View
225
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 1/94
LỜ I C Ả M Ơ N
LỜ I CẢM Ơ N
Tr ướ c tiên, em xin chân thành cảm ơ n tất cả quý thầy cô, những ngườ i đã
hết lòng truyền đạt cho em kiến thức quý báu và bổ ích trong những năm học vừa
qua. Xin cảm ơ n quý thầy cô Khoa Khoa học, những ngườ i đã đào tạo kiến thức
đại cươ ng cũng như chuyên ngành hết sức quan tr ọng và cần thiết để em có thể
hoàn thành tốt công việc cũng như có thể tiế p cận vớ i những kiến thức mớ i sau
này.
Xin chân thành cảm ơ n Cô LÊ BẢO NGỌC, thạc s ĩ Khoa Thủy Sản, cán
bộ hướ ng dẫn chính, ngườ i tr ực tiế p hướ ng dẫn cũng như tận tình chỉ bảo cho em
trong quá trình thực tậ p. Nhờ sự giúp đỡ của Cô, em mớ i có thể hoàn thành đượ cluận văn tốt nghiệ p một cách thuận lợ i. Chỉ làm việc vớ i Cô trong một thờ i gian
ngắn nhưng em đã học đượ c đức tính cẩn thận và tinh thần trách nhiệm cao trong
công việc, những đức tính r ất quan tr ọng đối vớ i một ngườ i làm công tác khoa
học.
Xin chân thành cảm ơ n Cô LÊ THỊ BẠCH, thạc s ĩ Khoa Khoa Học, cán
bộ hướ ng dẫn. Cô đã tận tình hỗ tr ợ về mặt lý thuyết, giúp em giải quyết những
khó khăn trong quá trình làm luận văn. Nhờ sự chỉ dẫn cũng như những tài liệuvà sự giúp đỡ nhiệt tình của Cô, em mớ i có thể vượ t qua những vướ n mắc, những
khó khăn trong quá trình tổng hợ p tài liệu và viết bài.
Xin chân thành cảm ơ n thầy NGUYỄ N VĂ N ĐẠT, giảng viên cố vấn học
tậ p, thầy đã quan tâm cũng như ủng hộ, giúp đỡ chúng em trong suốt thờ i gian
học tậ p cũng như trong thờ i gian chúng em làm luận văn.
Xin chân thành cảm ơ n Cô NGUYỄ N THỊ DIỆP CHI, Thầy LÊ THANH
PHƯỚC, nhờ vào giáo trình và những kiến thức mà quý thầy cô đã truyền đạt,em mớ i có thể nắm đượ c những lý thuyết nền tảng, phần lý thuyết không thể
thiếu về Sắc ký cũng như về Khối phổ giúp em hoàn chỉnh đề tài của mình.
Xin cảm ơ n sự giúp đỡ của quý thầy cô Bộ Môn Dinh Dưỡ ng và Chế Biến
Thủy Sản, cảm ơ n sự động viên, ủng hộ tinh thần cũng như sự quan tâm giúp đỡ
của các bạn lớ p Cử Nhân Hóa Khóa 29, các bạn lớ p Thủy Sản Khóa 29, những
ngườ i cùng làm việc vớ i tôi trong thờ i gian làm luận văn tại Khoa Thủy Sản.
Do hạn chế về kiế n thứ c cùng một số vấ n đề về trang thiế t bị nên đề tàikhông tránh khỏi sai sót, mong đượ c sự góp ý chân thành của thầ y cô cùng các
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 2/94
NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ H ƯỚ NG D Ẫ N
Trang ii
TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
KHOA KHOA HỌC Độc lậ p - Tự do - Hạnh phúc
BỘ MÔN HOÁ ------
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HRƯ RỚ NG DẪN
1. Cán bộ hướ ng dẫn: Ths. LÊ BẢO NGỌC
Ths. LÊ THỊ BẠCH
2. Đề tài: “CHU Ẩ N HÓA PH ƯƠ NG PHÁP XÁC ĐỊ NH DƯ LƯỢ NG
MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC S Ả N PH Ẩ M TH Ủ Y S Ả N B Ằ NG LC-MS/MS”
3. Sinh viên thực hiện: ĐOÀN ĐỨ C BẢO
- MSSV: 2033425 - Lớ p: Cử nhân hóa học - Khóa 29
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức LVTN:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung của LVTN:
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 3/94
NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ H ƯỚ NG D Ẫ N
Trang iii
c. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội
dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................d. K ết luận, đề nghị và điểm:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
Cần Thơ , ngày tháng năm 2007
Cán bộ hướ ng dẫn
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 4/94
NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ PH Ả N BI Ệ N
Trang iv
TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
KHOA KHOA HỌC Độc lậ p - Tự do - Hạnh phúc
BỘ MÔN HOÁ ------
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện: Ths. NGUYỄN THỊ DIỆP CHI
2. Đề tài: “CHU Ẩ N HÓA PH ƯƠ NG PHÁP XÁC ĐỊ NH DƯ LƯỢ NG
MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE GREEN TRONG
CÁC S Ả N PH Ẩ M TH Ủ Y S Ả N B Ằ NG LC-MS/MS”
3. Sinh viên thực hiện: ĐOÀN ĐỨ C BẢO- MSSV: 2033425 - Lớ p: Cử nhân hóa học - Khóa 29
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức LVTN:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung của LVTN:
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
c. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội
dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
.......................................................................................................................................
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 5/94
NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ PH Ả N BI Ệ N
Trang v
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
d. K ết luận, đề nghị và điểm:
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
Cần Thơ , ngày tháng năm 2007.
Cán bộ phản biện
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 6/94
TÓM LƯỢ C
Trang vi
TÓM LƯỢ C
Đề tài “Chuẩ n hóa phươ ng pháp xác đị nh d ư l ượ ng Malachite Green (MG)
và Leuco Malachite Green (LMG) bằng S ắc ký l ỏng cao áp hi ệu năng cao ghépcặ p khố i phổ (LC-MS/MS)” đượ c tiến hành dựa trên phươ ng pháp tham chiếu:
“XÁC ĐỊ NH MALACHITE GREEN VÀ LEUCO-MALACHITE GREEN TRONG
MỘT SỐ SẢ N PHẨM THUỶ SẢ N BẰ NG SẮC KÝ LỎ NG CAO ÁP GHÉP CẶP
KHỐI PHỔ (LC/MS-MS)” đượ c tiến hành bở i nhóm các nhà khoa học Jeffrey M.
VADNe Riet, Cory J. Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A. Potter và B. Garth
Burns.
Bằng hệ thống LC-MS/MS bao gồm thiết bị sắc k ỷ lỏng cao áp hiệu năng cao
AGILENT 1100 và thiết bị khối phổ API 3000 của phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ
Môn Dinh Dưỡ ng và Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, tr ườ ng Đại học Cần Thơ ,
dướ i sự hướ ng dẫn tr ực tiế p của Thạc s ĩ Lê Bảo Ngọc và sự hỗ tr ợ của Thạc s ĩ Lê
Thị Bạch, hai cán bộ hướ ng dẫn, sinh viên làm đề tài sẽ tiến hành chuẩn hóa phươ ng
pháp phân tích dư lượ ng Malachite Green và Leuco Malachite Green trong các sản
phẩm thủy sản dựa trên phươ ng pháp tham chiếu nêu trên.
Mẫu phân tích sau khi giải đông, đượ c tách chiết theo quy trình đượ c trình
bày trong đề tài. Xây dựng đườ ng chuẩn vớ i các nồng độ 0 ppb; 0,1 ppb; 0,5 ppb; 1 ppb; 2 ppb; 5 ppb; 10 ppb; 20 ppb; 50 ppb; 100 ppb, dựa vào các thông số thu đượ c
bằng thiết bị MS/MS API 3000 về diện tích peak để xây dựng đườ ng chuẩn, từ đó
tính độ thu hồi cũng như nồng độ chất cần phân tích có trong các mẫu phân tích.
Muốn có đượ c độ nhạy cao, thao tác đầu tiên là optimize hệ thống, ngh ĩ a là tìm các
thông số cơ bản của thiết bị như tốc độ dòng, điện thế của nguồn ion hóa, nhiệt độ
dòng khí Nitơ … đối vớ i hệ thống Khối phổ; tỷ lệ dung môi pha động (Gradient pha
động) qua cột tách đối vớ i hệ thống Sắc ký, khi các thông số này đảm bảo cho quá
trình phân tích có độ nhạy cao và ổn định thì quá trình tách chiết và phân tích mẫumớ i đượ c tiến hành. Có thể nói, optimize là quá trình chiếm nhiều thờ i gian nhất và
khó khăn nhất trong quá trình phân tích nói chung.
Đầu tiên, sinh viên thực hiện đề tài sẽ tiến hành chuẩn hóa phuơ ng pháp phân
tích dư lượ ng MG và LMG trong các sản phẩm thủy sản bằng hệ thống LC/MS/MS,
sau đó nếu thờ i gian và thiết bị cho phép sẽ tiế p tục chuẩn hóa phươ ng pháp phân
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 7/94
TÓM LƯỢ C
Trang vii
tích dư lượ ng MG và LMG bằng HPLC. Sau đó so sánh độ nhạy, giớ i hạn phát hiện,
lượ ng mẫu cần thiết của mỗi phươ ng pháp, từ đó có thể thấy đượ c những ưu điểm
của phươ ng pháp LC/MS/MS so vớ i phươ ng pháp HPLC. Đồng thờ i k ết quả thu
đượ c từ quá trình chuẩn hóa cũng đượ c so sánh vớ i các k ết quả của phươ ng pháp
tham chiếu do Tổ Chức AOAC xây dựng. K ết quả của đề tài sẽ là một tài liệu tham
khảo r ất có giá tr ị đối vớ i những nghiên cứu dư lượ ng MG, LMG nói riêng và các
loại thuốc kháng sinh nói chung của chúng ta sau này.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 8/94
CH Ữ VI Ế T T Ắ T
Trang viii
NHỮ NG CHỮ VIẾT TẮT
Những chữ viết tắt sau đây đã đượ c sử dụng trong đề tài luận văn:
MG Malachite green
LMG Leucomalachite green
MW Molecular Weight
MF Chemical Formula
ppm Parts per million
ppb Parts per billion
μm Micrometer
ng Nanogram
JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
IARC International Agency for Research on Cancer
FSA Food StADNards Agency
NTP National Toxicology Programme
AAS Atomic Absorption Spectroscopy
AES Atomic Emission Spectroscopy
HPLC High pressure Liquid chromatography
RP – HPLC Reversed-phase - High pressure Liquid chromatography
MS Mass spectrometry
LC-MS Liquid chromatography - Mass spectrometry
LC-MS-MS Liquid chromatography – TADNem Mass spectrometry
MP Mobile phase
API Atmospheric Pressure Ionization
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization
ESI Electrospray Ionization
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 9/94
CH Ữ VI Ế T T Ắ T
Trang ix
nanoESI Nanoelectrospray ionization
APCI Atmospheric pressure chemical ionization
MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization
DIOS Desorption/ionization on silicon
FAB Fast atom/ion bombardment
EI Electron ionization
CI Chemical ionization
HA Hydroxylamine.HCl
MeCN Acetonitrile
DEG Diethylene glycol
TSA p-toluen sulfonic acid monohydrate
TMPD N,N,N,N-tetramethyl-1,4-phenilenediamine dihydrochloride
Đệm:ACN Dung dịch đệm : Acetonitrile
DIW Nướ c cất
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 10/94
M Ụ C LỤ C
Trang x
MỤC LỤCPHẦ N MỞ ĐẦU. .................................................................................................................. 1
TUPHẦ N NỘI DUNGUT ................................................................................................................ 5TUCHƯƠ NG I. GIỚI THIỆU TỔ NG QUAN VỀ MALACHITE GREENUT............................... 5
TUI.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆ NUT................................................................................................ 5TU
I.2. CẤU TRÚC CỦA MALACHITE GREEN VÀ NHỮ NG CHẤT CHUYỂ N HÓAUT
... 6TUI.2.1. DẠ NG CÓ MÀU CỦA MALACHITE GREEN (MG-C) UT ................................... 7TUI.2.2. DẠ NG CARBINOL CỦA MALACHITE GREENUT ............................................. 8TUI.2.3. DẠ NG LEUCO – MALACHITE GREEN (LMG)UT .............................................. 8
TUI.3. TÍNH ĐỘC CỦA MALACHITE GREENUT .................................................................. 9TUI.4. CÁCH THỨ C GÂY ĐỘT BIẾ NUT ................................................................................. 9TUI.5. TỔ NG HỢP MGUT .......................................................................................................... 9TUI.6. TỔ NG HỢP LMGUT ..................................................................................................... 10
TUCHƯƠ NG II. TỔ CHỨ C QUỐC TẾ AOACUT....................................................................... 12TUCHƯƠ NG III. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH HỢP CHẤT BẰ NG HPLCUT .............................. 13
TUIII.1. QUÁ TRÌNH SẮC KÝUT ........................................................................................... 13TU
III.2. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH BẰ NG SẮC KÝ LỎ NG HIỆU NĂ NG CAOUT
.............. 14TUIII.2.1. NGUYÊN TẮC, CẤU TẠO CỦA HỆ THỐ NG HPLC:UT ................................. 15TUIII.2.2. Sắc ký hấ p phụ pha đảo (RP – HPLC) UT............................................................. 17
TUIII.3. QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH UT..................................................................................... 19TUIII.3.1. QUÁ TRÌNH TÁCH, CHIẾT LÀM SẠCH MẪUUT .......................................... 20TUIII.3.2. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRÊN HỆ THỐ NG HPLCUT ........................................ 20TUIII.3.3. XỬ LÝ SỐ LIỆUUT ............................................................................................. 20
TUCHƯƠ NG IV. GIỚI THIỆU VỀ PHỔ KHỐI LƯỢ NGUT ...................................................... 21TUIV.1. CÁC BỘ PHẬ N CỦA PHỔ KHỐI LƯỢ NGUT ......................................................... 22
TUIV.1.1. NGUỒ N ION HÓAUT ......................................................................................... 22TUIV.1.2. BỘ PHẬ N PHÂN TÍCH KHỐI LƯỢ NGUT........................................................ 24
TU
CHƯƠ NG V. GIỚI THIỆU CÁC THIẾT BỊ CHÍNHUT
......................................................... 26TUV.1. HỆ THỐ NG HPLC AGILENT 1100 UT ....................................................................... 26TUV.2. HỆ THỐ NG API 3000 UT ............................................................................................. 27
TUCHƯƠ NG VI. CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢ NG MGUT ............................ 28TUVI.1. KHÁI QUÁT UT .......................................................................................................... 28TUVI.2. GIỚI THIỆU PHƯƠ NG PHÁP THAM CHIẾUUT .................................................... 32
TURPHẦ N THỰ C NGHIỆMUTR ..................................................................................................... 39TUCHƯƠ NG VII. CHUẨ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH DƯ LƯỢ NG MG VÀ LMGUT. 39
TUVII.1. NGUYÊN TẮCUT ......................................................Error! Bookmark not defined. TUVII.2. CÁC THÍ NGHIỆM ĐƯỢC TIẾ N HÀNHUT ........................................................... 40
TUVII.2.1. HIỆU CHỈ NH HỆ THỐ NG PHÂN TÍCHUT ..................................................... 41TU
VII.2.2. XÂY DỰ NG ĐƯỜ NG CHUẨ NUT
.................................................................... 56TUVII.2.3. THÊM CHUẨ N ĐỂ TÍNH HIỆU SUẤT THU HỒIUT ..................................... 69TUVII.2.4. THỰ C TẬP TÁCH CHIẾT MẪUUT ................................................................. 74
TUCHƯƠ NG VIII. K ẾT LUẬ N VÀ KIẾ N NGHỊ UT .................................................................. 78TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................80
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 11/94
PH Ầ N M Ở ĐẦ U
Trang 1
PHẦN MỞ ĐẦU
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một quốc gia có khí hậu nhiệt đớ i, lượ ng mưa trung bình trên
năm r ất lớ n, độ ẩm cao, hệ động thực vật phong phú, đa dạng cùng một số lượ ng lớ n
các ao hồ, kênh r ạch. Vớ i tất cả các đặc điểm trên, Việt Nam có một tiềm năng r ất
lớ n trong l ĩ nh vực nuôi tr ồng thủy sản. Ý thức đượ c tiềm năng đó, Đảng và Nhà
nướ c ta đã quan tâm tạo mọi điều kiện để phát triển ngành thủy sản, mà định hướ ng
xuất khẩu ra nướ c ngoài là chủ yếu. Trong giai đoạn hiện nay xuất khẩu thủy sản
đang giữ một vai trò chủ đạo trong các mặt hàng xuất khẩu của nướ c ta, đem lạinguồn thu nhậ p ngoại tệ vô cùng lớ n, đóng góp đáng k ể vào công cuộc công nghiệ p
hóa hiện đại hóa đất nướ c. Kim ngạch xuất khẩu trong tháng 1 năm 2007 ướ c đạt 40
triệu USD, bằng 134,6% cùng k ỳ, đạt 6,2% k ế hoạch năm.
