. Tampões como acetato de bário/PDA,
1,3 diamaminopropano acetato (PDA) e tris-acetato por sua vez, interagem com
estes compostos acídicos devido às características químicas destas biomoléculas.
Podemos observar na figura 10 que a fração F-3,0 de Artemia franciscana
apresentou um composto com uma migração eletroforética abrangendo o DS e
HS. Este comportamento sugere a presença destes dois GAGS e possivelmente
outros compostos com migrações eletroforéticas nesta região, além de sugerir que
esta fração seria dotada de algumas peculiaridades estruturais.
As sub-frações quando submetidas à eletroforese em gel de agarose em
tampão PDA apresentaram diferentes comportamentos eletroforéticos. As frações
F-0,5 e F-0,6 apresentaram dois compostos, um deles com maior migração e
comportamento eletroforético semelhante ao heparam sulfato enquanto que a
outra banda demonstrou migração bem mais lenta neste sistema.
Resultados e Discussão 61
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0.05M pH 9,0, dos
polissacarídeos de Artemia franciscana após fracionamento com acetona.
P – padrões de condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS).
Os números 0,5; 0,6; 0,9;1,2 e 3,0 representam, respectivamente, as frações F-0,5; F-
0,6; F-0,9; F-1,2 e F-3,0.
No tampão tris-acetato figura 11 observou-se que todas as frações de
polissacarídeos mostraram-se pouco polidispersas, sendo que as sub frações F-
0,9 e F-1,2 apresentaram parte de seus perfis eletroforéticos coincidentes com a
heparina e heparam sulfato. Estes resultados, somados aos resultados obtidos
sugerem que os compostos obtidos são heparinóides, embora, contenham
dermatam sulfato como contaminante.
Resultados e Discussão 62
Figura 11. Eletroforese em gel de agarose em tampão Tris-acetato das frações de
Artemia franciscana obtidas após fracionamento com acetona. P– padrões de GAGS
contendo condroitim sulfato(CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS) . Hep-
heparina padrão. 0,5; 0,6; 0,9;1,2 e 2,0 representam, respectivamente, as frações F-0,5;
F-0,6; F-0,9; F-1,2 e F-2,0, provenientes do fracionamento da F-3,0 com acetona.
No sistema descontínuo Ba/PDA figura 12 observou-se nas sub-frações F-
0,5 e F-0,6 a presença de uma banda de migração rápida e outra lenta,
coincidentes com as observadas com a heparina padrão. A sub-fração F-0,9
apresentou também, estas duas bandas sendo que a banda de maior migração
continha compostos com perfis coincidentes com DS e HS. Os resultados obtidos,
embora preliminares, sugerem que a F-3,0 M apresentou um conjunto de
heparinóides, incluindo, um composto com características de um híbrido HS/HeP.
As análises realizadas por Silva, 2003 e Paiva, 2002 indicaram também em outros
Resultados e Discussão 63
crustáceos, a ocorrência de polissacarídeos sulfatados com características
estruturais distintas daquelas descritas na literatura.
Figura 12. Eletroforese em gel de agarose no sistema Ba/PDA das frações de A.
franciscana obtidas após tratamento da F-3,0 com acetona. P–padrões de GAGS
contendo condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS). Hep--
heparina padrão. 0,5; 0,6; 0,9;1,2 e 2,0 representam, respectivamente, as frações F-0,5;
F-0,6; F-0,9; F-1,2 e F-3,0, provenientes do fracionamento da F-3,0 com acetona.
Resultados e Discussão 64
4.5 Dosagens químicas e cromatografia em papel das frações obtidas
com acetona.
Tanto a F-3,0 M como as sub-frações 0,5, 0,6, 0,9 e 1,2 foram analisadas
quimicamente e os resultados estão demonstrados na tabela 2. Com relação às
análises químicas, a proporção molar de ácidos urônicos: hexosamina: sulfato
identificada para a fração F-3,0M foi da ordem de 0,9: 1,0: 1,7 respectivamente. A
sub-fração 1,2 apresentou uma relação molar similar a observada na fração F-
3,0M. Analisando-se ainda esta tabela, podemos observar que as sub-frações F-
0,6 e F-0,9 apresentaram proporções inferiores de sulfato em relações às demais
frações. Por outro lado, a sub-fração 0,5 mostrou-se enriquecida em ácidos
urônicos, conforme mostra a tabela 3. A fração F-3,0M e a heparina bovina
apresentaram diferenças com relação ao sulfato e a proporção de ácidos urônicos.
