CROMATOGRAFÍA (parte II) Graciela Escandar. Cromatografía líquida líquida - líquida líquida -...

CROMATOGRAFÍA

(parte II)

Graciela Escandar

Cromatografía líquida

líquida - líquidalíquida - fase ligada

intercambio iónico

exclusión molecular

líquida-sólidaLíquida(cromatografía líquida)

líquida

sólida

resina intercambio iónico

gel poroso

FM FE MÉTODO

Sistemas a desarrollar

Cromatografía de reparto

fase estacionaria LÍQUIDA

Fundamento de separación: diferente solubilidad del analito en FM y FE

Cromatografía líquida

cromatografía de partición o reparto

CL convencional Fase ligada

El líquido que constituye la FE está adsorbido sobre un soporte sólido inerte

Las cadenas carbonadas que constituyen la FE están unidas por enlace covalente al soporte sólido inerte

Cromatografía líquida

Cromatografía L-L convencional

soporte inerte

FE (líquida)

La mayoría de las fases ligadas se forman a partir de partículas de sílicagel, a las que se les une covalentemente cadenas carbonadas que actúan como FE

SiO

Si

O

Si

HO

OH

OH

O

SiOSi

O

OH

OH

OHOH

OH

Representación esquemática de partícula de silicagel

Fase unida o ligada

grupo silanol

grupo silanol reactivo

unión siloxano

- HCl+

Si

H

Si OH

OSi

O

C 3

CH3

R

unión siloxano

alquil clorosilano

Si OH

OHSi

O Si

CH3

RCl

CH3

Fase ligada: empaque de siloxanos

Cromatografía líquida

-2 HCl+ 2Cl SiR2

alquil diclorosilano

Si OH

OHSi

O

OSi

O SiR2OSi

Fase ligada: empaque de siloxanos

Cromatografía líquida

Ejemplos de fases ligadas

Fase reversa

Hexil, C6

Octil, C8

Octadecil, C18

fenil

H HN

NO2

---

---

Ejemplo de interacción con “fase normal”

enlace de hidrógeno entre el analito y la ciano-superficie

Índice de polaridad: describe cuantitativamente la polaridad del solvente en el reparto

Fluoroalcanos < -2

Ciclohexano 0.04

Tolueno 2.4

Cloroformo 4.1

Etanol 4.3

Acetato de etilo 4.4

Metanol 5.1

Nitrometano 6.0

Etilenglicol 6.9

Agua 10.2

SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)

Cromatografía de adsorción

Fase estacionaria sólida

Fundamento de separación: el analito interacciona con sitios activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de hidrógeno, etc.

Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO3, MgCO3

¿¿¿ Ab- o ad-sorción ???

absorción adsorción

Cromatografía de adsorción

solvente

flujoFE

soluto adsorbido

soluto desorbido

Alúmina

OO O O OO

AlO

AlO

AlO

AlO

O O

+ + + +

O

H

Si Si

OH

OO

H

solvente débil

analito

Si Si

OH

OO

H

HO R

O

R

solvente fuerte

analito solvente

Cromatografía de adsorciónSílicagel

Fuerza del solvente (energía de adsorción del solvente por unidad de área del adsorbente). Se mide con el parámetro de Snyder (°).

Fluoroalcanos 0.00 -0.25Ciclohexano 0.01 -0.2Tolueno 0.22 0.29Cloroformo 0.26 0.40Acetato de etilo 0.48 0.58Etanol 0.70 0.88Metanol 0.75 0.95Etilenglicol 0.90 1.11Agua grande grande

SOLVENTE O (SiO2) O (Al2O3)

Cromatografía de intercambio iónico

Fase estacionaria resinas de intercambio iónico

Fundamento de separación: se produce intercambio reversible de iones entre el analito y la FE. Intervienen fuerzas electrostáticas.

Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte

Cromatografía de intercambio iónico

Resinas de intercambio catiónico: ácido debil

Cromatografía de intercambio iónico

Resinas de intercambio aniónico: base fuerte

Cromatografía de intercambio iónico

Resinas de intercambio aniónico: base debilCromatografía de intercambio iónico

x RSO3 H+ + Mx+ (RSO3 )xMx+ + x H+

sólido solución sólido solución

El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio

El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio

x RN(CH3)3+ OH- + Ax- [RN(CH3)3

+]x Ax- + x OH-

sólido solución sólido solución

Cromatografía de intercambio iónico

Diferentes empaques en Intercambio Iónico

vidrio

película intercambiadora: microesferas de sílica (1 - 2 m) cubiertas con intercambiador iónico

30 – 40 m

Resina pelicular

Resina macroreticular

macroporos

grupos cargados

negativamente

mezcla de aminoácidos

Ejemplo de una separación por intercambio iónico

resina intercambiadora catiónica

Los AA se mueven a través de la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH usado. Los AA con carga neta negativa grande eluyen 1ro

carga neta positiva grande carga neta positiva carga neta negativa carga neta negativa grande

Cromatografía de exclusión molecular

FE: geles porosos

Hidrofílicos Hidrofóbicos

Filtración en gel Permeación en gel

Fundamento de separación: separación en base a forma y tamaño del analito

Fase estacionaria: geles hidrofílicos (Sephadex), geles de poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica o vidrio con determinados tamaños de poro.

Exclusión molecular

K = 0.2 K = 0.5Rta

Volumen

VSVM

Exclusión total

Permeación selectiva

Permeación total

102

104

106

Volumen

PM

VR - VM

VS

K =

K = 0 K = 1

Exclusión molecular

ligando unido covalentemente

empaque

muestra

analito

etapa de lavado

etapa de elución

columna regenerada

solución con analito puro

+

etapa de interacción

Cromatografía de afinidad

102

103

104

105

106

PM

no polar iónicopolar no iónico

Aumento de la polaridad

adsorciónintercambio

iónico

particiónfase

reversafase

normal

exclusión

permeación en gel

filtración en gel

Elección del sistema cromatográfico

Elección de la fase móvil

fase móvil interactiva y fase móvil no-interactiva

reparto, adsorción, intercambio iónico

CG y exclusión molecular

los tiempos de retención están fuertemente influenciados por el tipo de FM utilizada

participación activa en la separación

los tiempos de retención son independientes de la FM utilizada

la FM solo transporta la muestra a través de la FE