Vớ i sự kiện Việt Nam tr ở thành thành viên chính thức thứ 150 của tổ chức
Thươ ng mại thế giớ i (WTO) vào ngày 11 tháng 07 năm 2006, cơ hội cho ngành thủy
sản của Việt Nam có thể phát triển hơ n nữa là không cần bàn cải. Tuy nhiên, để
ngành xuất khẩu thủy sản có thể phát huy tối đa tiềm năng của mình, để nó có thể đem lại nguồn thu nhậ p cao về ngoại tệ, chúng ta cần nhắm vào những thị tr ườ ng
khó tính như Mỹ, Nhật, Canada và Châu Âu. Thách thức đầu tiên mà ngành xuất
khẩu thủy sản gặ p phải khi xâm nhậ p vào những thị tr ườ ng này ngoài “rào cản về
thuế quan” là “rào cản về k ỹ thuật”. Ngh ĩ a là muốn đượ c những thị tr ườ ng này chấ p
nhận, chúng ta phải đảm bảo đượ c chất lượ ng và tính an toàn của các mặt hàng xuất
khẩu. Điều mà họ chú tr ọng ngoài mẫu mã và chất lượ ng của sản phẩm, trên hết là
dư lượ ng các thuốc kháng sinh còn tồn đọng trong sản phẩm sau khi đã qua khâuchế biến và đóng gói. Vì còn thiếu hiểu biết cũng như kinh nghiệm về vấn đề này
mà các doanh nghiệ p xuất khẩu của chúng ta đã phải tr ả một giá đắt. Những tháng
cuối năm 2004, trên mườ i container cá da tr ơ n, cá rô phi và cá trê xuất khẩu sang thị
tr ườ ng Châu Âu của các doanh nghiệ p ở An Giang, Đồng Tháp…bị tr ả về do phát
hiện chất Malachite green – hóa chất có thể gây ung thư. Chỉ riêng trong năm 2005,
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 12/94
PH Ầ N M Ở ĐẦ U
Trang 2
EU đã phát hiện 12 lô hàng về dư lượ ng Malachite Green. Tất cả các lô hàng bị phát
hiện có chứa hóa chất đều bị tr ả lại Việt Nam. Điều này đã gây ra những thiệt hại
lớ n cho các doanh nghiệ p xuất khẩu thủy sản nói riêng cũng như cho toàn bộ nền
kinh tế của nướ c ta nói chung. Các doanh nghiệ p có quy mô nhỏ, vốn ít đã không
thể đứng vững tr ướ c những tổn thất trên.(4-7) Mặt khác, hàm lượ ng cho phép của các loại thuốc kháng sinh trong các mặt
hàng thủy sản xuất khẩu này thườ ng khác nhau ở mỗi nướ c, nhất là giữa nướ c ta và
các nướ c có nền khoa học phát triển. Do những hạn chế về thiết bị phân tích cũng
như các k ỹ thuật phân tích mà một số lô hàng xuất khẩu mặc dù đã đượ c chúng ta
kiểm tra và xác định là không chứa dư lượ ng kháng sinh, đủ tiêu chuẩn xuất khẩu
nhưng khi sang Mỹ, Canada hay Nhật Bản, chúng lại chứa hàm lượ ng kháng sinh
vượ t mức cho phép.
Để khắc phục tình tr ạng đáng tiếc này, chúng ta phải xây dựng hoặc áp dụng
những quy trình phân tích chuẩn, đáng tin cậy mà k ết quả phân tích do chúng đem
lại phải đượ c các quốc gia có nền khoa học tiên tiến thừa nhận.
Vớ i những điều kiện về trang thiết bị cũng như trình độ phân tích hiện nay,
Việt Nam chưa thể xây dựng đượ c các quy trình phân tích chuẩn có độ tin cậy cao
như thế. Điều mà chúng ta có thể làm là dựa vào các quy trình phân tích chuẩn, sẵn
có do các quốc gia tiên tiến xây dựng và các thiết bị hiện đại do họ cung cấ p để xác
định dư lượ ng thuốc kháng sinh trong các mặt hàng xuất khẩu thủy sản, từ đó phát
hiện k ị p thờ i những lô hàng không đủ tiêu chuẩn nhằm bảo đảm sức khỏe cho ngườ i
tiêu dùng, giảm bớ t thiệt hại về mặt kinh tế cho các doanh nghiệ p xuất khẩu cũng
như chiếm đượ c sự tin tưở ng của các thị tr ườ ng khó tính.
Trong số các loại thuốc kháng sinh có dư lượ ng tồn đọng lớ n trong các mặt
hàng xuất khẩu thì Malachite Green (MG) là loại kháng sinh phổ biến nhất và bị các
quốc gia phát triển – các thị tr ườ ng chính của chúng ta, phản đối sử dụng trong nuôi
tr ồng thủy sản nhiều nhất. Để tìm hiểu về các phươ ng pháp phân tích Malachite
Green nhằm kiểm tra dư lượ ng của hóa chất này trong các sản phẩm thủy sản, dướ i
sự hướ ng dẫn của Thạc s ĩ Lê Bảo Ngọc và Thạc s ĩ Lê Thị Bạch, đề tài “Chuẩ n hóa
phươ ng pháp xác định d ư l ượ ng Malachite Green và Leuco Malachite Green trong
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 13/94
PH Ầ N M Ở ĐẦ U
Trang 3
các sản phẩ m thủ y sản bằ ng S ắ c ký l ỏng cao áp hiệu năng cao ghép cặ p khố i phổ
(LC/MS-MS)” do sinh viên Đoàn Đức Bảo thực hiện đã đượ c tiến hành.
Mục đích của đề tài là dựa vào các quy trình phân tích dư lượ ng MG và LMG
chuẩn trong các sản phẩm thủy sản đượ c xây dựng bở i AOAC, nhóm nghiên cứu sẽ
chuẩn hóa quy trình phân tích này để có đượ c một phươ ng pháp phân tích có chấtlượ ng và độ tin cậy tươ ng đươ ng, đồng thờ i phù hợ p vớ i điều kiện về trang thiết bị
cũng như dụng cụ và hóa chất của phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ môn Dinh Dưỡ ng
và Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Tr ườ ng Đại học Cần Thơ , nơ i tiến hành đề
tài.
II. CÁC PHƯƠ NG PHÁP VÀ PHƯƠ NG TIỆN THỰ C HIỆN
1. Các phươ ng pháp Phươ ng pháp t ổ ng k ế t kinh nghiệm:
- Nhận đề tài.
- Sưu tầm và đọc tài liệu.
- Xây dựng cơ sở lý thuyết.
- Phân tích, hệ thống rút ra bài học kinh nghiệm.
- Viết bài. Phươ ng pháp thự c nghiệm:
- Chuẩn bị
+ Nhận đề tài và địa điểm tiến hành thực nghiệm.
+ Soạn lý thuyết và chuẩn bị phươ ng tiện, dụng cụ, hóa chất.
+ Dự đoán những vấn đề có thể xảy ra và khắc phục.
- Tiến hành thực nghiệm và viết bài.2. Phươ ng tiện thự c hiện
- Các tài liệu có liên quan.
- Các giáo trình thực tậ p.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 14/94
PH Ầ N M Ở ĐẦ U
Trang 4
- Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm, cùng một số phươ ng tiện khác có liên quan,
cần thiết có sẵn trong phòng thí nghiệm.
III. CÁC BƯỚ C THỰ C HIỆN ĐỀ TÀI
1. Nhận đề tài.
2. Sưu tầm tài liệu.
3. Nghiên cứu các tài liệu có liên quan.
4. Tiến hành thí nghiệm khảo sát.
5. So sánh k ết quả của các phươ ng pháp.
6. Rút ra k ết luận, tiến hành thực nghiệm.
7. Viết bài báo cáo.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 15/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN
Trang 5
PHẦN NỘI DUNG
A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
CHƯƠ NG I. GIỚ I THIỆU TỔNG QUAN VỀ MALACHITE GREEN
- Số CAS: [ HTU569-64-2UTH].
- Mã sản phẩm: J.T. Baker: P451.
- Khối lượ ng phân tử (MW): 364.911đvC.
- Công thức phân tử (MF): C23H25 N2Cl(
dạng chloride).
- Tên IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-
phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-aniline).
I.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN
Malachite Green (MG) hay còn gọi là aniline green, basic green 4, diamond
green B, hoặc victoria green B, tên IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-
methyl]-N,N-dimethyl-aniline) là một loại hoá chất có độc tính đượ c sử dụng như
một loại thuốc nhuộm. Khi pha loãng, nó có thể đượ c sử dụng như một loại thuốc
sát trùng hoặc thuốc kháng sinh, kháng nấm cho cá và tr ứng cá đang r ất đượ c quan
tâm hiện nay. Nó còn đượ c sử dụng như một loại thuốc nhuộm màu vi khuẩn trong
các phòng thí nghiệm. MG thườ ng ở dạng tinh thể màu xanh, trong suốt. Chất không
mùi, không vị. Tan trong nướ c, trong ancol, methanol, amyl alcol.
- Độ tan: 1/15 trong nướ c và 1/15 trong alcol.
- pH: dung dịch 1% có pH : 1.4
- Hấ p phụ ở bướ c sóng λBmaxB: 614, 618 nm.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 16/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN
Trang 6
Tan trong nướ c có màu xanh blue, ở pH<2 có màu vàng, pH=2: màu xanh,
pH=11.6: màu xanh blue, pH=14: không màu. Vì thế, Malachite green
hydrochloride còn đượ c xem như một hóa chất chỉ thị acid-base.
Malachite Green còn đượ c dùng làm thuốc thử để xác định phosphate trong
nướ c sông bằng phươ ng pháp so màu. (Theo tài liệu: NW Menzies ADN LC Bell,T ậ p san nghiên cứ u đấ t tr ồng ở Australia 26(3) 451 – 464).
Malachite green hydrochloride là một chất bền dướ i những điều kiện sử dụng
và cất tr ữ bình thườ ng, bị phân hủy bở i các chất oxi hóa mạnh.
Tuy nhiên, năm 1992 ở Canada, các nhà khoa học xác định r ằng Malachite
Green có thể ảnh hưở ng đến sức khoẻ của con ngườ i nếu chúng ta ăn phải cá bị
nhiễm loại hóa chất này. MG đã đượ c xế p vào nhóm các hoá chất nguy hiểm đến
sức khoẻ. Tuy nhiên do giá thành r ẻ, nó vẫn đượ c sử dụng ở những quốc gia khôngcó đạo luật cấm sử dụng hoá chất này.(8,9)
I.2. CẤU TRÚC CỦA MALACHITE GREEN VÀNHỮ NG CHẤT CHUYỂN HÓA
Từ cấu trúc của hợ p chất chúng ta có thể giải thích đượ c những tính chất sinh
học và hoá học của chúng. MG đượ c biết đến phổ biến ở dạng có màu mà chủ yếu là
thuốc nhuộm có màu xanh. Tuy nhiên khi đượ c hấ p thụ vào cơ thể, nó sẽ đượ c
chuyển đổi thành những dạng khác nhau nhưng có vai trò tươ ng đươ ng nhau.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 17/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN
Trang 7
I.2.1. DẠNG CÓ MÀU CỦA MALACHITE GREEN (MG-C)
UThông tin Hoá họcU
- Tên thông thườ ng: Malachite Green.
- Tên IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-
aniline).
- Công thức: C23H25 N2.
- Khối lượ ng phân tử: 329.46 đvC.
- Bướ c sóng hấ p thu cực đại: 614,425 η m.
- Dạng tồn tại: tinh thể r ắn màu xanh.
- Tính tan: đáng k ể (> 10%).
Dạng có màu của MG đượ c sử dụng để nhuộm giấy, tơ lụa, len. Tên gọi của
hoá chất này xuất phát từ màu xanh của chúng, và không có liên quan đến khoáng
Malachite (CuCO3.Cu(OH)2). Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã cho thấy,
những con chuột có lượ ng MG ở nồng độ 100 ppb tồn tại trong cơ thể quá 2 năm sẽ
xuất hiện các khối u gan.
MG đượ c sử dụng như một loại thuốc nhuộm sinh học, dùng nhuộm màu cho
các vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm phân tích các mẫu tế bào và mô. Trong
phươ ng pháp nhuộm Gumnez, các thuốc nhuộm fuchsin dùng để nhuộm màu đỏ hoặc đỏ thẩm cho vi khuẩn, còn MG đượ c sử dụng để nhuộm màu xanh cho vi
khuẩn.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 18/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN
Trang 8
I.2.2. DẠNG CARBINOL CỦA MALACHITE GREEN
Trong dung dịch, dạng có màu của MG (MG-C) trao đổi từ từ vớ i các ion
OH- để tạo ra một dạng carbinol trung hoà và không có màu. Dạng này có thể hoà
tan chất béo tốt hơ n MG-C, nó có khả năng làm căng các màng tế bào nhanh hơ n,
giúp cho MG có thể xuyên qua màng tế bào một cách dễ dàng. Ngoài ra, khi vào tế
bào, nó sẽ tiến hành trao chất và chuyển thành dạng Leuco-Malachite Green (LMG).
I.2.3. DẠNG LEUCO – MALACHITE GREEN (LMG)
MG đượ c hấ p thụ vào cá và tr ứng cá thông qua đườ ng nướ c, sau đó nó tiến
hành trao đổi chất và chuyển thành dạng LMG, tích luỹ trong các bắ p cơ của cá.
Trong thực tế, LMG đượ c sử dụng để phát hiện các vết máu trong các cuộc
điều tra án mạng. Hemoglobin xúc tác phản ứng giữa LMG và H2O2, chuyển hoá
LMG không màu thành dạng MG có màu. Vì vậy, sự xuất hiện màu xanh của MG là
N
CH3
N CH3
CH3
H3C N
CH3
N CH3
CH3
H3C
Cl-
Reduction
Oxidation
- HCl
Malachite green (MG) Leucomalachite green (LMG)
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 19/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN
Trang 9
bằng chứng cho thấy sự tồn tại của các vết máu tội phạm đã huỷ tr ướ c đó mà vớ i
mắt thườ ng chúng ta không thể nhận ra.(8.10,11)
I.3. TÍNH ĐỘC CỦA MALACHITE GREEN
U Liề u l ượ ng gây độcU: LD50: 80 mg/kg (Theo RTECS Number: BQ1180000).
Khi MG đượ c sử dụng như một loại thuốc kháng sinh và diệt trùng trong nuôi
thuỷ hải sản, các loài trên sẽ hấ p thu MG vào cơ thể qua đườ ng nướ c nhiễm MG, khi
vào trong cơ thể sinh vật, MG sẽ tham gia các phản ứng trao đổi và chuyển hoá
thành LMG không phân cực. Lượ ng LMG này sẽ đượ c tích tr ữ và tồn tại một thờ i
gian dài trong các bắ p cơ của cá. Thờ i gian tồn tại của LMG là 10 ngày trong khi
MG chỉ tồn tại trong thờ i gian 2,8 ngày.(9-11)
I.4. CÁCH THỨ C GÂY ĐỘT BIẾN
K ết quả của một số các nghiên cứu đã đưa ra giả thuyết những sản phẩm trao
đổi chất của MG và LMG như N-dimethyl có thể làm giảm hoạt động trao đổi chất
theo cách thức tươ ng tự như cách thức quan sát đượ c vớ i các axit amin thơ m gây
ung thư. Ngoài ra quá trình oxy hóa và ngay cả các phản ứng este hóa MG và LMG
cũng làm nảy sinh các hợ p chất gây phá hủy cấu trúc của ADN. Dựa vào các k ết quả phân tích đột biến, các nhà khoa học đã nhận thấy, chính sự hoạt động không hiệu
quả của các hệ thống hoạt hóa quá trình trao đổi chất do MG và LMG gây ra là
nguyên nhân gây nên những tổn hại cho ADN. (10,11)
I.5. TỔNG HỢ P MG
Thêm một lượ ng Buthyllitium (4,8 ml; trong 2,5 M Hexan) vào trong dung
dịch 4-Bromo-N,N-dimethylanilin (3,15 g; 10 mmol) trong 100 ml THF khô thông
qua một ống mao dẫn, ở nhiệt độ -780ºC trong môi tr ườ ng khí Argon. Phản ứng pha
tr ộn đượ c kích thích ở điều kiện nhiệt độ không đổi trong 2 giờ . Sau đó sử dụng
phễu nhỏ giọt để thêm vào từng giọt dung dịch 4-(dimethylamino) benzophenone
(4,5 g; 10 mmol). Hỗn hợ p đượ c làm ấm từ từ ở nhiệt độ phòng. Dừng phản ứng
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 20/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN
Trang 10
bằng cách thêm H2O và lượ ng nướ c dư đượ c chiết vớ i ete. Dung dịch ete sau chiết
đượ c r ửa vớ i H2O và làm khô bằng MgSO4 khan. Sau khi cô quay ta thu đượ c 4,26
g bột nhão màu xanh chứa hỗn hợ p trung gian Carbinol. Phần cặn Carbinol đượ c
chuyển vào một bình thót cổ chứa 100 ml metanol và 1ml HCl. Dung dịch màu xanh
sáng chuyển thành dung dịch trung gian màu xanh thẫm nằm trên dung dịch acid.
Sau đó làm lạnh dung dịch, chuyển bột nhão vào môi tr ườ ng chân không để tạo ra
sự phân bố của khối bột nhão giữa H2O và ete.
Lớ p nướ c đượ c r ửa giải nhiều lần vớ i ete cho tớ i khi chạy TLC dung dịch
ete sau r ửa giải không phát hiện dấu vết của cặn hữu cơ . Lớ p dung dịch có màu xanh
đượ c cô đặc sau đó đượ c làm khô bằng máy ly tâm Speedvac. Cặn sau khi làm khô
tiế p tục đượ c làm tinh khiết bằng cách cho chạy qua cột sắc ký Silica sử dụng hỗn
hợ p Clorofrom: methanol tỷ lệ 9:1 làm pha động. Sau khi tổng hợ p ta thu đượ c 1,94
g MG (53%) dướ i dạng cặn màu xanh thẩm.