Resultado semelhante foi obtido por Silva, 2003 em trabalho realizado com
glicosaminoglicano de Panulirus laevicauda.
Resultados e Discussão 65
Tabela 3- Relação molar dos constituintes das frações de GAGS de A. franciscana.
FRAÇÕES ÁCIDOS
URÔNICOS
HEXOSAMINA SULFATO
F-0,5
2,1
1,0
1,6
F-0,6 1,1 1,0 0,9
F-0,9 1,1 1,0 0,7
F-1,2 1,1 1,0 1,5
F-3,0 0,9 1,0 1,7
Heparina* 1,6 1,0 2,6
* Heparina comercial de intestino bovino.
4.6 Caracterização dos produtos de degradação das frações de Artemia
franciscana
4.6.1 Por degradação enzimática
A degradação enzimática tem sido bastante usada na caracterização de
heparinóides. As liases mais extensivamente estudadas são as de F. heparinum.
Este organismo foi isolado do solo e mantido em meio de cultura cuja fonte de
carbonos era heparina. As enzimas heparitinases I e II quando incubadas com as
frações de polissacarídeos extraídos da A. franciscana formaram os seguintes
Resultados e Discussão 66
produtos: F-0,5, Didi (dissacarídios dissulfatados); F-0,6 Didi. As demais frações
não foram utilizadas por não dispormos de material suficiente.
A ocorrência de heparinóides foi constatada por eletroforese no sistema
PDA e no sistema descontínuo Ba/PDA. Para uma caracterização mais completa
da fração F-3,0M de A. franciscana esta foi incubada com heparitinases I e II
comerciais. Os resultados observados após a incubação com heparitinase I
revelaram como principal produto, dissacarídeos trissulfatados (Ditri). Quando a F-
3,0M foi submetida à ação conjunta de ambas heparitinases I e II liberou como
produto além do dissacarídeo trissulfatado, o dissacarídeo dissulfatado (Didi),
produto característico da ação da heparitinase II sobre o tetrassacarídeo
pentassulfatado, liberado pela heparitinase I figura 13.
Os dados obtidos pela degradação com heparitinases I e II corroboram com
os resultados de outros compostos tipo heparina de invertebrados
(SANTOS,1997), bem como, com a heparina intestinal bovina (PAIVA et al., 1995;
NADER et al., 1999) que são mais susceptíveis a ação conjunta das heparinases
do que a ação isolada da heparinase I, sugerindo uma maior ocorrência de
resíduos de ácido glucurônico nesses compostos.
No que diz respeito a F-3,0M de Artemia quando a mesma é submetida à
ação conjunta de ambas heparitinases, a fração F-3,0M, liberou principalmente,
dissacarídeos trissulfatados (∆U,2S-GlcNS,6S) juntamente com dissulfatados (∆U-
GlcNS,6S) e N-sulfatados, o que reforçaria a idéia de ser este composto um
híbrido tipo heparina /heparam sulfato. Na figura 14 o incubado das sub-frações
0,5 e 0,6 apresentou dois produtos de degradação Didi e um composto que migra
Resultados e Discussão 67
na altura do DiNAC, 6S. Este último composto é característico de um heparam
sulfato.
Em 1997, FERNANDES, estudando glicosaminoglicanos na lagosta
Panulirus argus identificaram um heparam sulfato com alto grau de sulfatação,
também semelhante, ao encontrado em outros crustáceos como A. franciscana
em trabalho anterior realizado por CHAVANTE et al., 2000 com frações distintas
de F-3,0M, frações F-1,0 M e F-2,0M. Tais resultados só vêm reforçar a idéia que
nesta fração existiria heparam sulfato e também resíduos de moléculas tipo
heparina.
Resultados e Discussão 68
A
Figura 13. Caracterização
HEPARITINASE I e HEPARIT
I + II; C- F3,0M+ Heparitinase
+II; F- Heparam sulfato + he
Heparam sulfato + heparitinas
(dissacarídio trissulfatado ∆U,
B C D E F G H I Jda F-3,0 M de A. fran
INASE II. A-F3,0M + Heparitin
I; D- Heparina + HeparitinaseII
paritinase II;G- Heparam sulfa
e I; I- Didi (dissacarídeo dissu
2S-GlcNS,6S).
