Upload
ermenegildo-mauricio
View
21
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
CROMATOGRAFÍA
(parte II)
Graciela Escandar
Cromatografía líquida
líquida - líquidalíquida - fase ligada
intercambio iónico
exclusión molecular
líquida-sólidaLíquida(cromatografía líquida)
líquida
sólida
resina intercambio iónico
gel poroso
FM FE MÉTODO
Sistemas a desarrollar
Cromatografía de reparto
fase estacionaria LÍQUIDA
Fundamento de separación: diferente solubilidad del analito en FM y FE
Cromatografía líquida
cromatografía de partición o reparto
CL convencional Fase ligada
El líquido que constituye la FE está adsorbido sobre un soporte sólido inerte
Las cadenas carbonadas que constituyen la FE están unidas por enlace covalente al soporte sólido inerte
Cromatografía líquida
Cromatografía L-L convencional
soporte inerte
FE (líquida)
La mayoría de las fases ligadas se forman a partir de partículas de sílicagel, a las que se les une covalentemente cadenas carbonadas que actúan como FE
SiO
Si
O
Si
HO
OH
OH
O
SiOSi
O
OH
OH
OHOH
OH
Representación esquemática de partícula de silicagel
Fase unida o ligada
grupo silanol
grupo silanol reactivo
unión siloxano
- HCl+
Si
H
Si OH
OSi
O
C 3
CH3
R
unión siloxano
alquil clorosilano
Si OH
OHSi
O Si
CH3
RCl
CH3
Fase ligada: empaque de siloxanos
Cromatografía líquida
-2 HCl+ 2Cl SiR2
alquil diclorosilano
Si OH
OHSi
O
OSi
O SiR2OSi
Fase ligada: empaque de siloxanos
Cromatografía líquida
Ejemplos de fases ligadas
Fase reversa
Hexil, C6
Octil, C8
Octadecil, C18
fenil
H HN
NO2
---
---
Ejemplo de interacción con “fase normal”
enlace de hidrógeno entre el analito y la ciano-superficie
Índice de polaridad: describe cuantitativamente la polaridad del solvente en el reparto
Fluoroalcanos < -2
Ciclohexano 0.04
Tolueno 2.4
Cloroformo 4.1
Etanol 4.3
Acetato de etilo 4.4
Metanol 5.1
Nitrometano 6.0
Etilenglicol 6.9
Agua 10.2
SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)
Cromatografía de adsorción
Fase estacionaria sólida
Fundamento de separación: el analito interacciona con sitios activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de hidrógeno, etc.
Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO3, MgCO3
¿¿¿ Ab- o ad-sorción ???
absorción adsorción
Cromatografía de adsorción
solvente
flujoFE
soluto adsorbido
soluto desorbido
Alúmina
OO O O OO
AlO
AlO
AlO
AlO
O O
+ + + +
O
H
Si Si
OH
OO
H
solvente débil
analito
Si Si
OH
OO
H
HO R
O
R
solvente fuerte
analito solvente
Cromatografía de adsorciónSílicagel
Fuerza del solvente (energía de adsorción del solvente por unidad de área del adsorbente). Se mide con el parámetro de Snyder (°).
Fluoroalcanos 0.00 -0.25Ciclohexano 0.01 -0.2Tolueno 0.22 0.29Cloroformo 0.26 0.40Acetato de etilo 0.48 0.58Etanol 0.70 0.88Metanol 0.75 0.95Etilenglicol 0.90 1.11Agua grande grande
SOLVENTE O (SiO2) O (Al2O3)
Cromatografía de intercambio iónico
Fase estacionaria resinas de intercambio iónico
Fundamento de separación: se produce intercambio reversible de iones entre el analito y la FE. Intervienen fuerzas electrostáticas.
Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte
Cromatografía de intercambio iónico
Resinas de intercambio catiónico: ácido debil
Cromatografía de intercambio iónico
Resinas de intercambio aniónico: base fuerte
Cromatografía de intercambio iónico
Resinas de intercambio aniónico: base debilCromatografía de intercambio iónico
x RSO3 H+ + Mx+ (RSO3 )xMx+ + x H+
sólido solución sólido solución
El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio
El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio
x RN(CH3)3+ OH- + Ax- [RN(CH3)3
+]x Ax- + x OH-
sólido solución sólido solución
Cromatografía de intercambio iónico
Diferentes empaques en Intercambio Iónico
vidrio
película intercambiadora: microesferas de sílica (1 - 2 m) cubiertas con intercambiador iónico
30 – 40 m
Resina pelicular
Resina macroreticular
macroporos
grupos cargados
negativamente
mezcla de aminoácidos
Ejemplo de una separación por intercambio iónico
resina intercambiadora catiónica
Los AA se mueven a través de la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH usado. Los AA con carga neta negativa grande eluyen 1ro
carga neta positiva grande carga neta positiva carga neta negativa carga neta negativa grande
Cromatografía de exclusión molecular
FE: geles porosos
Hidrofílicos Hidrofóbicos
Filtración en gel Permeación en gel
Fundamento de separación: separación en base a forma y tamaño del analito
Fase estacionaria: geles hidrofílicos (Sephadex), geles de poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica o vidrio con determinados tamaños de poro.
Exclusión molecular
K = 0.2 K = 0.5Rta
Volumen
VSVM
Exclusión total
Permeación selectiva
Permeación total
102
104
106
Volumen
PM
VR - VM
VS
K =
K = 0 K = 1
Exclusión molecular
ligando unido covalentemente
empaque
muestra
analito
etapa de lavado
etapa de elución
columna regenerada
solución con analito puro
+
etapa de interacción
Cromatografía de afinidad
102
103
104
105
106
PM
no polar iónicopolar no iónico
Aumento de la polaridad
adsorciónintercambio
iónico
particiónfase
reversafase
normal
exclusión
permeación en gel
filtración en gel
Elección del sistema cromatográfico
Elección de la fase móvil
fase móvil interactiva y fase móvil no-interactiva
reparto, adsorción, intercambio iónico
CG y exclusión molecular
los tiempos de retención están fuertemente influenciados por el tipo de FM utilizada
participación activa en la separación
los tiempos de retención son independientes de la FM utilizada
la FM solo transporta la muestra a través de la FE