HÌNH 1: SƠ ĐỒ TỔNG HỢ P MG
I.6. TỔNG HỢ P LMG
MG (1,63 g; 4,8 mmol) đượ c xử lý vớ i N2H4.H2O (800 ml; 15,5 mmol) và
10% Pd/C (250 g) trong cồn tuyệt đối (150 ml), hỗn hợ p đượ c đun hoàn lưu. Dung
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 21/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN
Trang 11
dịch màu xanh chuyển thành không màu sau khi đun hoàn lưu đượ c 10 phút.Tiế p tục
đun hoàn lưu trong 1 giờ sau đó làm lạnh dung dịch, lọc qua nền Celit chứa trong
phễu Bucher để đuổi hết chất xúc tác. Dịch lọc đượ c cô đặc và phân bố giữa H2O và
ete. Lớ p nướ c đượ c chiết vớ i ete vài lần, sau đó hỗn hợ p ete sau chiết đượ c r ửa lại
vớ i nướ c. Lớ p hữu cơ đượ c làm khan bằng MgSO4, lọc và ly tâm. Thu đượ c lớ p cặn,
lớ p cặn ở dạng dầu này đượ c cho vào một cột Silicat và đượ c giải hấ p vớ i dung dịch
Acetat:Hexan tỷ lệ 1:4. Phần thích hợ p đượ c thu thậ p, cô cạn và k ết tinh từ
etylacetat và hexan để thu đượ c 1,44 g (88%) LMG tinh khiết dướ i dạng r ắn màu
xanh ve.(11)
HÌNH 1: SƠ ĐỒ TỔNG HỢ P MG
HÌNH 2: SƠ ĐỒ TỔNG HỢ P MG
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 22/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-AOAC
Trang 12
CHƯƠ NG II. TỔ CHỨ C QUỐC TẾ AOAC
HÌNH 3: BIỂU TƯỢ NG CỦA TỔ CHỨ C AOAC Tổ chức AOAC là một hiệ p hội khoa học, một tổ chức của các nhà phân tích
Hóa Học. Tổ chức này thiết lậ p và xây dựng những phươ ng pháp chuẩn mực cho
phép chúng ta nhận đượ c những k ết quả phân tích đáng tin cậy từ những phân tích
khoa học. Hiện nay nhiều Quốc gia yêu cầu các công ty của họ phải sử dụng những
phươ ng pháp phân tích đượ c phát triển bở i AOAC.
AOAC đã tồn tại đượ c hơ n 120 năm. Tiền thân của nó là một tổ chức của
những nhà Hóa Học phân tích về phân bón thuộc Bộ Nông Nghiệ p Mỹ, họ muốn
xây dựng những phươ ng pháp thống nhất để phân tích phân bón. Dần dần, nó đượ c
phát triển thành một tổ chức quốc tế, một tổ chức của các nhà phân tích Hóa Học.
Cùng vớ i kiến thức, những thí nghiệm và chuyên môn cao của hơ n 2700 nhà
khoa học, nhà phân tích mà 1 phần 3 trong số đó có quốc tịch nằm ngoài nướ c Mỹ,
AOAC đã phát triển đượ c nhiều khả năng, những quy trình, những phươ ng pháp
cũng như những mô hình chuẩn xác góp phần hình thành hình ảnh và nhiệm vụ của
AOAC, mang lại những điều kiện thuận lợ i trong công việc của giớ i phân tích khoa
học trên toàn thế giớ i.
Theo những phươ ng pháp đượ c xây dựng bở i AOAC, các nhà phân tích có
thể đạt đượ c sự nhất trí cao trong việc tìm ra những phươ ng pháp cần thiết, thiết lậ pđượ c những tiêu chuẩn thực hiện và làm tăng tính hợ p lý của các phươ ng pháp phân
tích.(13)
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 23/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 13
CHƯƠ NG III. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH HỢ P CHẤTBẰNG HPLC
Để xác định thành phần các chất có trong mẫu nghiên cứu ngườ i ta sử dụng
nhiều phươ ng pháp phân tích trong đó có sắc ký. Đượ c tìm thấy trong một thí
nghiệm của nhà hóa học ngườ i Nga, Michale Tvest , Sắc ký là một phươ ng pháp có
hiệu quả cao dùng để tách hỗn hợ p các chất.
Phươ ng pháp này đã hình thành và phát triển thành nhiều phươ ng pháp trong
đó có k ỹ thuật phân tích bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao. Thiết bị này đã hỗ
tr ợ cho quá trình tách và phân tích thành phần hợ p chất nhanh hơ n cũng như có độ
nhạy và hiệu quả cao, hiện đang đượ c áp dụng nhiều trong các l ĩ nh vực như dượ c
phẩm, môi tr ườ ng, thực phẩm…
III.1. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ
Sự tách sắc ký dựa trên sự phân bố khác nhau của các hợ p phần khác nhau
trong hỗn hợ p giữa hai pha luôn tiế p xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha t ĩ nh
và một pha động.
Quá trình tách sắc ký bao gồm 3 giai đoạn:
1) Đưa hỗn hợ p chất cần phân tích vào pha t ĩ nh. Các chất cần phân tích sẽ đượ c
giữ trên pha t ĩ nh.
2) Cho pha động chạy qua pha t ĩ nh. Pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển
trên pha t ĩ nh vớ i tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên
pha t ĩ nh tạo thành sắc đồ. Nếu tiế p tục cho pha động chạy qua thì các chất sẽ
đượ c kéo ra ngoài pha t ĩ nh.
3) Phát hiện các chất. Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không
màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại, detector đặt sau cột. Các detector
phát hiện tín hiệu và xuất hiện peak trên sắc đồ.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 24/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 14
HÌNH 4: SƠ ĐỒ MINH HỌA QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT A VÀ B
HÌNH 5: SƠ ĐỒ MINH HỌA QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT A VÀ B DƯỚ I DẠNG PEAK
III.2. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝLỎNG HIỆU NĂNG CAO
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đờ i vào khoảng 20 năm tr ở lại
đây, nhưng ứng dụng của HPLC đã đi vào nhiều l ĩ nh vực của hóa học phân tích và
chiếm đến gần 70% tổng số các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký. Sử
dụng pha động là chất lỏng, sự tách sắc ký đượ c tiến hành trên cột vớ i áp suất caocho phép hệ thống HPLC có hiệu quả tách cao và ổn định vớ i những hợ p chất khó
bay hơ i.
A
B
tB0 tB1 tB2 tB3 tB4 tB5
A+B
A
B
A
B
A
B
A
Dung dịch mẫu Pha động
detector
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 25/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 15
III.2.1. NGUYÊN TẮC, CẤU TẠO CỦA HỆ THỐNGHPLC:
HÌNH 6: SƠ ĐỒ HỆ THỐNG HPLC
Để thực hiện việc tách một hỗn hợ p chất bằng k ỹ thuật phân tích HPLC,
chúng ta phải có hệ thống trang bị về k ỹ thuật này. Hệ thống trang bị của HPLC đơ n
giản và đủ để làm việc đượ c theo k ỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau
đây:
1. Bơ m cao áp
Để bơ m pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký,
r ửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơ m này phải điều chỉnh
đượ c áp suất (0 – 400 bar), để tạo ra những tốc độ nhất định của
pha động qua cột tách phù hợ p cho quá trình sắc ký nằm trong
vùng 0.5 – 3 ml/phút.
2. Van bơ m mẫu
Để bơ m mẫu phân tích vào cột tách theo những lượ ng mẫu
nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6
chiều có chứa vòng mẫu có thể tích 20, 50 hay 100μl. Van 6 chiều
chỉ có một vòng mẫu nhưng đối vớ i van 10 chiều thì có tớ i 3 vòng mẫu.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 26/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 16
3. Cột tách
Là cột chứa pha t ĩ nh, trái tim của quá trình tách sắc ký,
nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một
hỗn hợ p chất mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tùy
thuộc vào mức độ sắc ký. Nói chung, các cột tách phân tích
thườ ng có kích thướ c chiều dài từ 10 – 25 cm; đườ ng kính
trong từ 2 – 5 mm.
4. Bộ phận pha trộn pha động
Là thiết bị dùng để điều chỉnh chính xác tỷ lệ của các dòng
dung môi tr ướ c khi đượ c đẩy vào cột.
5. Trang bị phát hiện chất phân tích
Đây thườ ng là các Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví dụ:
- Detector hấ p thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV–VIS.
- Detector phổ nguyên tử AES hay AAS.
- Detector phổ huỳnh quang.
- Detector điện hóa (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượ ng).
- Detector chiết suất.
- Detector đo độ dẫn nhiệt…
- Detector diode phát quang và diode mảng.
- Detector đo khối lượ ng (khối phổ: MS).
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 27/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 17
Tất nhiên, phải tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợ p
để đạt đượ c độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như đo định lượ ng chúng.
Trong các loại trên, detector hấ p phụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS, hiện
nay đang đượ c dùng phổ biến nhất, bở i vì nó thích hợ p cho nhiều loại chất và lại
không đắt tiền.
6. Trang bị chỉ thị k ết quả
Ở đây có nhiều loại, nhưng đơ n giản và phổ biến nhất
là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dướ i dạng các
peak của các chất, r ồi đến bộ tích phân k ế (Intergrator), sau đó là
máy tính và máy in kèm theo để xử lý k ết quả và in k ết quả.
Đó là các bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC. Ngày nay, hệ thống HPLC còn có thêm bộ bơ m mẫu tự động và pha loãng mẫu, bộ
gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký, máy tính và các phần mềm điều khiển
toàn bộ hệ thống để xử lý k ết quả tách, in k ết quả tách….
III.2.2. Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP – HPLC)
Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên tính chất hấ p phụ
bề mặt của pha t ĩ nh. Cơ chế tách là cơ chế hấ p phụ. Vì thế, tất cả các tính chất độnghọc hấ p phụ của bề mặt pha t ĩ nh đều có ảnh hưở ng đến k ết quả của sự tách sắc ký
một hỗn hợ p chất mẫu.
U Pha t ĩ nhU:
Pha t ĩ nh của sắc ký hấ p phụ pha ngượ c (RP-HPLC) thườ ng là các silica đã
đượ c alkyl hóa. Nó đượ c điều chế từ các silica trung tính qua việc alkyl hóa các
nhóm -OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl –R của mạch cacbonthẳng (-C B2B, -C B8B,-CB18B) hay các gốc cacbon vòng, như nhân phenyl. Nên chất nhồi loại
này có bề mặt không phân cực hoặc r ất ít phân cực. Việc gắn các gốc alkyl vào phân
tử silica trung tính có thể tr ực tiế p, hay qua một nguyên tố trung gian oxygen. Chính
do bị mất các gốc OH, nên trên bề mặt của chất nhồi loại này là không phân cực hay
r ất ít phân cực. Nên nướ c không có Hypersil ảnh hưở ng đến bề mặt của nó. Về chất
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 28/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 18
nhồi loại này thì có ODS (-C18, Hãng ShADNow), Lichrosorb RP-8, và RP-18
(Hãng Meck),C-18 Corasil, Phenyl-Corasil (Hang Whatmann),…Các chất nhồi loại
này là pha t ĩ nh để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực và
có thể cho cả sắc ký cặ p ion. Dung môi cho pha t ĩ nh loại này là các chất hữu cơ
phân cực tan trong nướ c như: methanol, acetonitrile, hay hỗn hợ p của các chất nàyvớ i nhau hoặc vớ i nướ c theo tỷ lệ nhất định.
U Pha động:U
Pha động của sắc ký hấ p phụ pha ngượ c (RP-HPLC) thườ ng là hệ dung môi
phân cực, nó là những dung môi hữu cơ tan tốt trong nướ c. Trong r ất nhiều tr ườ ng
hợ p, nướ c lại là một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và đượ c dùng khá
phổ biến trong loại hệ pha ngượ c là các dung môi methanol, acetonitrile, hay hỗnhợ p của methanol vớ i nướ c, acetonitrile vớ i nướ c, hay có thêm các chất tạo phức,
chất điện ly, chất đệm pH,… Nói chung các dung môi để pha chế pha động cho hệ
pha ngượ c là nướ c cất, các alcol, các cetone có mạch carbon ngắn, một số acid hay
base hữu cơ , một vài amine hay aminoacid tan tốt trong nướ c.
Chính nhờ có đặc tính trên, cho nên hệ RP – HPLC đượ c sử dụng r ất phổ biến để
tách nhiều loại hỗn hợ p mẫu từ vô cơ đến hữu cơ , từ các chất không phân cực đến
phân cực và k ể cả chất có cấu tạo liên k ết ion như: việc tách các acid, base, các ion
kim loại trong sắc ký cặ p ion.
Trong hệ pha này, thành phần của pha động cũng ảnh hưở ng rõ r ệt đến k ết quả
tách sắc ký. Ở đây, ảnh hưở ng của thành phần pha động làm thay đổi thờ i gian lưu
của chất tan, độ phân giải của hệ pha và chiều cao của peak sắc ký.
Trong hệ RP – HPLC, so vớ i các chất hữu cơ , nướ c là một dung môi phân cực
hơ n. Do đó, sự thêm nướ c vào dung môi hữu cơ là để tạo ra một pha động phân cựchơ n dung môi hữu cơ nguyên một mình nó, mà lại kém phân cực hơ n nướ c. Ngh ĩ a là
pha động này có độ phân cực nằm giữa nướ c và dung môi hữu cơ đó. Ví dụ: thêm
nướ c vào methanol sẽ đượ c một pha động có độ phân cực lớ n hơ n methanol hay
ethanol, nhưng lại nhỏ hơ n nướ c. Tất nhiên độ phân cực lớ n hơ n bao nhiêu là phụ
thuộc vào hàm lượ ng nướ c đượ c thêm vào. Ngh ĩ a là ta tạo ra đượ c một pha động có
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 29/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 19
độ phân cực nằm giữa độ phân cực của hai dung môi đơ n ban đầu. Chính tính chất
này làm cho hệ pha RP – HPLC có tính linh động cao, tạo điều kiện tốt cho sự tách
sắc ký.
Ngoài các dung môi chính như đã nêu ở trên, trong thành phần pha động của
nhiều tr ườ ng hợ p tách vớ i hệ pha ngượ c, còn có thêm chất đệm pH để ổn định pH
cho quá trình sắc ký. Chất tạo phức để tạo ra sự r ửa giải chọn lọc và sự tách tốt hơ n.
Chất điện ly, chất tạo ion cặ p trong sắc ký cặ p ion, để tạo điều kiện cho một cơ chế
sắc ký xảy ra tốt.
U Phân bi ệt S ắc ký pha đảo (RP-HPLC) và sắc ký pha thườ ng (NP-HPLC):
U Pha thườ ng (NP-HPLC)
- Pha t ĩ nh phân cực, pha động ít hoặc
không phân cực.
- Nướ c không tan đượ c vào pha động,
phải bảo hoà pha động tr ướ c khi chạy
Sắc ký bằng nướ c.
- Khả năng phân cực của pha động là ổn
định.
- Không đượ c sử dụng phổ biến, khả
năng tách các hợ p chất phức tạ p kém.
- Trong quá trình Sắc ký, chất tan có độ
phân cực kém sẽ ra tr ướ c.
U
Pha đảo (RP-HPLC)
- Pha t ĩ nh kém phân cực, pha
động là hệ dung môi phân cực.
- Trong r ất nhiều tr ườ ng hợ p nướ c
là thành phần chính của pha
động.
- Khả năng phân cực của pha
động có thể thay đổi (từ phâncực đến không phân cực).
- Đượ c sử dụng phổ biến để tách
các hỗn hợ p mẫu từ r ất phân cực
đến không phân cực.
- Trong quá trình Sắc ký chất tan
kém phân cực sẽ ra sau.
III.3. QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 30/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC
Trang 20
III.3.1. QUÁ TRÌNH TÁCH, CHIẾT LÀM SẠCH MẪU
Là một quá trình tách chiết sơ bộ chất cần phân tích khi đưa vào hệ thống
HPLC, giúp cho mẫu sạch hơ n đồng thờ i làm tăng nồng độ chất cần phân tích. Quá
trình này chiếm tớ i 80% thờ i gian phân tích mẫu phụ thuộc hoàn toàn vào k ỹ năng
của ngườ i phân tích.
III.3.2. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRÊN HỆ THỐNG HPLC
Sau khi mẫu đã đượ c làm sạch và tách sơ bộ, nhờ hệ thống van bơ m mẫu và
dòng dung môi pha động, mẫu sẽ đi vào cột tách. Ngườ i phân tích sẽ lựa chọn pha
động và pha t ĩ nh, detector phù hợ p vớ i bản chất vật lý, hóa học của chất cần phân
tích để cho quá trình tách cũng như sự phát hiện chất phân tích có hiệu quả cao.
III.3.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Detector ghi nhận các tín hiệu tách và biểu diễn dướ i dạng peak sắc ký.
Trong một hệ thống pha động, pha t ĩ nh và tốc độ của pha động giống nhau, mỗi chất
phân tích có một thờ i gian di chuyển qua cột sắc ký nhất định. Khoảng thờ i gian này
đượ c gọi là khoảng thờ i gian lưu và tính từ lúc bơ m mẫu đến khi xuất hiện peak.
Việc phát hiện định tính chất phân tích dựa trên sự so sánh thờ i gian lưu của chất
phân tích vớ i thờ i gian lưu của chất chuẩn trong điều kiện sắc ký của một hệ pha.
Việc tính toán định lượ ng dựa vào chiều cao cũng như diện tích peak sắc ký.(1,14)
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 31/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-GI Ớ I THI Ệ U V Ề KH Ố I PH Ổ
Trang 21
CHƯƠ NG IV. GIỚ I THIỆU VỀ PHỔ KHỐI LƯỢ NGPhổ khối lượ ng đượ c mô tả giống như một thiết bị xác định khối lượ ng nhỏ
nhất trên thế giớ i, không chỉ vì kích thướ c của nó mà còn vì kích thướ c của những
vật thể mà nó cân – những phân tử. Hơ n một thậ p niên gần đây, k ỹ thuật phân tích phổ khối lượ ng đã tr ải qua những sự cải thiện về k ỹ thuật tuyệt vờ i cho phép nó có
thể ứng dụng trong các nghiên cứu về protein, peptide, cacbonhydrate, DNA, thuốc,
và những phân tử sinh học khác. Nhờ có những nguồn ion hóa như ESI (phun
electron), MALDI (ion hóa/giải hấ p bằng nền laser), phổ khối lượ ng đã tr ở thành
công cụ không thể thiếu trong l ĩ nh vực nghiên cứu các đại phân tử.
Phổ khối lượ ng xác định khối lượ ng của một phân tử bằng cách đo tỷ số khối
lượ ng trên điện tích (m/z) của những ion sinh ra từ phân tử đó. Những ion này đượ c phát sinh nhờ một trong hai con đườ ng: làm mất đi hoặc thêm vào một điện tích từ
những mảnh trung hòa. Những ion này đượ c t ĩ nh điện tr ực tiế p trong thiết bị phân
tích khối lượ ng nơ i mà chúng sẽ đượ c tách ra dựa theo tỷ số m/z và đượ c xác định.