Ditriidi
OR
ciscana pelas enzimas
ase II; B- F3,0 + Hepariniase
; E- Heparina + HeparitinaseI
to + heparitinase I + II; H-
lfatado ∆U-GlcNS,6S; J-Ditri
D
DiNs
DiNAc,6s
DiNAc
Resultados e Discussão 69
A B
Figura 14. Caracterização das
enzimas HEPARITINASE I e
Heparina + Heparitinase I + II; C
heparitinase I +II; E- Didi (dissac
trissulfatado ∆U,2S-GlcNS,6S).
C D E F
sub frações da F-3,0 M
HEPARITINASE II. A- He
- sub-fração 0,5+ Hepariti
arídeo dissulfatado ∆U-Glc
Ditri
OR
de A. franciscana com as
parina + Heparitinase I; B-
naseI+II; D- sub-fração 0,6+
NS,6S; F- Ditri (dissacarídio
Didi
DiNs
Resultados e Discussão 70
4.6.2 Efeito in vitro dos heparinóides de Artemia franciscana na coagulação
sanguínea
A heparina pode ser utilizada em esquemas terapêuticos com baixas ou
altas doses. A sua utilização, em baixas doses, está indicada quando se deseja
prevenir a TVP em pacientes com determinado risco trombótico (pós-operatório de
cirurgias abdominais e ortopédicas, portadores de neoplasias ou sepse, pacientes
em repouso prolongado etc.). As altas doses são utilizadas com fins terapêuticos,
quando se pretende prevenir a ocorrência de um segundo episódio
tromboembólico em TVP já instalado, em pacientes com TVP, EP, tromboses ou
embolias arteriais ou que estejam sendo submetidos a procedimentos, que
implicam em risco trombótico, como cateterismos arteriais ou angioplastias,
hemodiálise e cirurgia cardiovascular com circulação extracorpórea.
Avaliando a atividade anticoagulante com relação ao tempo de
tromboplastina parcial ativada APTT que indica a deficiência dos fatores da via
intrínseca (VIII, IX, XI, XII) e da via comum (X, II, I).
Os resultados obtidos pelo ensaio da APTT, demonstraram que os
heparinóides (F-3,0M) de Artemia franciscana apresentam baixa atividade
anticoagulante (62.2s em 25 µg/ml) quando comparados com o heparam sulfato
(201s em 15 µg/ml) e heparina comercial de pulmão bovino (240s em 5 µg/ml).
Estes resultados demonstraram que a F-3,0M não tem ação sobre a via intrínseca
da cascata de coagulação figura 15.
Resultados e Discussão 71
Atividade Anticoagulante - aPTT
050
100150200250300
0 2 5 7 10 15 20 25
ug/ml
Tem
po (s
) Heparina
Heparamsulfato F3,0M
Figura 15-Avaliação da atividade anticoagulante pelo teste de tromboplastina
parcial ativada (APTT) in vitro da fração F-3,0 de A. fanciscana, heparam sulfato e
de heparina padrão bovina.
A atividade anticoagulante foi avaliada também através do tempo de
protrombina PT que revela deficiência no fator VII da via extrínseca e nos fatores
da via comum X, V, II, e I ou inibição deles. Os resultados obtidos revelaram que
fração F-3,0M, assim como o heparan sulfato, não tem efeitos sobre a via
extrínseca da cascata de coagulação figura 16.
Resultados e Discussão 72
Atividade Anticoagulante-PT
0
50
100
150
0 2 5 7 10 15 20 25
ug/ml
Tem
po (s
)
Heparina PadrãoHeparam SulfatoF3,0M
Figura 16. Ação anticoagulante, tempo de protrombina (PT) da heparina padrão
bovina, heparam sulfato e fração F-3,0 de Artemia franciscana.
4.6.3 Atividade hemorrágica
Os experimentos realizados em ratos Wistar para se verificar a atividade
hemorrágica dos heparinóides de A . franciscana mostraram que este composto
apresenta uma ação menos efetiva quando comparada com a heparina de pulmão
bovino. Observa-se na figura 17 que a heparina tem uma ação hemorrágica
efetiva em baixas concentrações (25 µg/ml). A F-3,0 M de Artemia franciscana
apresentou uma ação hemorrágica na concentração de 400 µg/ml equivalente a
heparina padrão. Em concentrações mais baixas a 400 µg/ml não foi observada a
atividade hemorrágica indicando que esta atividade neste componente poderia ser
do tipo dose dependente nas diversas concentrações testadas figura 17.