K ết quả của quá trình ion hóa phân tử, tách ion và xác định ion là một phổ có thể
cung cấ p những thông tin về khối lượ ng cũng như về cấu trúc của phân tử. Một phổ
như thế có thể đượ c vẽ nhờ vào một máy đo khối lượ ng và một lăng kính đượ c miêu
tả trong hình R7R. Trong lăng kính, ánh sáng đượ c tách ra thành những sóng dài vànhững sóng dài này sau đó đượ c xác định bằng một đầu đọc, ví dụ như đầu đọc khả
kiến. Một cách tươ ng tự, ion phát sinh trong phổ khối lượ ng đượ c tách ra trong thiết
bị phân tích khối lượ ng, đượ c số hóa, đượ c xác định bằng một detector ion.
HÌNH R7R: CƠ CHẾ VẼ PHỔ
NGU N ION
THIẾT BỊ
DETECTOR
NGU N NH S NG
LĂNGK NH
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 32/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-GI Ớ I THI Ệ U V Ề KH Ố I PH Ổ
Trang 22
IV.1. CÁC BỘ PHẬN CỦA PHỔ KHỐI LƯỢ NG
Bốn thành phần cơ bản của phổ khối lượ ng là: lỗ tiêm mẫu, nguồn ion hóa,
bộ phận phân tích khối lượ ng và detector xác định ion. Một vài phổ khối lượ ng có
sự k ết hợ p giữa thiết bị phân tích khối lượ ng và detector trong khi một số khác lại có
sự k ết hợ p giữa lỗ bơ m mẫu và nguồn ion hóa. Những phân tử giống nhau đượ c đưa
vào thiết bị phân tích thông qua lỗ bơ m mẫu. Sau khi vào trong thiết bị, phân tử mẫu
chuyển đổi thành ion trong nguồn ion hóa, sau đó đượ c t ĩ nh điện và đẩy tớ i thiết bị
phân tích khối lượ ng. Những ion này sẽ đượ c tách ra dựa theo tỷ số khối lượ ng trên
điện tích (m/z) của chúng ngay trong thiết bị phân tích khối lượ ng. Detector chuyển
đổi năng lượ ng ion thành những tín hiệu điện, và truyền qua một máy vi tính.
HÌNH R8R: THÀNH PHẦN CỦA MỘT KHỐI PHỔ
Chú ý r ằng nguồn ion hóa không nằm trong vùng chân không của thiết bị. Ví
dụ như, nguồn ion hóa của ESI và APCI đượ c đặt ở áp suất khí quyển.
IV.1.1. NGUỒN ION HÓA
Trong suốt thậ p niên 90 của thế k ỷ XX, ion hóa bằng điện (EI) là nguồn ion
hóa đầu tiên của phươ ng pháp phân tích khối lượ ng. Tuy nhiên, EI bị giớ i hạn ở
những phân tử sinh học và hóa học kích thướ c nhỏ và có vùng khối lượ ng nằm trong
vùng khối lượ ng của những hợ p chất sinh - hữu cơ phổ biến. Giớ i hạn này thúc đẩy
những nhà khoa học như John B. Fenn. Koichi Tanaka, Franz Hillenkamp, Michael
Karas, Graham Cooks, ADN Michael Barber nghiên cứu để tạo ra một k ỹ thuật phát
NGUỒN ION HÓA BỘ PHẬNTÁCH ION
DETECTORXÁC ĐỊNH
ION
LỖ TIÊMMẪU
VÙNG CHÂNKHÔNG
SỐ LIỆU
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 33/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-GI Ớ I THI Ệ U V Ề KH Ố I PH Ổ
Trang 23
sinh ion mớ i, bao gồm bắn phá nhanh nguyên tử để tạo thành ion (FBA), giải hấ p và
ion hóa bằng nền lazer hỗ tr ợ (MALDI), ion hóa phun electron (ESI). Những k ỹ
thuật này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc phân tích những đại phân tử.
Trong số chúng, MALDI và ESI là những phươ ng pháp thườ ng đượ c chọn để phân
tích các đại phân tử.
IV.1.1.1. K Ỹ THUẬT PHUN ION
K ỹ thuật phun điện không phải là một k ỹ thuật mớ i, gần đây nó đượ c quan
tâm tr ở lại nhờ vào những ứng dụng trong nghiên cứu các đại phân tử sinh học.
Những thí nghiệm phun điện đầu tiên đượ c tiến hành bở i Chapman trong nửa cuối
của thậ p niên 30 Thế k ỷ XX và đượ c Dole hoàn tất thực nghiệm để phát triển thành
k ỹ thuật phun electron trong phân tích phổ khối lượ ng vào những năm cuối của thậ pniên 60, Thế k ỷ XX. Dole cũng đã phát hiện ra những hiện tượ ng quan tr ọng về sự
tích nhiều điện tích của các phân tử. Vớ i sự nghiên cứu của Fenn những phát hiện
trên đã tr ở thành những lý thuyết nền tảng của k ỹ thuật phun electron trong phân
tích phổ khối lượ ng ngày nay, nó còn ứng dụng để nghiên cứu các phân tử sinh học
có kích thướ c lớ n.
U Nhữ ng thuận l ợ i và bấ t l ợ i của k ỹ thuật phun electron:U
UThuận lợ i:U
- Sử dụng đượ c vớ i khối lượ ng nằm trong giớ i hạn lên đến trên 70,000
DaRltonsR.
- Đạt độ nhạy cao đến fe RmRtomole (10-15) và có thể đạt đượ c độ nhạy thấ p đặc
tr ưng picomole (10-12).
- Là phươ ng pháp ion hoá dễ làm nhất, có thể tạo ra đượ c những hợ p chất
không cộng hoá tr ị trong pha khí một cách dễ dàng có thể thích ứng vớ i k ỹ
thuật sắc ký lỏng.
- Thích ứng dễ dàng vớ i hệ thống cặ p máy phân tích khối lượ ng sử dụng dụng
cụ bẫy ion hoặc dụng cụ bốn tứ cực.
- Hiện tượ ng tích nhiều điện tích cho phép phân tích đượ c những ion có khối
lượ ng lớ n bằng những dụng cụ có giớ i hạn m/z nhỏ.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 34/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-GI Ớ I THI Ệ U V Ề KH Ố I PH Ổ
Trang 24
- Không có hiện tượ ng nhiễu nền.
UHạn chế:U
- Sự hiện diện của các muối và các tác nhân chứa cặ p ion tự do giống như TFA
có thể làm giảm độ nhạy.
- Những hỗn hợ p phức có thể làm giảm độ nhạy.
- Sự phân tích hỗn hợ p cùng lúc có thể diễn ra không hoàn toàn.
- Hiện tượ ng tích nhiều điện tích có thể gây nhầm lẫn đặc biệt là khi phân tích
hỗn hợ p.
- Độ tinh khiết của mẫu là r ất quan tr ọng.
IV.1.2. BỘ PHẬN PHÂN TÍCH KHỐI LƯỢ NG UT
ứ cự
c:U
- Thiết bị tách ion Tứ cực đã đượ c sử dụng vớ i nguồn ion hóa EI từ những năm
50 của thế k ỷ XX và nó vẫn là thiết bị tách ion phổ biến nhất hiện nay. Thật
thú vị, ngườ i ta tìm thấy trong khả năng của thiết bị tách ion này những ứng
dụng mớ i có thể k ết hợ p vớ i nguồn ion hóa ESI và APCI. Tứ cực mang lại 3
điểm lợ i chính:
- Thứ nhất, chúng phù hợ p vớ i điều kiện áp suất cao.
- Thứ hai, tứ cực có vùng tín hiệu khối lượ ng có thể phân tích những mảnh có
tỷ số khối lượ ng lên đến 4000, điều này r ất có lợ i, bở i vì nguồn ion hóa phun
electron của các phân tử protein và các phân tử có khối lượ ng lớ n thườ ng tạo
ra những sự phân bố điện tích từ m/z 1000 đến 3500.
- Thiết bị tách ion tứ cực thườ ng là những dụng cụ có giá tươ ng đối thấ p.
U Ba t ứ cự c:U
HÌNH R9R: SƠ ĐỒ TÁCH ION CỦA HỆ THỐNG 3 TỨ CỰ C
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 35/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-GI Ớ I THI Ệ U V Ề KH Ố I PH Ổ
Trang 25
Một sự liên k ết của ba tứ cực có thể đượ c sử dụng, còn gọi là hệ thống khối
phổ ba tứ cực.
Tứ cực đầu tiên (Q1) và tứ cực thứ ba (Q3) hoạt động như bộ phận lọc khối
lượ ng, và tứ cực thứ hai (Q2) đượ c sử dụng như một tế bào va chạm. Tế bào va
chạm này chỉ là một tứ cực RF (không phải bộ phận lọc khối lượ ng) sử dụng khíHeli (≈10-3 Torr, ≈3eV) đem lại sự phân tích chọn lọc những mảnh ion từ Q1. Sau
đó những mảnh này đượ c dẫn qua Q3, ở đây chúng có thể đượ c lọc và phân tích một
cách đầy đủ. (15-18)
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 36/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-TRANG THI Ế T B Ị
Trang 26
CHƯƠ NG V. GIỚ I THIỆU CÁC THIẾT BỊ CHÍNHV.1. HỆ THỐNG HPLC AGILENT 1100
HÌNH 1R0R: HỆ THỐNG HPLC AGILENT 1100
Hệ thống HPLC agilent bao gồm:
Bộ phận bơ m mẫu tự động G1313A Bộ phận ngăn cột G1316A
G1322A Degasser Agilent ALS Therm
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 37/94
PH Ầ N N Ộ I DUNG-TRANG THI Ế T B Ị
Trang 27
Hệ thống bơ m G1311A Agilent G1310A Isocratic Pump
G1315 DAD detector G1314A UV detector
V.2. HỆ THỐNG API 3000
HÌNH 1R1R: HỆ THỐNG API 3000 CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM SẮC KÝ
Hệ thống API 3000™ LC/MS/MS là một thiết bị phân tích ion ba tứ cực,
đượ c sử dụng trong các phân tích protein và peptide, những phân tử có khối lượ ng
nhỏ trong các nghiên cứu về dượ c phẩm…(18,19)
HÌNH 1R2R: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ API 3000
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 38/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 28
CHƯƠ NG VI. CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCHDƯ LƯỢ NG MALACHITE GREEN
VI.1. KHÁI QUÁT
Việc xác định chính xác MG trong thực phẩm là vô cùng cần thiết, nhằm bảovệ lợ i ích của cả ngườ i tiêu dùng lẫn các doanh nghiệ p xuất khẩu thủy sản. Vớ i sự ra
đờ i của k ỹ thuật Sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao (HPLC), nhà Hóa học Julie
Kowalski đã áp dụng phươ ng pháp này để xác định dư lượ ng MG và các hợ p chất
chuyển hóa cơ bản của nó, LMG vớ i hệ hấ p phụ pha ngượ c HPLC.
Dựa vào phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và LMG do Julie Kowalski
xây dựng, nhiều phươ ng phá p phân tích khác nhau đã ra đờ i mà sự khác nhau của
chúng chủ yếu là do loại detector sử dụng.
Năm 2003, nhóm nghiên cứu gồm 2 nhà khoa học Aldert . A. Bergwerff và
Peter Scherpenisse đã đưa ra một phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và hợ p chất
chuyển hóa LMG trong động vật thủy sinh bằng Sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao
(HPLC) sử dụng detector hấ p thu quang vùng khả kiến (Vis).
Do MG có cực đại hấ p phụ ở 620 nm và LMG hấ p phụ ở 265 nm, điều này
gây ra khó khăn trong việc quan sát cả hai trong phép đo hấ p phụ. Vì vậy, tr ướ c khi
xác định ở bướ c sóng 620 nm, dung môi r ửa giái đượ c dẫn qua một lò phản ứng oxy
hóa hậu cột chứa PbO2 và Celite vớ i tỷ lệ 3:1 về khối lượ ng để chuyển hóa LMG
không màu thành dạng MG có màu.
Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp này là 1 ppb cho cả MG và LMG. Trong
phươ ng pháp của mình, Aldert . A. Bergwerff và Peter Scherpenisse đã sử dụng lò
phản ứng hậu cột chứa PbO2 và celite để chuyển hóa LMG thành MG, điều này đòi
hỏi thể tích dung dịch phân tích, thể tích dung môi khá lớ n và những bướ c chuẩn bị mẫu phức tạ p.
Để khắc phục những hạn chế trên, nhóm nghiên cứu gồm
Wendy.C.ADNersen; Jose.E.Roybal; Sherr.B.Twrnipseed cũng đưa ra phươ ng pháp
xác định tổng dư lượ ng MG và LMG bằng HPLC-Vis, nhưng sử dụng sự oxy hóa tại
chổ để chuyển LMG thành MG: LMG đượ c chuyển hóa thành MG thông qua phản
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 39/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 29
ứng vớ i 2,3 dicloro-5,6-dicyano-1,4 benzoquinon (DDQ). Sử dụng phản ứng oxy
hóa tại chỗ LMG thành MG bằng DDQ đã loại tr ừ sự cần thiết phải sử dụng lò phản
ứng oxy hóa hậu cột, đồng ngh ĩ a vớ i việc loại bỏ những hạn chế do lò phản ứng này
đem lại. Nhóm nghiên cứu nhận thấy chỉ cần sử dụng 3 ml 0,001 M DDQ, thì 100%
LMG sẽ đượ c chuyển hóa thành MG.Phươ ng pháp này đòi hỏi quá trình oxy hóa LMG thành MG sau đó MG tổng
sẽ đượ c xác định bằng detector hấ p thụ ánh sáng vùng khả kiến phân tích ở bướ c
sóng 618 nm. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp này cũng là 1 ppb.
Cả hai phươ ng pháp phân tích tổng dư lượ ng MG và LMG bằng HPLC-Vis
đều có một nhượ c điểm chủ yếu là chỉ có thể xác định tổng dư lượ ng MG và LMG,
không định lượ ng đượ c nồng độ riêng của từng chất trong dung dịch ban đầu. Hạn
chế này có thể đượ c khắc phục nếu chúng ta ghép thêm 1 detector phát phổ huỳnh
quang vào đườ ng dẫn dung môi r ửa giải thay cho lò phản ứng hậu cột, để phát hiện
ra LMG bở i sự kích thích sự phát xạ ở 265 nm và sự phát xạ ở 360 nm. Tuy nhiên
giải pháp này có sự hạn chế là vớ i 2 detector phát hiện thì hệ thống r ất cồng k ềnh và
tốn kém.
Năm 2004, nhóm nghiên cứu Luise Valle, Cecilia Diaz, Antonio.L Zanocio
và Pablo Richter đã phát triển phươ ng pháp xác định tổng dư lượ ng MG và LMG
lên một bướ c cao hơ n vớ i việc sử dụng HPLC-APCI-MS. Sơ đồ của hệ thống đượ c
giớ i thiệu như sau:
Sự sử dụng detector MS đã đem lại một k ết quả tuyệt vờ i: đẩy giớ i hạn phát
hiện tổng MG và LMG lên 0.15 ppb. Hiệu suất thu hồi của một mẫu thêm chuẩn vớ i
nồng độ 2 kg g / là 85% và 70% tươ ng ứng vớ i LMG và MG, độ sai số tươ ng đối là
1,3% và 3,1 %.
Cột LC APCI MS
Van bơ m mẫu
Pha động
Bơ m áp suất thườ ng
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 40/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 30
Phươ ng pháp phân tích do nhóm Luise Valle, Cecilia Diaz, Antonio.L
Zanocio và Pablo Richter đưa ra có hai ưu điểm so vớ i các phươ ng pháp đượ c giớ i
thiệu tr ướ c đó:
- Tăng giớ i hạn phát hiện lên đến 0,15 ppb.
- Định lượ ng đượ c cả MG và LMG trong mẫu phân tích.
Như vậy, vớ i việc sử dụng detector MS 1 tứ cực, nguồn ion hóa ở áp suất
thườ ng (APCI), nhóm nghiên cứu đã phát triển phươ ng pháp phân tích tổng dư
lượ ng MG lên một trình độ cao hơ n.
Sự phát triển vượ t bậc của các k ỹ thuật cũng như các thiết bị phân tích làm
cho các nướ c có nền khoa học phát triển ngày càng hạ thấ p giớ i hạn cho phép của
các loại thuốc kháng sinh, đặc biệt là MG trong thực phẩm. Ví dụ, giớ i hạn cho phép
của MG trong thực phẩm ở Canada đã xuống tớ i mức 0,5 ppb. Nó tạo ra 1 cuộc đua
không có điểm dừng giữa giớ i hạn phát hiện của các phươ ng pháp phân tích vớ i giớ i
hạn cho phép của các hóa chất trong thực phẩm.
Nhóm nghiên cứu gồm các nhà khoa học Jeffrey M. VADNe Riet, Cory J.
Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A. Potter và B. Garth Burns đã tiến hành nghiên
cứu xác định dư lượ ng MG và LMG trong sản phẩm thủy sản bằng Sắc ký lỏng cao
áp hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC – LC/MS-MS), sử dụng nguồn ion hóa phun
ion (ESI) và bộ phận tách ion ba tứ cực (triquapole).
MG và hợ p chất chuyển hóa cơ bản của nó, LMG đượ c chiết từ những mẫu
đồng nhất. Sau quá trình chiết sử dụng dung dịch đệm McI1vaine và acetonitrile,
dịch chiết đượ c làm tinh khiết bở i một cột chiết pha r ắn (SPE) có gắn acid sulfonic.
Sau khi chuyển hóa LMG thành MG bở i lò phản ứng oxy hóa hậu cột chứa PbO2,
dung dịch r ửa giải đượ c phân tích bằng hệ thống detector MS-MS. Vớ i sơ đồ hệ
thống như sau:
Dịchchiết
Cột LC Lò oxy hóa hậu cột ESI MS/MS
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 41/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 31
Độ thu hồi trong khoảng 81% đối LMG và 98% đối vớ i MG cho những mẫu
đượ c thêm chuẩn 1 ng/g đối vớ i cả MG và LMG thu đượ c một cách dễ dàng khi sử
dụng phươ ng pháp trên.
Nhìn một cách tổng quát, phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và LMG bằng
LC/ESI/MS-MS có khá nhiều ưu điểm so vớ i các phươ ng pháp khác:- Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp lên đến 0,1 ppb, giớ i hạn này thỏa mãn
tất cả các yêu cầu về dư lượ ng MG tối thiểu trong thực phẩm của tất cả các
quốc gia, ví dụ như các quốc gia Châu Âu là 2 ppb, Canada là 0,5 ppb.
- Thể tích mẫu cho mỗi lần phân tích r ất ít, chỉ khoảng 10 l .
- Độ thu hồi của các mẫu thêm chuẩn cao và ổn định.
- Khả năng phân tích nhanh, độ tin cậy cao.
- Phươ ng pháp phân tích đơ n giản.
- Có thể xác định đượ c cả nồng độ của MG, LMG trong mẫu phân tích ban
đầu.
- Không đòi hỏi quá trình chuẩn bị mẫu phức tạ p.
Vớ i tất cả những ưu điểm trên, phươ ng pháp này đã đượ c chúng tôi chọn làm
phươ ng pháp tham chiếu cho đề tài của mình. Tuy nhiên, do điều kiện về trang thiết
bị cũng như dụng cụ, hóa chất của phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ môn Dinh Dưỡ ng
và Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Tr ườ ng Đại Học Cần Thơ , chúng tôi không
thể nào áp dụng tr ực tiế p phươ ng pháp trên mà chỉ có thể chuẩn hóa phươ ng pháp
bằng những điều kiện hiện có, hy vọng vớ i những trang thiết bị đó, chúng tôi có thể
đưa ra đượ c một phươ ng pháp có độ nhạy và độ tin cậy tươ ng đươ ng vớ i phươ ng
pháp của Jeffrey M. VADNe Riet, Cory J. Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A.
Potter và B. Garth Burns. Và biết đâu, vớ i sự nỗ lực của nhóm nghiên cứu cộng vớ i
1 chút may mắn, chúng tôi có thể chuẩn hóa đượ c một phươ ng pháp có giớ i hạn pháthiện cao hơ n cả giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp tham chiếu (LOD = 0,1 ppb đối
vớ i đườ ng chuẩn và LOD = 0,3 ppb đối vớ i các mẫu phân tích định lượ ng). Mọi khả
năng đều có thể xảy ra (20-23).
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 42/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 32
VI.2. GIỚ I THIỆU PHƯƠ NG PHÁP THAM CHIẾU
XÁC ĐỊNH MALACHITE GREEN VÀ LEUCO-MALACHITEGREEN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THUỶ SẢN BẰNG SẮC
KÝ LỎNG CAO ÁP GHÉP CẶP KHỐI PHỔ (LC/MS-MS)
UTÓM T Ắ T UPhươ ng pháp sắc ký lỏng ghép cặ p khối phổ (LS/MS-MS) đượ c phát triển để
xác định dư lượ ng MG và LMG trong một số loại mẫu. MG và sản phẩm trao đổi
chất của nó đượ c chiết từ những mẫu đồng nhất bằng dung dịch HClO B4B:MeCNR, Rvớ i
dung dịch đệm NH B4BOH: FA trong gradient nồng độ của MeCN. Dịch chiết đượ c ly
tâm và chia thành những phần bằng nhau, mỗi phần đượ c cô đặc và dẫn qua 1 cột
chiết pha r ắn liên k ết hóa học CB18B. Hỗn hợ p đượ c r ửa giải vớ i MeCN, sau đó làm
khô bằng cách cho bay hơ i, phần cặn đượ c hoà tan trong MeCN và pha loãng vớ i
nướ c cất, chuẩn bị cho quá trình phân tích.
Đườ ng cong chuẩn độ nối giữa các điểm phân tíchR có nồng độR từ 5 đến 500
pg đượ c tiêm vào tất cả các mẫu phân tích, vớ i hiệu suất thu hồi giớ i hạn từ 81% đối
vớ i LMG và 98% đối vớ i MG trong mẫu cá hồi ở nồng độ 1 ng/g.R
Giớ i hạn phát hiện là 0,1 ng/g cho cả MG và LMG (đườ ng chuẩn) thu đượ c
một cách dễ dàng khi sử dụng phươ ng pháp trên. Lỗi hệ thống, các yếu tố nhiễu vàhiệu suất thu hồi của mẫu thêm chuẩn đượ c so sánh vớ i các thông số tươ ng ứng thu
đượ c bở i những phươ ng pháp đã đượ c thiết lậ p. Phươ ng pháp trên đơ n giản, nhanh
chóng, và đặc biệt dùng để xác định dư lượ ng của MG và LMG trong nhiều loại
mẫu.
Việc kiểm tra dư lượ ng hoá chất dùng để tr ị bệnh tr ong các sản phẩm cá nuôi
là một phần thiết yếu của chươ ng trình “rào cản chất lượ ng” đượ c thiết lậ p bở i cơ
quan kiểm tra thực phẩm Canada. Những phươ ng pháp nhanh và nhạy phải thật sự kiểm tra đượ c dư lượ ng của những chất này và bảo vệ ngườ i tiêu dùng tránh khỏi
nguy cơ bị đột biến, tạo điều kiện thuận lợ i cho quá trình thươ ng mại. Phát triển một
k ỹ thuật kiểm tra phân tích vừa đơ n giản vừa nhanh chóng r ẻ tiền để định lượ ng cả
MG và LMG là một điều đang đượ c mong đợ i, vì cả hai hợ p chất trên có thể cùng
tồn tại trong cơ thể của những động vật vừa đượ c xử lý hoá chất.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 43/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 33
Một số phươ ng pháp phổ biến khác có thể xác định MG và những hợ p chất
chuyển hoá của chúng. Đa số các phươ ng pháp phân tích đều sử dụng Sắc ký lỏng
cao áp ghép vớ i detector vùng khả kiến (LC/Vis) và lò oxy hoá hậu cột chứa PbOB2B.
Mặc dù những phươ ng pháp này cung cấ p độ nhạy thích hợ p (giớ i hạn phát hiện là
gần 0,5 ng/g) nhưng chúng không mạnh và thiếu độ tin cậy so vớ i k ỹ thuật phổ khốilượ nRgR (MS).
Đa số phươ ng pháp đều cần 1 cột chiết pha r ắn tươ ng đối dài dùng để làm
sạch gồm những pha cố định khác nhau. Mặc dù loại làm sạch này có thể khá ảnh
hưở ng, mất thờ i gian, đắt tiền và có thể có vấn đề khi sử dụng chất hấ p phụ của
nhiều nhà sản xuất khác nhau.
Mục đích của việc nghiên cứu là phát triển 1 phươ ng pháp nghiên cứu, phân
tích LC/MS thông thườ ng, hiệu quả cho việc xác định đồng thờ i dư lượ ng MG và
LMG trong một số loại mẫu ở giớ i hạn phát hiện bằng hoặc dướ i 0,5 ng/g như yêu
cầu của Canada. Phươ ng pháp đượ c giớ i thiệu ở đây sử dụng cặ p khối phổ MS/MS
để làm giảm sự cần thiết phải làm sạch mẫu và cung cấ p một phươ ng pháp chuyên
biệt, nhanh chóng, chi phí thấ p, nhạy và chính xác để xác định cả MG lẫn LMG.
UTHÍ NGHI Ệ M U
Dụng cụ
- LC column – Luna C18, 5 µm, 15 cm * 2 mm, reversed phase.
- LC system:
• Quaternary pump system.
• Autosampler.
• Column oven.
- Detector MS/MS.
- Tube rotator.
- SPE column – Strata C18-E (50 µm, 70 A), 500 mg/ 3 mL.
Tác chấ t
- Nướ c cất (DIW).
- Acetonitril (MeCN).
- HClO B4B 60%
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 44/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 34
- Dung dịch Acidic actonitril:
• 0,8 ml HClOB4B + MeCN = 1L- CH B2BClB2. B
- Formic acid (FA) 90%
-
Dung dịch NHB
3B
28 - 30%- Malachite Green (MG)
- Leuco-Malachite Green (LMG)
- Stock solution: 100 )/( mL g
• Hòa tan 10 mg MG và LMG trong bình định mức thể tích 100 ml và
pha loãng đến vạch bằng MeCN.
• Giữ trong bóng tối ở nhiệt độ 4ºC
• Bảo quản trong thờ i gian không quá 2 tuần.
- Mixed Standard: 2 )/( mL g
• Hút 2 ml chuẩn nguyên liệu vào bình định mức thể tích 100 ml, pha
loãng đến vạch bằng MeCN.
• Giữ trong bóng tối ở nhiệt độ 4ºC.
• Bảo quản trong thờ i gian không quá 2 tuần.
- Working standard : 100 )/( mL g η
• Hút 5 ml chuẩn tr ộn cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến
vạch bằng MeCN.
• Giữ trong bóng tối ở nhiệt độ 4ºC.
• Bảo quản trong thờ i gian không quá 2 tuần.
- LC mobile phase modifer:
• 40 mM NH B4BOH + 500 mM FA.
• Pha loãng 3 ml NH B3B 25% và 23 g dung dịch 90% FA đến thể tích 1L bằng nướ c cất.
- LC solvent A:
• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)
tỷ lệ (10:90).
- LC solvent B:
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 45/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 35
• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)
tỷ lệ (90:10).
Chuẩ n b ị mẫ u
Mẫu cá da tr ơ n như cá Hồi và cá Tr ầu đượ c sử dụng trong nghiên cứu này,
chúng đượ c lấy từ các quy trình nuôi thủy sản công nghiệ p đượ c Liên bang bảo đảmvề chất lượ ng. Tôm và Tilapia đượ c sử dụng là những sản phẩm nội địa, thu từ các
hoạt động kiểm tra mẫu thông thườ ng. Cá đượ c chuẩn bị theo phươ ng pháp AOAC
937,07 (11), đượ c giữ lạnh và gửi tớ i phòng thí nghiệm. Mẫu đượ c lột da, làm tan,
mô cơ đượ c tr ộn cho đến khi đồng nhất bằng máy gia công thức ăn. Mẫu tôm đượ c
bóc vỏ và tr ộn cho đến khi đồng nhất. Những loại mẫu khác như cá trê đượ c xử lý
tươ ng tự như trên. Mẫu đượ c bảo quản ở nhiệt độ -20ºC cho đến khi phân tích.
Quá trình chi ế t
- Cân chính xác 4 g mẫu đồng nhất cho vào ống ly tâm nhựa thể tích 50 ml.
- Thêm vào 16 ml HCLOB4B/MeCN và làm đồng nhất hỗn hợ p trong ống bằng
máy tr ộn.
- Pha loãng đến vạch 25 ml bằng CHB2BClB2B và tr ộn trong ống quay vớ i thờ i gian
10 phút.
- Ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 10 phút.
- Chuyển phần thể tích 10 ml của lớ p trên vào ống thủy tinh và làm bay hơ i
đến 2 ml bằng cách thổi khí N B2B ở nhiệt độ dướ i 45ºC.
- Đưa phần dịch chiết thu đượ c sau quá trình cô đặc qua 1 cột SPE đã đượ c làm
ẩm vớ i 2 ml MeCN và thu phần nướ c tháo vào ống.
- R ửa ống 2 lần vớ i 2 ml MeCN và cho qua cột, hòa lẫn vào dung môi r ửa giải.
Tốc độ dòng qua cột từ 2 đến 5 ml/phút.
- Làm bay hơ i hỗn hợ p dung môi đến khô bằng cách thổi khí NB
2B ở nhiệt độ
dướ i 45ºC.
- Hòa tan cặn trong 500 l MeCN và tr ộn trong máy tr ộn xoáy.
- Pha loãng dung dịch chiết vớ i 500 l nướ c cất, tr ộn và lọc qua 1 syringe có
đườ ng kính các lỗ là 0,2 m ; lọc tr ướ c khi phân tích.
Chuẩ n b ị chuẩ n nền
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 46/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 36
Dịch chiết mẫu tr ắng đượ c kiểm tra tr ướ c đó và xác định là mẫu tr ắng đượ c
chuẩn bị như trên. Ư u tiên sử dụng MeCN, thể tích chuẩn tr ộn, MeCN và nướ c cất
đượ c thêm vào phần chứa dư lượ ng. Chuẩn nền đượ c tr ộn trong máy tr ộn xoáy và
lọc tr ướ c khi phân tích.
Dãy chuẩ nThể tích của chuẩn làm việc, MeCN, và DIW để tạo nên dãy chuẩn đượ c trình bày
trong bảng dướ i đây:
MG-LMG
)/( mL g η
Thể tích
chuẩn làm
việc
( l )
Thể tích
của
MeCN
( l )
Thể tích
nướ c cất
( l )
0 0 500 5000,5 10 990 1000
2 20 480 500
10 100 400 500
50 500 0 500
U H Ệ TH Ố NG LC:U
Hệ thống LC đượ c làm cân bằng trong thờ i gian bằng hoặc hơ n 30 phút ở
nhiệt độ cột lò khoảng 35ºC sử dụng dung dịch B chảy vớ i vận tốc dòng 0,25ml/phút. Hệ thống đượ c giữ trong 1 phút vớ i dung môi B 30%, sau đó sử dụng dãy
gradient nồng độ của dung môi B từ 30% đến 100% trong thờ i gian 7 phút, 1 lần vớ i
dung dịch B 100% tốc độ dòng 0,4 ml/phút trong thờ i gian trên 3 phút.
- Hệ thống đượ c giữ trong 10 phút vớ i dung môi B nồng độ 100%, sau đó quay
lại sử dụng dung môi B nồng dộ 30% trong thờ i gian 1 phút.
Detector MS/MS đượ c đặt ở những điều kiện như sau:
• Ion mode ES+
• Capillary: 2,5 kV.
• Cone voltages: extractor 5.0 V
• RF lens 0,3 V.
• Source temperature 100ºC.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 47/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 37
• Desolvation temperature 400ºC.
• NB2 Bcone gas flow 50 L/h.
• NB2B desolvation gas flow: 400 L/h.
• Argon collision gas presure: 3,78*10 P
-3P mbar.
Thông số của MS đượ c trình bày ở bảng sau:
RCOMPOUNDR RMASS TRANSITIONR
RCONE
VOLTAGE
(V)
RCOLLISION
ENERGY R(V)
329>313,4 60 40MG
329>165,3 50 70
331,0>239,4 35 35LMG
331,0>315,6 35 20
- Tiêm 1 phần thể tích 10 l mẫu, kiểm tra mẫu thêm và mẫu tr ắng. Xây dựng
1 đườ ng đồ thị đo độ cao peak ban đầu ứng vớ i lượ ng chuyển hóa thu đượ c
so sánh vớ i nồng độ của dung dịch tiêm.
- Tính nồng độ của MG và LMG trong dịch chiết bằng phép nội suy từ đườ ng
chuẩn. Sau đó từ tỷ số ion trong khoảng riêng biệt, giá tr ị ng/ml của MG hoặc
LMG trong khối lượ ng mẫu chiết và hệ số pha loãng để tính ra giá tr ị ng/g
trong mẫu.
UK ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:U
MG và LMG đượ c tách ra khỏi nhau một cách dễ dàng và đượ c r ửa giải hoàn
toàn vớ i cột Luna CB18B (15 cm – 20 mm) trong thờ i gian dướ i 25 phút, sử dụng đườ ng
Gradient nồng độ của dung dịch B (từ 30 đến 100%) vớ i tốc độ dòng là 0,25
mL/phút. Đườ ng chuẩn hóa đượ c nối giữa các điểm có nồng độ từ 5 đến 500 pg
đượ c tiêm vào trong cột, tươ ng ứng vớ i nồng độ 0,5 và 30 ng/g trong mẫu. Hệ số
tươ ng quan của đườ ng chuẩn trong khoảng 0,999. Đườ ng cong chuẩn độ của MG và
LMG là r ất giống nhau. Sự bảo quản đườ ng chuẩn gặ p r ất nhiều khó khăn, chuẩn
làm việc bị thoái biến r ất nhanh và nên giữ trong tối, ở nhiệt độ 4 P
0PC, trong thờ i gian
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 48/94
GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH
Trang 38
không quá 2 tuần. Chuẩn nguyên liệu cũng đượ c bảo quản trong điều kiện tươ ng tự
vớ i thờ i gian không quá 2 tháng.
Giớ i hạn phát hiện (LOD) của cả MG và LMG trong chuẩn nền tr ắng dựa
trên thờ i gian lưu của hợ p chất là 0,1 ng/g. Giớ i hạn định lượ ng là 0,3 ng/g cho tất cả
các mẫu kiểm tra.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 49/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 39
RPHẦN THỰ C NGHIỆM
CHƯƠ NG VII. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH PHÂNTÍCH DƯ LƯỢ NG MG VÀ LMG
Mục đích là dựa vào các phươ ng pháp phân tích tham chiếu đượ c trình bày ở
trên, xây dựng một phươ ng pháp phân tích phù hợ p vớ i trang thiết bị và những điều
kiện hiện có tại phòng thí nghiệm Sắc ký Khoa Thủy Sản để tiến hành những nghiên
cứu về Malachite Green nói riêng cũng như thuốc kháng sinh dùng trong nuôi tr ồng
thủy sản nói chung.
PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH MG VÀ LMG ĐƯỢ C
XÂY DỰ NG CHO PHÒNG PHÂN TÍCH SẮC KÝ- BỘ MÔN DINH DƯỠ NG KHOA THỦY SẢN, ĐẠI HỌCCẦN THƠ
VII.1. NGUYÊN TẮC
Mẫu cá sau khi đượ c rã đông, sẽ tiến hành spike chuẩn (tiêm chuẩn vào mẫu)
bao gồm cả MG và LMG ở những nồng độ đượ c chuẩn bị từ tr ướ c. Sau đó thực hiện
quy trình tách chiết mẫu bằng dung dịch HClOB
4B
:MeCN. Dịch chiết đượ c ly tâm vàchia thành những phần bằng nhau, mỗi phần đượ c cô đặc và dẫn qua 1 cột chiết pha
r ắn liên k ết hóa học CB18B. Hỗn hợ p đượ c r ửa giải vớ i MeCN, sau đó làm khô bằng
cách cho bay hơ i, phần cặn đượ c hoà tan trong MeCN và pha loãng vớ i nướ c cất,
chuẩn bị cho quá trình phân tích.