Resultados e Discussão 73
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Tempo (min)
Potê
ncia
de
sang
ram
ento
F-3,0M 100ug/ml
F-3,0M 200ug/ml
F-3,0M 400ug/ml
Heparina P 25ug/ml
Figura 17. Efeito hemorrágico de F-3,0M de Artemia e da heparina de pulmão
bovino padrão.
4.6.4 Efeito da fração F-3,0 M no processo inflamatório.
Conforme já foi mencionado, os heparinóides desempenham importantes
papeis com relação a muitos processos que tem por base o sistema imunológico e
a cascata de coagulação. Estes dois processos estão intrinsecamente ligados pois
as proteases da cascata de coagulação induzem a síntese de mediadores pro-
inflamatórios que tem atividade pro-anticoagulante, amplificando assim, a cascata
de coagulação (LEVI, 2003). A inflamação aguda, como uma resposta à infecção
severa ou trauma, resulta em uma ativação sistêmica do processo de coagulação.
Portanto, o processo inflamatório tem relação direta com o sistema de coagulação.
Resultados e Discussão 74
No presente trabalho, após caracterização parcial dos heparinóides deste
crustáceo e sabendo-se que existe uma interrelação entre coagulação e
inflamação resolvemos verificar o efeito destes compostos no processo
inflamatório. Uma justificativa adicional para o direcionamento deste trabalho neste
sentido, relacionou-se com o fato dos heparinóides deste crustáceo ter em
peculiaridades estruturais como baixas massas moleculares e diferentes graus de
sulfatação em relação as heparinas comerciais.
A fração 3,0 M obtida da Artemia franciscana foi utilizada para os testes de
inflamação induzida por tioglicolato de sódio a 3% em ratos Wistar. O nosso
objetivo estava centrado em verificar as potencialidades desta fração no processo
de inibição da migração de células (leucócitos) para o local da inflamação. Teria
este composto os grupamentos capazes para reconhecer os sítios das moléculas
adesivas impossibilitando desta forma que esta molécula chegue a se tornar
competidora pelos sítios das L- e P- selectinas ?
Xie et al. (2000) utilizando derivados quimicamente modificados da heparina
em um modelo de inflamação aguda mostraram, uma redução da migração de
neutrófilos em torno de 58-73% em relação ao grupo controle. Trabalhos
realizados por Wang et al. (2002) também demonstraram a ação inibitória da
heparina em animais deficientes em P e L-selectinas sendo observado uma
redução na infiltração de neutrófilos da ordem de 50%.
A Analise de Variância (ANOVA), realizada com o grupo controle positivo e
negativo, e os grupos experimentais da heparina padrão (Figura 18),
apresentaram diferenças significantes entre as médias (p<0,001). O pós teste de
Tukey-Kramer para o controle positivo e negativo foram considerados
Resultados e Discussão 75
extremamente significantes (p<0.001). Desta forma estes padrões serviram de
parâmetro para comparação dos grupos experimentais constituídos de heparina
padrão, heparina desaminada e fração F-3,0M de Artemia franciscana.O pós teste
de Tukey-Kramer confirmou as diferenças entre o controle positivo (TG) e a
heparina padrão nas concentrações de 5 µg/Kg (p<0.001) e 10 µg/Kg (p<0.05).
Por outro lado, não foram observadas diferenças entre o controle positivo e a
heparina padrão nas concentrações 15, 20, 25µg/Kg. As diferenças observadas
entre o controle negativo foram significantes para todos os grupos experimentais
(p<0.001). Quando comparada a eficácia das diferentes concentrações da
heparina padrão, constatou-se que a redução do número de leucócitos na
concentração de 5 µg/Kg foi significante em relação a concentração de 10µg/Kg
(p<0.05). As concentrações de 15, 20 e 25 µg/Kg obtiveram um valor de p<0.01.
Ao se comparar a heparina padrão na concentração de 10 µg/Kg com os grupos
15, 20 e 25 µg/Kg as diferenças entre o número de células não foram
estatisticamente significantes (p >0.05).