Do thờ i gian không cho phép, nên trong thí nghiệm này, sinh viên làm luận
văn chỉ có thể tiến hành tách chiết và tính hiệu suất thu hồi đối vớ i các mẫu đượ c
thêm chuẩn, k ết quả của thí nghiệm chủ yếu đượ c thể hiện ở k ết quả hiệu chỉnh hệ thống phân tích, k ết quả xác định giớ i hạn phát hiện của hệ thống, hiệu suất thu hồi
của phươ ng pháp cũng như đượ c thể hiện ở những hình phổ thu đượ c.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 50/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 40
VII.2. CÁC THÍ NGHIỆM ĐƯỢ C TIẾN HÀNH
Dụng cụ - Cột Higgingn Analytical, Iic-USA Clipews C18 5 m 150 cm * 2,1 mm
P/N CS-1521-C185
S/N 127641
- LC system:
• Quaternary pump system.
• Autosampler.
• Column oven.
- Detector MS/MS.
- Tube rotator.
- SPE column – Strata C18-E (50 µm, 70 A), 500 mg/ 3 mL.
Tác chấ t
- Nướ c cất (DIW).
- Acetonitril (MeCN).
- HClO B4B 60%
- Dung dịch Acidic actonitril: 0,8 ml HClO B4B + MeCN = 1L
- CH
B
2B
ClB
2.B
- Formic acid (FA) 100%
- Dung dịch NH B3B 25%
- Malachite Green (MG)
- Leuco-Malachite Green (LMG)
- Stock solution: 100 )/( mL g
• Hòa tan 10 mg MG và LMG trong bình định mức thể tích 100 ml và
pha loãng đến vạch bằng MeCN.
• Giữ trong bóng tối ở nhiệt độ 4ºC.
• Bảo quản trong thờ i gian không quá 2 tuần.
- Working standard : 100 )/( mL g η
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 51/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 41
• Hút 5 ml chuẩn tr ộn cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến
vạch bằng MeCN.
• Giữ trong bóng tối ở nhiệt độ 4ºC.
• Bảo quản trong thờ i gian không quá 2 tuần.
- LC mobile phase modifer:
• 40 mM NH B4BOH + 500 mM FA.
• Pha loãng 3 ml NH B3B 25% và 23 g dung dịch 90% FA đến thể tích 1L
bằng nướ c cất.
- LC solvent A:
• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)
tỷ lệ (10:90).
- LC solvent B:
• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)
tỷ lệ (90:10).
VII.2.1. HIỆU CHỈNH HỆ THỐNG PHÂN TÍCHUMục đích của thao tác hiệu chỉnh hệ thống (Optimize hệ thống)U
Có thể nói đây là công việc khó khăn và mất nhiều thờ i gian nhất trong quá
trình tiến hành đề tài. Hệ thống LC-MS/MS (HỆ THỐ NG HPLC AGILENT 1100
và HỆ THỐ NG API 3000™ LC/MS/MS) là hệ thống phân tích Sắc ký vừa đượ c
trang bị cho Bộ môn Dinh Dưỡ ng Khoa Thủy Sản trong thờ i gian không lâu. Vì đây
là trang thiết bị thuộc loại hiện đại và tiên tiến nhất không chỉ đối vớ i nướ c ta mà ở
cả các quốc gia có nền khoa học phát triển, nên việc sử dụng thành thạo các trang
thiết bị này để đạt hiệu quả cao nhất mà chúng có thể đem lại là nằm ngoài khả năng
của chúng ta. Bên cạnh đó, phân tích dư lượ ng MG và LMG trong các sản phẩm
thủy sản lại là đề tài đầu tiên sử dụng hệ thống hiện đại này, vì thế không có các
thông số k ỹ thuật của chúng để cho chúng ta tham khảo như các quy trình phân tích
do AOAC xây dựng. Do đó, việc optimize hệ thống LC-MS/MS là một yêu cầu bắt
buộc không thể bỏ qua.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 52/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 42
Tóm lại, mục đích để optimize hệ thống HPLC cũng như khối phổ MS/MS là
nhằm tìm ra các thông số k ỹ thuật của các trang thiết bị này để phát huy tối đa khả
năng mà chúng có thể đạt đượ c, đẩy giớ i hạn phát hiện cũng như độ nhạy khi phân
tích dư lượ ng MG và LMG lên mức tối đa.
UCách tiến hành hiệu chỉnh hệ thống:U
- UOptimize hệ thống MS/MS:
Nói một cách ngắn gọn, để optimize hệ thống MS/MS ta làm như sau:
• Tiêm chuẩn tr ực tiế p vào hệ thống để phân tích mà không cần phải qua
cột tách LC.
• Để cho hệ thống tự động chọn các thông số k ỹ thuật để tiến hành đo
phổ của các chuẩn.
• Sau khi hệ thống MS/MS hoàn tất quá trình đo phổ, ta thu đượ c một
bảng k ết quả thông báo về các thông số k ỹ thuật của hệ thống và độ
nhạy của quá trình phân tích tươ ng ứng vớ i các thông số k ỹ thuật ấy.
• Tiến hành hàng loạt các thí nghiệm đo phổ của các chất chuẩn cho đến
khi tìm đượ c một bộ các thông số k ỹ thuật của hệ thống MS/MS cho
độ nhạy cao nhất và ổn định nhất.
- UOptimize hệ thống HPLC:
Sau khi có đượ c bộ thông số k ỹ thuật thích hợ p nhất đối vớ i hệ thống
MS/MS, chúng ta sẽ tiến hành optimize hệ thống HPLC:
• Cho chuẩn qua cột tách LC.
• Để cho hệ thống HPLC tự động chọn chế độ phối tr ộn dung môi pha
động (Gradient pha động) để r ửa giải chất phân tích khỏi cột LC.
• Tiến hành hàng loạt các thí nghiệm r ửa giải chất chuẩn khỏi cột cho
đến khi tìm đượ c một Gradient pha động cho k ết quả phân tích tốtnhất.
Để quý thầy cô có thể hình dung đượ c công việc hiệu chỉnh hệ thống phân
tích, em xin đưa ra các bảng số liệu thu đượ c của 2 ngày làm việc (trong tổng số gần
2 tháng hiệu chỉnh hệ thống) để hiệu chỉnh hệ thống MS/MS phân tích LMG. Trung
bình 1 ngày, tiến hành khoảng 5 đến 10 thí nghiệm tiêm mẫu.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 53/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 43
WEDNESDAY- Wednesday, May 09, 2007, 10:09 (BẢNG SỐ LIỆU NGUYÊN BẢN)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)
Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 8 peaks. Build final method using 2 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.863Initial Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.859 107700
Parameter: DP Start: 1.0 Stop: 101.0 Step: 5.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.859 80.0 76.0 139778
Parameter: FP Start: 50.0 Stop: 375.0 Step: 10.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.859 400.0 60.0 245876
Parameter: DP Start: 1.0 Stop: 101.0 Step: 5.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.859 76.0 86.0 129306
Parameter: FP Start: 50.0 Stop: 375.0 Step: 10.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.859 60.0 90.0 112085
Final Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.889 84360
Final Q1MI Method: LeucoMG_QOpt_FinalQ1MI_Pos.dam
Target Compound: LeucoMG
Initial Product Mass Initial Product Ion Intensity(cps) (26 MCA Sum)239.165 54000165.124 26000
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 54/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 44
316.158 19000223.188 17000152.085 15000153.212 13000194.363 11000180.145 10000
Parameter: CE Start: 5.0 Stop: 130.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/152.085 50.0 125.0 1360330.889/153.212 50.0 105.0 1030330.889/165.124 50.0 93.0 2172330.889/180.145 50.0 91.0 1133330.889/194.363 50.0 61.0 2033330.889/223.188 50.0 73.0 4130330.889/239.165 50.0 47.0 15667330.889/316.158 50.0 31.0 6568
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/152.085 13.0 8.0 1563
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/153.212 13.0 14.0 1112
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/165.124 13.0 30.0 1490
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/180.145 13.0 12.0 818
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/194.363 13.0 16.0 1600
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/223.188 13.0 22.0 3210
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 55/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 45
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/239.165 13.0 16.0 16167
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/316.158 13.0 22.0 8960
Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 13780 (điểm để sosánh giữ a các thí nghiệm hiệu chỉnh)
Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 10:14 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 12110 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 10:16 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.819Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 8290Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 10:25 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positive
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 56/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 46
Precursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolution
LeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.829Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 13660
Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 10:39 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.825Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 20880Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 10:42 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.810Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 12170Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 10:45 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 57/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 47
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.
Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.836Optimal Product Ion Mass: 313.100 Optimal Product Ion Intensity: 29020Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 10:53 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.818Optimal Product Ion Mass: 313.100 Optimal Product Ion Intensity: 41800Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 14:56 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.862Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 7270Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 58/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 48
- Wednesday, May 09, 2007, 15:03 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)
Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.849Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 11950Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 15:08 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.851Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 17580 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Wednesday, May 09, 2007, 17:00 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.861Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 69180
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 59/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 49
Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
THURSDAY - Thursday, May 10, 2007, 10:31(BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.867
Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 34960 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 10:43 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.841Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 45780 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 10:54 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.640
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 60/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 50
Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 43780 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 11:01 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative Optimization
MS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.829Optimal Product Ion Mass: 239.000 Optimal Product Ion Intensity: 48380Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 14:11 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.804Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 127330 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 14:27 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.799Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 17340
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 61/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 51
Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 14:30 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positive
Precursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.805Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 27060 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 14:35 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)
Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolution
LeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.813Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 28810Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 15:49 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 62/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 52
base peak ion mass: 330.856Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 113470 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
-
Thursday, May 10, 2007, 15:58 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.813Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 124080 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 16:14 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.811Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 146200 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 16:18 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 63/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 53
base peak ion mass: 330.836
Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 152600Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
- Thursday, May 10, 2007, 16:32 (BẢNG SỐ LIỆU NGUYÊN BẢN)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.827Initial Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.818 1174660
Parameter: DP Start: 1.0 Stop: 101.0 Step: 5.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.818 80.0 66.0 1066133
Parameter: FP Start: 50.0 Stop: 375.0 Step: 10.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.818 400.0 330.0 1132550
Parameter: DP Start: 1.0 Stop: 101.0 Step: 5.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.818 66.0 66.0 1032890
Parameter: FP Start: 50.0 Stop: 375.0 Step: 10.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.818 330.0 340.0 1135316
Final Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.809 1033720
Final Q1MI Method: LeucoMG_QOpt_FinalQ1MI_Pos.dam
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 64/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 54
Target Compound: LeucoMG
Initial Product Mass Initial Product Ion Intensity(cps) (26 MCA Sum)239.159 774000316.240 236000
Parameter: CE Start: 5.0 Stop: 130.0 Step: 2.0Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.809/239.159 50.0 45.0 148793330.809/316.240 50.0 31.0 92210
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.809/239.159 13.0 16.0 173695
Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0
Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.809/316.240 13.0 10.0 116102
Final Product Ion Mass(amu) Final Product Ion Intensity(cps) (10 MCA Average)239.000 183530316.400 114680
Optimal Product Ion Mass: 239.000 Optimal Product Ion Intensity: 183530 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.
Đây là thí nghiệm có độ nhạy tốt nhất của hệ thống phân tích MS/MS đối vớ i
LMG, nhưng đây chỉ mớ i là thông số phân tích MS cho 1 mảnh của LMG (mảnh có
m/z là 239,000). Đối vớ i hệ thống MS/MS, ta phải tìm các thông số thích hợ p để
phân tích tất cả 4 mảnh ion đặc tr ưng, MG (2 mảnh: 328,8 và 165,2) và LMG (2
mảnh: 316,2 và 239). Sau đó mớ i tiến hành hiệu chỉnh hệ thống HPLC. Quả thật,
quá trình hiệu chỉnh hệ thống phân tích là quá trình tốn nhiều công sức và thờ i gian
nhất trong để tài, và k ết quả của quá trình này ảnh hưở ng lớ n nhất đến chất lượ ngcủa phươ ng pháp chuẩn hóa mà nhóm nghiên cứu xây dựng đượ c.
Cuối cùng, sau gần 2 tháng hiệu chỉnh hệ thống phân tích, nhóm nghiên cứu
đã tìm đượ c các thông số tươ ng đối phù hợ p. Thật ra, nhóm nghiên cứu phải miễn
cưỡ ng ngưng quá trình hiệu chỉnh hệ thống phân tích lại do thờ i gian không cho
phép tiến hành tiế p thí nghiệm này. Cần phải tiế p tục hiệu chỉnh nếu có điều kiện.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 65/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 55
- UThông số k ỹ thuật của hệ thống sau khi tiến hành optimize:
• Hệ thống LC Agilent 1100 Agilent 1100 LC pumb method properties
- Pumb Model: Agilent 1100 Capillary Pumb
- Minimum pressure (psi): 0.0
- Maximum pressure (psi): 5801.0
- Dead Volume ( l ): 40.0
- Maximum Flow Ramp (ml/min2) 100.0
- Maximum Presure Ramp (psi/sec): 290
Gradient pha động:
Step
Total time
(min)
Flow
Rate( l /min) A (%) B (%)
0 0.00 250.00 70.0 30.0
1 1.00 250.00 50.0 50.0
2 2.00 250.00 30.0 70.0
3 4.00 250.00 30.0 70.0
4 8.00 250.00 0.0 100.0
5 10.00 250.00 0.0 100.06 11.00 250.00 70.0 30.0
- Left Compressibility: 50.0
- Right Compressibility: 50.0
- Left Dead Volume ( l ) 40.0
- Right Dead Volume ( l ) 40.0
- Left Stroke Volume ( l ) -1.0
- Right Stroke Volume ( l ) -1.0
- Left Solvent A1
- Right Solvent B1
Agilent 1100 Autosampler Properties
- Autosampler Model Agilent 1100 Autosampler
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 66/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 56
- Syringe Size ( l ) 100
- Injection volume ( l ) 10.00
- Draw speed ( l /min) 200.0
- Eject Speed ( l ) 200.0
- Needle Level (mm) 0.00
- Use Custom Injector Program No
Agilent 1100 Colum Oven Properties
- Left temperature ( P
0PC) 20.00
- Right Temperature (P
0PC) 20.00
- Temperature Tolenrance +/- ( P
0PC) 1.00
- Start Acquisition Tolenrance +/- ( P
0PC) 0.50
- Time table (Not use)
- Colume Switching Valve not installed
- Position for firt sample in the batch Not applicable
UThảo luận k ết quả:U
Quá trình hiệu chỉnh hệ thống phân tích đạt k ết quả tươ ng đối, nhưng thờ i
gian optimize vẫn chưa đủ. Vì đây là hệ thống mớ i đượ c sử dụng lần đầu tiên nên
việc tìm các thông số k ỹ thuật thích hợ p là điều bắt buộc, càng có nhiều thờ i gian thìk ết quả đạt đượ c càng tốt.
VII.2.2. XÂY DỰ NG ĐƯỜ NG CHUẨNMuốn tiến hành xác định nồng độ của chất cần phân tích trong các mẫu phân
tích, yêu cầu tr ướ c tiên là chúng ta phải xây dựng đượ c đườ ng chuẩn.
Hóa chất để xây dựng các dung dịch chuẩn bao gồm:
- Working standard: nồng độ 100 ppb
- Dung dịch MeCN
UCách xây dự ng đườ ng chuẩn:U
- Sử dụng phần mềm máy HPLC tính diện tích các peak MG, LMG, các MG,
LMG chuẩn.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 67/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 57
- Xây dựng đườ ng chuẩn tuyến tính giữa tỉ số diện tích MG/MG chuẩn (hoặc
LMG/LMG chuẩn). Sử dụng đườ ng chuẩn thu đượ c tính nồng độ MG (hoặc
LMG) trong mẫu thêm chuẩn.
Dựa vào phươ ng trình cơ bản của phép đo A = K.C và một dãy mẫu chuẩn đầu
(ít nhất là ba mẫu đầu) có nồng độ biết tr ướ c C0, C1, C2, C3 ,C4, C6, C7, C8 ,C9 Saukhi đem phân tích, ta đo diện tích peak của phổ vạch hấ p thụ đượ c A0, A1, A2, A3,
A4B
BA5, A6, A7, A8, A9 để dựng một đườ ng chuẩn A = f(C). Sau đó dựa vào đườ ng
chuẩn này và giá tr ị Ax để xác định nồng độ Cx của chất cần phân tích trong mẫu đo
phổ, r ồi từ đó tính đượ c nồng độ của nó trong mẫu phân tích.
Dựa vào thao tác thêm chuẩn ở trên, ta có dãy chuẩn MG-LMG là: 0, 0.1, 0.5,
01, 02, 05, 10, 20, 50, 100 ppb và đem phân tích trên máy LC-MS/MS ta đượ c:
Nồng độ dãy chuẩn MG Diện tích peak đo đượ c
C0 = 0 ppb A0
C1B
B= 0,1 ppb A1
C2 = 0,5 ppb A2
C3 = 01 ppb AB3B
C4B
B= 02 ppb AB4B
C5 = 05 ppb A5
C6B
B= 10 ppb A6
C7 = 20 ppb A7
C8 = 50 ppb A8
C9B
B= 100 ppb A9
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 68/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 58
HÌNH 13: MINH HỌA ĐƯỜ NG CHUẨ N
Từ đó, dựa vào đườ ng chuẩn này và giá tr ị A BxB ta tính đượ c nồng độ (C BxB)B Bcủa
chất cần xác định trong mẫu phân tích.
UQui định đảm bảo độ tin cậy của thí nghiệm:U
- S/N ≥ 10.
- Đườ ng chuẩn có R P2P > 0,99.
- Diện tích các dịch mẫu kiểm soát không thay đổi đáng k ể ở các lần tiêm khác
nhau, độ chính xác ≥ 95 %.
UPha chất chuẩn (tươ ng tự cho cả chuẩn MG và chuẩn LMG):U
- Chuẩn có nồng độ 0 ppb:
• 0 µl working standard
• 1000 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 0,1 ppb:
• 01 µl working standard
• 999 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 0,5 ppb:
• 05 µl working standard
A
C1
y = ax + b
C2 C3 CB4 C5 C6 C7 Cx C9 C8
A0
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
AX
A8
A9
C (ppb)
Diện tích peak
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 69/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 59
• 995 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 1 ppb:
• 10 µl working standard
• 990 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 2 ppb:
• 20 µl working standard
• 980 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 5 ppb:
• 50 µl working standard
• 950 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 10 ppb:
• 100 µl working standard
• 900 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 20 ppb:
• 200 µl working standard
• 800 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 50 ppb:
• 500 µl working standard• 500 µl MeCN.
- Chuẩn có nồng độ 100 ppb:
• 1000 µl working standard
• 0 µl MeCN.
Có thể tóm tắt quá trình pha các chuẩn bằng bảng sau:
MG-LMG
)/( mL g η
Thể tích working standard100 mL g /η
( l )
Thể tích của MeCN
( l )
0 0 1000
0,1 1 999
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 70/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 60
0,5 5 995
1 10 990
2 20 980
5 50 950
10 100 90020 200 800
50 500 500
100 1000 0
UPha dãy chuẩn:U
- Hóa chất để pha dãy chuẩn:
• Pool working standard (MG+LMG): nồng độ 100 ppb• Nướ c cất (DIW)
• Dung dịch MeCN
- Dãy chuẩn đượ c xây dựng là chuẩn Pool (chuẩn tr ộn) bao gồm cả MG và
LMG, có thể tóm tắt quá trình pha dãy chuẩn bằng bảng dướ i đây:
MG-LMG
)/( mL g η
Thể tích
pool
workingstandard
( l )
Thể tích
của
MeCN
( l )
Thể tích
nướ c cất( l )
0 0 500 500
0,1 1 499 500
0,5 5 495 500
1 10 490 500
2 20 480 5005 50 450 500
10 100 400 500
20 200 300 500
50 500 0 500
100 1000 0 0
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 71/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 61
Sau khi đã pha xong dãy chuẩn, ta tiến hành phân tích dãy chuẩn bằng hệ
thống LC-MS/MS.
- UThí nghiệm:
Phân tích các dung dịch chuẩn bằng LC-MS/MS vớ i pha động bao gồm:
LC solvent A:• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)
tỷ lệ (10:90).
LC solvent B:
• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)
tỷ lệ (90:10).
Vớ i Gradient pha động thu đượ c từ qúa trình optimize hệ thống.
Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu tiến hành 3 thí nghi ệm nhỏ. Mỗi thí
nghiệm sẽ tiến hành phân tích dãy chuẩn đượ c chuẩn bị giống như trên.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 72/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 62
UĐườ ng chuẩn 1:U
UĐườ ng chuẩn của MG
Sau khi tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn bằng hệ thống LC-MS/MS,
ta có bảng số liệu sau:
NỒNG ĐỘ(ppb)
DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG
0 105,3995
0,1 322,4736
0,5 3099,7959
1 3789,2887
2 12749
5 46995
10 178140
20 78953
50 665680
100 166810
BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG-TN1
ĐƯỜNG CHUẨN CỦA MG
y = 3233,7x + 60741
R2 = 0,2617
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0 20 40 60 80 100 120
NỒNG ĐỘ
D I Ệ N
T Í C H
P E A K
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 73/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 63
UĐườ ng chuẩn của LMG
NỒNG ĐỘ(ppb)
DIỆN TÍCH PEAK CỦA lMG
0 49,6171
0,1 28,9331
0,5 74,4237
1 157,0666
2 78,5305
5 350,2963
10 332,7762
20 649,6565
50 2097,8957
100 5813,09
BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG-TN1
Qua 2 đườ ng chuẩn vừa xây dựng đượ c, ta thấy cả hai đườ ng chuẩn đều
không bảo đảm đượ c yêu cầu R 2>0,99. Có thể k ết luận thí nghiệm xây dựng đườ ng
chuẩn này không đạt yêu cầu.
ĐƯỜNG CHU
ẨN C
ỦA LMG
y = 55,204x - 77,926
R2 = 0,975
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 20 40 60 80 100 120
NỒNG ĐỘ
D I Ệ N
T Í C H
P R A K
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 74/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 64
Đườ ng chuẩn 2:
Đườ ng chuẩn của MG
Sau khi tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn bằng hệ thống LC-MS/MS,
ta có bảng số liệu sau:
NỒNG ĐỘ(ppb)
DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG
0,1 702,8285
0,5 2153
1 1302
2 2179
10 6290
20 9775
50 103900
100 99765
BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG – TN2
ĐƯỜNG CHUẨN CỦA MG
y = 1165,7x + 1505,4
R2 = 0,8235
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0 50 100 150NỒNG ĐỘ
D I Ệ N
T Í C H
P E A K
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 75/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 65
Đườ ng chuẩn của LMG:
NỒNG ĐỘ(ppb)
DIỆN TÍCH PEAK CỦA lMG
0,1 57,8672
0,5 33
1 25
2 56
10 298
20 407
50 333
100 920
BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG – TN2
Quan sát hai đườ ng chuẩn xây dựng đượ c trong thí nghiệm 2 ta thấy cả hai
đườ ng chuẩn có R 2 <0,99. Như vậy theo yêu cầu bảo đảm độ tin cậy của thí nghiệm
(R 2>0,99) thì hai đườ ng chuẩn trên không đạt yêu cầu.
ĐƯỜNG CHUẨN CỦA LMGy = 8,0814x + 80,765
R2 = 0,8794
0
200
400
600
800
1000
0 20 40 60 80 100 120NỒNG ĐỘ
D I Ệ N
T Í C H
P E A
K
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 76/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 66
Đườ ng chuẩn 3:
Sau đây là đườ ng chuẩn tốt nhất mà nhóm nghiên cứu đã xây dựng đượ c:
Đườ ng chuẩn của Malachite Green:
Từ số liệu của quá trình phân tích các dung dịch chuẩn bằng LC-MS/MS. Ta
dùng Excel để vẽ đườ ng chuẩn của MG, (số liệu đượ c trình bày ở phần phụ lục).
NỒNG ĐỘ(ppb)
DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG
0 1170,4
0,1 5754,4194
0,5 8776,3037
1 1763,1
2 57,8667
5 7289,5
10 19046
20 27058
50 67256
100 124590
BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA CHUẨN MG – TN3
ĐƯỜ NG CHUẨN CỦA MG
y = 1228,8x + 3100,4 R
2 = 0,9931
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 50 100 NỒNG ĐỘ
DIỆN TÍCH PEAK
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 77/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 67
Quan sát đườ ng chuẩn của MG ta nhận thấy đườ ng chuẩn này đã thỏa mãn
yêu cầu về độ tin cậy, R 2 =0,9931. Như vậy ta có phươ ng trình đườ ng chuẩn của
MG là: Y = 1228,8x + 3100,4
Đườ ng chuẩn của Leuco Malachite Green:
Từ số liệu của quá trình phân tích các dung dịch chuẩn bằng LC-MS/MS. Tadùng Excel để vẽ đườ ng chuẩn của LMG, (số liệu đượ c trình bày ở phần phụ lục).
BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG – TN3
NỒNG ĐỘ (ppb)
DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG(count)
0 0
0,1 8,2666
0,5 12,3999
1 20,665
2 28,9337
5 119,9042
10 10,333
20 593,2759
50 1648,5
100 3071,3
ppb
ĐƯỜNG CHUẨN CỦA LMG
y = 0,0315x + 1,5125
R2 = 0,9905
0
20
40
60
80
100
120
0 1.000 2.000 3.000 4.000 DIỆN TÍCH PEAK
NỒNG ĐỘ
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 78/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 68
Quan sát đườ ng chuẩn của LMG ta thấy đườ ng chuẩn này cũng thỏa mãn yêu
cầu R 2 > 0,99 (R 2 = 0,9905). Vậy phươ ng trình đườ ng chuẩn của LMG là:
Y = 0,0315x + 1,5125
Một số chú ý mà sinh viên làm đề tài rút ra đượ c trong quá trình xây dự ngđườ ng chuẩn:
- Các dụng cụ đượ c sử dụng trong quá trình pha các dung dịch chuẩn phải
đượ c r ửa sạch, ngâm HCl và tráng lại bằng nướ c cất. Nếu dụng cụ bẩn sẽ ảnh
hưở ng r ất lớ n đến độ sai số của đườ ng chuẩn.
- Hóa chất phải thật sự tinh khiết.
- Tiến trình pha chất chuẩn đến phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS phải đượ c
tiến hành liên tục tránh qúa trình thoái hóa chuẩn.- Cần chú ý đến việc thay đầu hút pipet sau mỗi lần hút dung dịch chuẩn vì
nồng độ của các chuẩn là khác nhau.
- Nếu điều kiện không cho phép, phải bảo quản chuẩn trong tủ lạnh ở nhiệt độ
thích hợ p.
- Thao tác phải chinh xác.
Các yếu tố ảnh hưở ng đến chất lượ ng của đườ ng chuẩn:
- Dụng cụ không đượ c r ửa sạch hoàn toàn, dẫn đến các dung dịch chuẩn bị
nhiễm tạ p chất.
- Trong quá trình hút hóa chất, sinh viên thực tậ p không đổi đầu hút pipet, làm
nồng độ của các dung dịch chuẩn bị sai lệch.
- Tiến trình pha dung dịch chuẩn để tiến hành phân tích bằng LC-MS/MS bị
gián đoạn do hệ thống hoạt động không ổn định, làm cho đườ ng chuẩn bị
thoái biến.
Thảo luận k ết quả:
- Đườ ng chuẩn tốt nhất mà nhóm nghiên cứu xây dựng đượ c có độ lệch chuẩn
tươ ng đối (R 2 = 0,9931 đối vớ i đườ ng chuẩn của MG và R 2 = 0,9905 đối vớ i
đườ ng chuẩn của LMG), như vậy so vớ i điều kiện bảo đảm tính an toàn của
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 79/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 69
thí nghiệm (R 2 > 0,99) thì hai đườ ng chuẩn này đạt tiêu chuẩn nhưng so vớ i
đườ ng chuẩn của phươ ng pháp do AOAC xây dựng thì chưa đạt (R 2 > 0,999).
- Bên cạnh đó, dựa vào đườ ng chuẩn xây dựng đượ c ta đưa ra k ết luận sau:
giớ i hạn phát hiện của trang thiết bị mà phòng thí nghiệm Sắc ký đang sử
dụng có độ nhạy r ất cao (LOD = 0,1 ppb).- Cần phải để cho hệ thống hoạt động ổn định hơ n nữa thì k ết quả phân tích
mớ i đượ c đảm bảo.
- Phổ LC-MS/MS của đườ ng chuẩn tốt nhất đượ c trình bày ở phần phụ lục,
những phổ này có độ nhạy khá cao và cho peak đẹ p. Đây là một biểu hiện tốt,
nó mang lại hy vọng có thể nâng cao chất lượ ng của phươ ng pháp phân tích
đẫn đến có thể xây dựng đượ c phươ ng pháp phân tích hiệu quả.
- Đườ ng chuẩn này sẽ đượ c sử dụng để tính hiệu suất thu hồi ở thí nghiệm tiế p
theo.
VII.2.3. THÊM CHUẨN ĐỂ TÍNH HIỆU SUẤT THU HỒI
a) Chuẩ n b ị mẫ u: Cá basa đượ c chuẩn bị theo phươ ng pháp AOAC 937,07 (11), đượ c giữ lạnh
và gửi tớ i phòng thí nghiệm. Mẫu đượ c lột da, làm tan, mô cơ đượ c tr ộn cho đến khiđồng nhất bằng máy gia công thức ăn. Mẫu đượ c bảo quản ở nhiệt độ -20ºC cho đến
khi phân tích.
b) Quá trình chi ế t:
- Cân chính xác 4 g mẫu đồng nhất cho vào ống ly tâm nhựa có thể tích 50 ml.
- Thêm vào 16 ml HCLOB4B/MeCN và làm đồng nhất hỗn hợ p trong ống bằng
máy tr ộn.
- Pha loãng đến vạch 25 ml bằng CHB2BClB2B và tr ộn trong ống quay 10 phút.
- Ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút.
- Chuyển phần thể tích 10 ml của lớ p trên vào ống thủy tinh và làm bay hơ i
đến 2 ml bằng cách thổi khí N B2B ở nhiệt độ dướ i 45ºC.
- Đưa phần dịch chiết thu đượ c sau quá trình cô đặc qua 1 cột SPE đã đượ c làm
ẩm vớ i 2 ml MeCN và thu phần nướ c tháo vào ống.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 80/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 70
- R ửa ống 2 lần vớ i 2 ml MeCN và cho qua cột, hòa lẫn vào dung môi r ửa giải.
- Tốc độ dòng qua cột từ 2 đến 5 ml/phút.
- Làm bay hơ i hỗn hợ p dung môi đến khô bằng cách thổi khí N B2B (t < 45ºC).
- Hòa tan cặn trong 500 l MeCN và tr ộn trong máy tr ộn xoáy.
- Pha loãng dung dịch chiết vớ i 500 l nướ c cất, tr ộn và lọc qua 1 syringe có
đườ ng kính lỗ 0,2 m , lọc tr ướ c khi phân tích.
Tóm t ắt quy trình chi ế t tách mẫ u
Chuẩn làm việc MG - LMG 100 mL g /η đượ c pha là chuẩn tr ộn bao gồm MG
nồng độ 100 mL g /η và LMG nồng độ 100 mL g /η .
c) Spike chuẩ n
Cân 4 g mẫu cá đã nghiền đồng nhất
Đo LC-MS/MS
-Làm khô bằng khí N2 ở nhiệt độ dướ i 45P
0PC
-Thêm 500 l MeCN, lắc xoáy-Thêm 500 l nướ c cất
-Tr ộn xoáy trong 10 phút-Ly tâm 1500 rpm trong 10 phút
-Làm khô bằng khí N2 -Nhiệt độ dướ i 45P
0PC
-Dung dịch còn dướ i 2ml
-Thêm 2 ml MeCN-Chuyển qua cột SPE-Tiế p tục thêm 2 ml MeCN qua cột-R ửa cột bằng 1 ml MeCN
ống nghiệm ly tâm 50 ml -16 ml HCLOB4B/MeCN-09 ml CHB2BClB2B
Chuyển 10 ml dung dịch nổi phía trên
ống nghiệm nhỏ
Tr ộn xoáy, lọc qua syringe có đườ ng kính lỗ 0,2 m
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 81/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 71
Mẫu sau khi làm nhuyễn, sẽ đượ c spike chuẩn (thêm chuẩn vào) tr ướ c khi
tách chiết để phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS. Thao tác thêm chuẩn vào mẫu
phân tích nhằm hai mục đích:
- Để phân tích dư lượ ng MG và LMG theo phươ ng pháp thêm chuẩn.
- Tính hiệu suất thu hồi để đánh giá phươ ng pháp đượ c xây dựng.
Spike chuẩn vào các mẫu theo bảng dướ i đây:
MẫuKhối lượ ng
(g)
Nồng độ chuẩn
spike( mL g /η )
Thể tích chuẩn
( l )
1 4,01 0,5 500
2 3,99 1 500
3 4,00 2 500
4 3,98 5 500
5 3,99 10 500
6 4,00 20 500
7 4,02 50 500
8 4,01 100 500
d)Tính toán hi ệu suấ t thu hồiTrong thí nghiệm tiêm chuẩn để tính hiệu suất thu hồi, nhóm nghiên cứu đã
tiến hành hai thí nghiệm nhỏ, mỗi thí nghiệm sẽ tính hiệu suất thu hồi của 8 mẫu
đượ c thêm chuẩn Pool (MG+LMG) vớ i các nồng độ đượ c nêu ở trên.
Thí nghiệm 1:
Ta có bảng sau (số liệu tính toán lấy từ phần Phụ lục)
NỒNG ĐỘ
BAN ĐẦU(ppb)
NỒNG ĐỘ THU
HỒI CỦA MG(ppb)
HIỆU
SUẤTTHUHỒI CỦAMG (%)
NỒNG ĐỘ THU
HỒI CỦA LMG(ppb)
HIỆU SUẤT THU HỒICỦA LMG (%)
0,5 Không phát hiện Không phát hiện
1 0,235 23,5 1,76 176
2 Không phát hiện 2,018 100,9
5 Không phát hiện 3,465 69,31
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 82/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 72
10 0,203 2,03 3,206 32,06
20 2,436 12,18 7,502 37,51
50 9,192 18,383 54,25 108,5
100 17,938 17,938 40,72 40,72
Thảo luận k ết quả:
Qua bảng hiệu suất thu hồi trên ta rút ra các k ết luận sau:
- K ỹ thuật tách chiết còn hạn chế, thao tác không chính xác dẫn đến không phát
hiện chất chuẩn ở nồng độ 0,5 ppb.
- Giớ i hạn phát hiện của hệ thống phân tích đối vớ i các mẫu phân tích là 1 ppb,
giớ i hạn này là tươ ng đối cao, nhưng so vớ i giớ i hạn về hàm lượ ng của MG
trong thực phẩm của Canada (0,5 ppb) thì chưa đạt.
- Trong các mẫu thêm chuẩn có sự biến đổi từ MG sang LMG. Ở các mẫu
thêm chuẩn vớ i nồng độ 2ppb, 5 ppb và 50 ppb ta thấy hiệu suất thu hồi của
LMG r ất lớ n, vượ t khỏi 100%. Điều này có thể giải thích dựa vào sự chuyển
hóa từ MG sang LMG, xảy ra khi dung dịch chuẩn để quá lâu (quá trình phân
tích bị gián đoạn).- Tuy nhiên, phổ LC-MS/MS của các mẫu thêm chuẩn để tính hiệu suất thu hồi
có độ nhạy khá cao. Hạn chế của quá trình một phần là do hệ thống phân tích
hoạt động không ổn định, đây cũng là điều dễ hiểu, chúng ta chưa thể làm
chủ hoàn toàn hệ thống phân tích hiện đại nhất thế giớ i này. Tuy nhiên, hạn
chế này hoàn toàn có thể khắc phục đượ c, hy vọng trong khoảng thờ i gian
không xa hệ thống phân tích sẽ hoạt động ổn định và phát huy tối đa khả
năng phân tích của nó.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 83/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 73
Thí nghiệm 2:
Thí nghiệm này cũng tiến hành tiêm chuẩn, chiết tách mẫu và tính hiệu suất
thu hồi đối vớ i 8 mẫu tr ắng. Quá trình chuẩn bị mẫu, chiết tách đượ c tiến hành giống
như thí nghiệm 1.