Resultados e Discussão 76
Heparina Padrão
01.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.000
Contro
le+
Contro
le- 5 10 15 20 25
Núm
ero
de c
elul
as (m
m3)
Figura 18. Efeito da fração de heparina padrão na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.
O gráfico representa a comparação entre as médias do número de
leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal de
tioglicolato de sódio a 3% grupo controle positivo) salina estéril a 0,9% (grupo
controle negativo) e Heparina nas concentrações de 5,10,15,20,25 µg/Kg.
Partindo do princípio de que a heparina padrão tem ação sobre as P e L-
selectinas, resolvemos verificar a ação de uma heparina quimicamente modificada
sobre este sistema. A figura 19 apresenta o número de leucócitos para os grupos
experimentais com a heparina desaminada nas concentrações de 5, 10, 15 , 20 e
25 µg/Kg. A análise de variância (ANOVA) apresentou diferenças significantes
entre o controle positivo, negativo e os grupos experimentais. O pós teste de
Tukey-Kramer identifcou que as diferenças entre as médias do controle positivo e
Resultados e Discussão 77
experimentais foram significantes (p<0,0001). No entanto, quando comparado ao
controle negativo, apenas as médias dos grupos de concentrações 15 e 25 µg/Kg
apresentaram diferenças significantes, ou seja, apesar destas concentrações a
heparina desaminada não conseguiu trazer o número de leucócitos a níveis
basais.
Heparina Desaminada
01.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.000
Controle +
Controle -
5 10 15 20 25Núm
ero
de c
elul
as (m
m3)
Figura 19 . Efeito da heparina desaminada na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.
O gráfico representa a comparação entre as médias do número de
leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal
de tioglicolato de sódio a 3% (controle positivo) e salina estéril a 0,9%
(grupo controle negativo) e Heparina nas concentrações de 5,10,15,20,25
µg/Kg.
Resultados e Discussão 78
No grupo experimental de F-3,0 M da A franciscana a análise de variância
(ANOVA) apresentou diferenças entre as médias (figura 20). O pós teste de
Tukey-Kramer demonstrou que as diferenças se deram entre o controle positivo e
o grupo experimental em todas as suas concentrações (p<0,0001). O número de
leucócitos no grupo F-3,0 M (20 µg/Kg) não foi reduzido ao padrão de normalidade
quando comparado com o controle negativo (p<0,05). A média do número de
células do grupo F-3,0M na concentração de 10 µg/Kg foi menor que aquelas
encontradas nos grupos F-3,0 M com 15 µg/Kg (p<0,05) e F-3,0 M quando
utilizado 20 µg/Kg (p<0,01). Nas concentrações de 15 µg/Kg e 20 µg/Kg não
existiram diferenças (p>0,05).
F 3,0 M Artemia franciscana
01.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.000
Contro
le+
Contro
le- 10 15 20
Núm
ero
de c
elul
as (m
mm
3)
Figura 20. Efeito da fração F-3,0 M de Artemia franciscana na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.
Resultados e Discussão 79
O gráfico representa a comparação entre as médias do número de
leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal de
tioglicolato de sódio a 3% (controle positivo) e salina estéril a 0,9% (controle
negativo) e Heparina nas concentrações de 10,15,20 µg/Kg.
A comparação foi realizada primeiramente pela constatação de que na
concentração de 10 µg/Kg para os diferentes grupos experimentais apresentaram
diferenças estatísticamente significante em relação ao grupo controle positivo.
Além disso, a atividade da heparina padrão no controle da inflamação é
confirmado pelos seguintes trabalhos da literatura (KOENING et al, 1998; XIE et
al, 2000). Ao se comparar os diferentes grupos experimentais na concentração de
10 µg/Kg constatamos que as diferenças foram significantes pela análise de
variância (p<0,0001). As médias do número de leucócitos para a heparina padrão
10 µg/Kg (3702 mm3) foi maior quando comparado com a heparina desaminada 10
µg/Kg (3465mm3) e com a F3,0 M Artemia franciscana 10 µg/Kg (3400 mm3)
constatada pelo pós teste de Tukey-Kramer (p<0,0001). Os grupos experimentais
testados com heparina desaminada e a F-3,0 M apresentaram um padrão de
afinidade aumentada em relação a interação com a P ou L-selectinas.
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