Spike chuẩn vào các mẫu theo bảng dướ i đây:
MẫuKhối lượ ng
(g)
Nồng độ chuẩn
spike( mL g /η )
Thể tích chuẩn
( l )
1 3,98 0,5 500
2 4,00 1 500
3 4,00 2 500
4 4,00 5 500
5 4,03 10 500
6 4,02 20 500
7 3,98 50 500
8 4,01 100 500
Ta có bảng tính hiệu suất thu hồi sau:
NỒNG ĐỘ BAN ĐẦU
(ppb)
NỒNG ĐỘ THUHỒI CỦA MG
(ppb)
HIỆUSUẤTTHU
HỒI CỦAMG (%)
NỒNG ĐỘ THUHỒI CỦA LMG
(ppb)
HIỆU SUẤT THU HỒI
CỦA LMG (%)
0,5 Không phát hiện Không phát hiện
1 0,287 28,7 0,21 21
2 0,432 21,6 0,743 37,15
5 1,336 26,72 1,784 35,68
10 0,225 22,5 2,698 26,98
20 3,951 19,755 4,564 22,82
50 11,236 22,472 10,669 21,338
100 30,584 30,584 21,369 21,369
Thảo luận k ết quả:
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 84/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 74
Chuẩn có nồng độ 0,5 ppb vẫn không thể tách chiết thành công, nên không
thể tính hiệu suất thu hồi. Có thể do nồng độ quá nhỏ nên sinh viên thực tậ p chưa đủ
trình độ để tách chiết thành công chuẩn này.
Chuẩn có nồng độ 1 ppb đượ c chiết tách thành công nhưng hiệu suất thu hồi
quá thấ p, không đáp ứng đượ c yêu cầu của AOAC (hiệu suất thu hồi phải từ 70% tr ở
lên).
Hiệu suất thu hồi của các chuẩn còn lại vẫn thấ p, hạn chế này có thể do nhiều
nguyên nhân. Nhưng nguyên nhân cốt lõi vẫn là hệ thống phân tích hoạt động không
ổn định, cột LC quá tải do sử dụng phân tích quá nhiều chất và chạy quá nhiều
Gradient pha động. Bên cạnh đó, quá trình phân tích bị gián đoạn cũng ảnh hưở ng
không nhỏ đến hiệu suất thu hồi. Cần lậ p lại thí nghiệm nhiều lần hơ n nữa mớ i cóthể tìm ra những biện phá p nâng cao hiệu suất thu hồi.
VII.2.4. THỰ C TẬP TÁCH CHIẾT MẪU
Ngoài ra, sinh viên thực tậ p đã tiến hành chiết mẫu (20 mẫu, khối lượ ng
mỗi mẫu là 9 g, dùng để tiến hành 2 thí nghiệm tính hiệu suất thu hồi) theo phươ ng
pháp “Xác định dư lượ ng Malachite green và Leucomalachite green bằng sắc ký
lỏng (LC) vớ i sự oxi hóa Leucomalachite green bằng than hoạt tính” (Phươ ng phápIII, Luận văn của sinh viên Tr ần Thị Kim Giang, Cử Nhân Hóa khóa 28) (3).
- Nguyên tắc
MG và LMG đượ c ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch
acetonitrile. Dịch chiết sau đó đượ c thổi đến khô còn 0.5 ml ở 60°C (sử dụng khí
nitrogen). Định mức dịch chiết còn lại tớ i 2 ml bằng pha động (ở đây là
MeCN/H2O). Tiến hành oxi hóa dung dịch đó vớ i than hoạt tính. Cuối cùng, dung
dịch đượ c lọc qua đầu lọc 0,2 μm và đem phân tích.
- Quy trình phân tích
• Chuẩn bị than hoạt tính
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 85/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 75
Cân chính xác 1 g bột than mịn vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nắ p đậy
50 ml. Thêm vào ống nghiệm 40 ml acid nitrite 5M, r ồi lắc mạnh bằng máy vortex
khoảng 1 phút. Sau đó ly tâm 2000 vòng/phút (rpm) khoảng 5 phút, r ồi bỏ lớ p dung
dịch trong. Phần cặn còn lại đượ c r ửa 2 lần, lần lượ t vớ i 40 ml nướ c cất và 40 ml
dung dịch pha động bằng cách hòa tan phần cặn r ồi lắc mạnh, đem ly tâm 1500vòng/phút khoảng 5 phút. Sau đó bỏ lớ p dung dịch trong.
Cuối cùng hòa tan phần cặn còn lại vớ i 20 ml pha động, lắc mạnh. Những
chú ý khi chuẩn bị dung dịch than hoạt tính:
Khối lượ ng than hoạt tính phải đượ c cân một cách chính xác.
Dung dịch than hoạt tính này đượ c dùng ngay lậ p tức.
• Chuẫn bị mẫu:
Mẫu sử dụng giống như mẫu dùng trong phươ ng pháp chuẩn hóa quy trình
phân tích dư lượ ng MG và LMG cho phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ môn Dinh
Dưỡ ng, Khoa Thủy Sản.
Trong quá trình cân mẫu, cần phải chú ý những điểm sau:
Phải để mẫu rã đông hoàn toàn tr ướ c khi cân.
Phải lau lại dụng cụ lấy mẫu sau mỗi lần cân.
• Spike chuẩn:
Tr ướ c khi chiết tách, mẫu đượ c thêm chuẩn ở các nồng độ 0,1 ppb; 0,5 ppb;
01 ppb; 02 ppb; 05 ppb; 10 ppb; 20 ppb; 50 ppb; 100 ppb. Sau đó, tiến hành ly chiết
theo sơ đồ tách chiết dướ i đây:
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 86/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 76
Một số kinh nghiệm mà sinh viên thự c tập đã rút ra đượ c:
- Các dụng cụ liên quan đến quá trình chiết tách phải tuyệt đối sạch sẽ, r ửa
nướ c cất và sấy khô ở nhiệt độ vừa phải tr ướ c khi sử dụng.- Dụng cụ thổi khí Nitơ phải đượ c r ửa bằng nướ c cất tr ướ c khi sử dụng, tránh
tình tr ạng mẫu phân tích bị nhiễm tạ p chất.
- Tốc độ thổi khí vừa phải, tránh tình tr ạng thổi khí quá mạnh làm văng dung
dịch mẫu ra ngoài.
- Mẫu sau khi chiết tách xong thì đem phân tích ngay là tốt nhất.
- lắc mạnh 30 giây- l tâm 2000 r m tron 5 hút
xác thịt lấy 15 ml dịch trong ở trên chovào ống nghiệm thủy tinh có chia vạch
cho vào dung dịch 100 μldung dịch than đã xử lý
Đo LC-MS/MS
bỏ
định mức dung dịch còn lạitớ i 2 ml bằng pha động
thổi khô còn 0.5 ml ở 60P
oPC
(sử dụng khí nitrogen)
hút 25 l dung dịch trongcho qua đầu lọc 0.2 μm
ống nghiệml tâm 50 ml
Cân 9 g cá đã nghiền đồng nhất
Hỗn hợ p tách 2 lớ p
- lắc mạnh trong tối (3h, 60 rpm)- ly tâm 32000 rpm trong 5 phút
- 2 ml dichloromethan- 16 ml acetonitrile
- 1 ml perchloric acid 0.4M
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 87/94
PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 77
- Nếu điều kiện không cho phép thì phải bảo quản trong tủ lạnh, thờ i gian bảo
quản không quá 2 tuần.
Do thờ i gian không cho phép, bên cạnh đó, thiết bị còn đượ c sử dụng để thực
hiện đề tài của sinh viên khác nên mặc dù đã chiết mẫu xong nhưng sinh viên thực
tậ p không thể tiến hành chạy sắc ký để xác định hiệu suất thu hồi của các mẫu thêmchuẩn. Do đó, việc ly trích này chỉ nhằm mục đích để cho sinh viên thực tậ p thành
thạo hơ n vớ i những thao tác chiết tách mẫu.
Thảo luận k ết quả:
Quá trình chiết tươ ng đối tốt, ít xảy ra sai xót. Tuy nhiên do không thể tiến
hành phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS nên không thể đánh giá cụ thể. Theo dự
đoán của sinh viên thực tậ p, dù quá trình chiết tách tốt nhưng hiệu suất thu hồi của
thí nghiệm này vẫn không cao. Nguyên nhân là do phươ ng pháp này đã đượ c thực
hiện tr ướ c đó và cho hiệu suất trung bình quá thấ p: 1,522 % đối vớ i MG và không
tính đượ c hiệu suất thu hồi đối vớ i LMG. Phươ ng pháp này cần phải nghiên cứu
thêm.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 88/94
K Ế T LU Ậ N-KI Ế N NGH Ị
Trang 78
CHƯƠ NG VIII. K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ MG và LMG đượ c tách ra khỏi nhau một cách dễ dàng và đượ c r ửa giải hoàn
toàn vớ i Cột Higgingn Analytical, Iic-USA Clipews C18 5 m (150 cm * 2,1 mm)
trong thờ i gian dướ i 25 phút, vớ i tốc độ dòng là 0,25 ml/phút. Đườ ng chuẩn đượ c
nối giữa các điểm có nồng độ từ 0,1 ppb đến 100 ppb. Hệ số tươ ng quan của đườ ng
chuẩn lớ n hơ n 0,99 và tỷ lệ của chất phân tích so vớ i nền lớ n hơ n 10. Sự bảo quản
đườ ng chuẩn gặ p r ất nhiều khó khăn, chuẩn làm việc bị thoái biến r ất nhanh, một số
nồng độ có sự chuyển hóa từ MG sang LMG nên ảnh hưở ng đến tính chính xác của
đườ ng chuẩn. Đườ ng chuẩn đượ c xây dựng bằng chuẩn tr ộn (bao gồm cả MG và
LMG) nên sự chuyển hóa này càng ảnh hưở ng đến đườ ng chuẩn. Bên cạnh đó, trang
thiết bị hoạt động không ổn định, đượ c sử dụng để phân tích nhiều loại thuốc khángsinh cùng một lúc đã làm gián đoạn tiến trình phân tích nên việc thoái hóa đườ ng
chuẩn là không thể tránh khỏi.
Giớ i hạn phát hiện của cả MG và LMG trong chuẩn nền tr ắng dựa trên thờ i
gian lưu của hợ p chất là 0,1 ng/g (thiết bị có thể phát hiện đượ c mẫu chuẩn có nồng
độ 0,1 ppb), điều này chứng tỏ hệ thống phân tích LC-MS/MS đượ c sử dụng là r ất
nhạy và có giớ i hạn phát hiện không thua kém giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp
tham chiếu. Giớ i hạn định lượ ng là 1 ng/g cho các mẫu thêm chuẩn để tính độ thuhồi. Hạn chế này có thể không phải tại hệ thống phân tích mà do hạn chế về k ỹ thuật
tách chiết của sinh viên thực tậ p hoặc mẫu tiêm chuẩn bị thoái hóa, vì vậy hạn chế
này là hoàn toàn có thể khắc phục. Tuy nhiên, những số liệu này thấ p hơ n so vớ i k ết
quả của hầu hết các phươ ng pháp sử dụng detector LC-Vis để phát hiện MG và
LMG. Sử dụng hệ thống phát hiện LC/MS cho giớ i hạn phát hiện trong khoảng 0,2
đến 0,7 ng/g đối vớ i mẫu tr ắng.
Những mẫu thêm chuẩn để tính độ thu hồi cho k ết quả không như ý muốn, có
thể nói là chưa đạt. Một số nồng độ không thể phát hiện sự có mặt của MG, bên
cạnh đó độ thu hồi của LMG lại vượ t quá 100% cho thấy đã có sự chuyển đổi từ
MG sang LMG trong các mẫu thêm chuẩn (mẫu thêm 1ppb, 2ppb và 50 ppb).
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 89/94
K Ế T LU Ậ N-KI Ế N NGH Ị
Trang 79
Trong phần thực nghiệm, do thờ i gian và hoạt động không ổn định của trang
thiết bị nên chúng tôi không thể lậ p lại số lần thí nghiệm như mong muốn (5 lần).
Như vậy, trong đề tài này nhóm làm luận văn chỉ mớ i hoàn tất xong giai đoạn kiểm
tra phươ ng pháp (kiểm tra về giớ i hạn phát hiện của trang thiết bị là chủ yếu). Việc
chuẩn hóa phươ ng pháp phân tích MG và LMG phù hợ p vớ i phòng thí nghiệm Sắcký, Bộ môn Dinh Dưỡ ng và Chế biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản đòi hỏi nhóm
nghiên cứu phải lặ p lại nhiều lần thí nghiệm để có thể tìm đượ c một phươ ng pháp
đáp ứng đượ c yêu cầu đã đặt ra.
Có thể nói nhóm nghiên cứu đã đi đúng hướ ng, vấn đề còn lại chỉ là thờ i
gian, và nếu có điều kiện về kinh tế, nếu có thể có riêng cột LC và khoảng thờ i gian
dành riêng cho việc chuẩn hóa phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và LMG để
tránh tình tr ạng tiến trình thí nghiệm bị gián đoạn, dẫn đến đườ ng chuẩn bị thoái hóa
hoặc cột LC hoạt động không ổn định vì phải r ửa giải quá nhiều chất và chạy quá
nhiều chươ ng trình gradient pha động thì chúng tôi tin r ằng việc tìm ra phuơ ng pháp
phân tích như mong đợ i là hoàn toàn có thể.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 90/94
TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O
Trang 80
TÀI LIỆU THAM KHẢO
(1). ThS. Nguyễ n Thị Diệ p Chi. Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học - Tr ườ ng Đại Học
Cần Thơ , năm 2005.
Bài giảng CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
(2). TS. Lê Thanh Phướ c. Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học - Tr ườ ng Đại Học Cần
Thơ , năm 2005.
Bài giảng Ứ NG DỤ NG MỘT SỐ PHƯƠ NG PHÁP PHỔ NGHIÊN CỨ U CẤU
TRÚC PHÂN TỬ
(3). Sinh viên Tr ần Thị Kim Giang , Cử Nhân Hóa K28.
Đề tài “XÁC ĐỊ NH DƯ LƯỢ NG MALACHITE GREEN TRONG THỦY
SẢ N BẰ NG SẮC KÝ LỎ NG CAO ÁP GHÉP KHỐI PHỔ”
(4). www.baocantho.com.vn/vietnam/giaoduc/37008/ - 74k
(5). www.fistenet.gov.vn/Vietnamese/ KS_Duluong/2006/Kqksdl1-2006.htm - 58k
(6). www.soctrang.gov.vn/soctrang/ html/tintuc-detail1.asp?tn=tn&id=1166144
Xuất khẩu thủy sản: Lo đầu ra, quên đầu vào
(7). www.vienkinhte.hochiminhcity.gov.vn/xemtin.asp?idcha=2806&cap=3&i
Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam – Thực tr ạng và thách thức
(8). www.restek.com/aoi_fff_A003.asp - 29k
Malachite green ADN leucomalachite green COM statement COM/99/S1 (for COT) -
February 1999
(9). www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTECHShowContent.asp?ID=80
Hiểm họa Malachite green
(10). HTen.wikipedia.org/wiki/Malachite_greenTH
(11). www.malachitegreen.tidalswan.com/
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 91/94
TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O
Trang 81
(12). HTCulp SJ TH. HTwww.ncbi.nlm.nih.govTH
“NTP technical report on the toxicity of malachite green choride ADN leuco
malachite green (CAS Nos. 569-64-2 ADN 129-73-7) administered in feed to
F334/N rats ADN B6C3F1 mice”
(13). en.wikiprdia.org/wiki/AOAC system(14). Phạm Hùng Việt, Nguyễ n Xuân Dũng , NXB KHKT Hà Nội, 1998
CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
(15). en.wikipedia.org/wiki/Mass_spectrometer
(16). www.masspec.scripps.edu/MSHistory/mshisto.php
(17). www.spectroscopymag.com/spectroscopy
(18). HTwww.ietltd.com/inventoryTH
(19). www.pesciex.com
(20). Peter Scherpenisse ADN Aldert A. Bergwerff
“Determination of residuses of malachite green in finfish by liquid
chromatography tADNem mass spectrometry”
Analytica Chimica Acta, Volume 529, Issuse 1-2, 24 January 2005, page 173-
177. Department of Public Heath ADN Food Safety, Faculty of Veterinary
Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80175, NL-3508 TD Utrecht, The
NetherlADNs.
(21). Luis Valle, Cecilia Diaz, Antonio L. Zanocco ADN Pablo Richter.
“Determination of the sum of malachite green in salmon muscle by liquid
chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry”
Journal of Chromatograph A, Volume 1057, Issues 1-2, 4 March 2005,
Pages 101-105, Mass Spectrometry: Innovation ADN Application , Part IV.
(22). Aldert A. Bergwerff ADN Peter Scherpenisse
“Determination of residues of malachite green in aquatic animals”
Journal of Chromatography B, Volume 788, Issues 2, 25 May 2003, Pages
351-359, Department of Public Health ADN Food Safety Faculty of Vererinary
Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80.175, NL-3508 tD, Utrecht, The
NetherlADNs.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 92/94
TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O
Trang 82
(23). Jeffrey M. VADNe Riet, Cory J. Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A. Potter và
B. Garth Burns
“Determination of malachite green ADN Leucomalachite Green in a Variety of
Aquacultured Products by Liquid Chromatography with TADNem Mass
Spectrometry Detection”DRUGS, COSMETICS, FORENSIC SCIENCES, Canadian Food
Inspection Agency, Dartmouth Laboratory, PO Box 1060, Dartmouth.
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 93/94
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …
http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 94/94
PH Ụ LỤ C
PHẦN PHỤ LỤC
PHỔ LC-MS/MS CỦA ĐƯỜ NG CHUẨ N
PHỔ LC-MS/MS CỦA MẪU THÊM CHUẨ N TÍNH HIỆU SUẤT THU HỒI
W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY
Recommended