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Diagnostica di laboratorio per autoimmunità non organo specifica:
tecniche analitiche ed interpretazione dei risultati
Dott.ssa Anna Maria Girardi
Diagnostica e Ricerca San Raffaele
LaboRaf
PREMESSA
• La presenza di autoanticorpi è riscontrabile in un elevato numero di patologie, sia d’organo che sistemiche
• La corretta identificazione degli autoanticorpi associati ad un certo quadro clinico fornisce informazioni utili dal punto di vista sia diagnostico che prognostico
• Soprattutto per le malattie sistemiche, il singolo dato di laboratorio non è sempre di univoca interpretazione e necessita, spesso, di ulteriori approfondimenti.
• Autoanticorpi organo specifici
• Organo bersaglio, presenza di anticorpi, alterazione della funzione d’organo: la sequenza appare ovvia, la richiesta del clinico è mirata, l’interpretazione del dato di laboratorio è semplice
• Autoanticorpi non organo specifici
• Sintomi comuni a diverse patologie, anticorpi diretti verso strutture ubiquitarie, il substrato utilizzato per la ricerca spesso non ha relazione con l’organo più colpito dalla patologia, interpretazione del dato di laboratorio è più complessa
EMA su esofago di scimmia
Le principali patologie autoimmuni sistemiche
• Lupus eritematoso sistemico (LES)• Sclerosi sistemica(SSc)• Dermatomiosite/polimiosite• Sindrome di Sjogren• Sindromi da sovrapposizione (overlap) MTCD• Vasculiti• Artrite Reumatoide• Sindrome da anti fosfolipidi
I più comuni esami disponibili per la ricerca di autoanticorpi non organo
specifici
• Anticorpi anti nucleo (ANA)• Anticorpi anti DNA nativo (dsDNA)• Anticorpi anti antigeni nucleari estraibili (ENA)• Anticorpi anti granulociti neutrofili (ANCA)• Anticorpi anti proteine citrullinate (CCP)• Anticorpi anti Istoni • Anticorpi anti fosfolipidi*
Tecniche analitiche disponibili
• Immunofluorescenza indiretta• ELISA• Immunoblot• RIA• (Immunodiffusione)• Controimmunoelettroforesi)
• Citofluorimetria• Microarray
Immunofluorescenza indiretta
• Incubazione del siero, opportunamente diluito, su un substrato ricco dell’antigene bersaglio
• Lavaggio con tampone per eliminare gli anticorpi non specifici, quindi non legati all’antigene
• Incubazione con anticorpo anti immunoglobuline IgG (IgA) umane coniugato con Isotiocianato di fluoresceina
• Lavaggio con tampone• Al microscopio a fluorescenza le strutture dove si
sono formati complessi antigene anticorpo appaiono colorate in verde
IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA PER ANA
• Test di screening: immunofluorescenza indiretta su coltura di cellule epiteliali (Hep2) alla diluizione 1:80
• Titolazione: diluizioni successive fino alla scomparsa della fluorescenza
• Identificazione e descrizione del tipo o “pattern” fluorescente osservato
• In caso di positività è opportuno procedere con esami di secondo livello: ricerca di anticorpi anti DNA , ENA
• Solo in rarissimi casi pazienti negativi per anti-nucleo risultano positivi per anti DNA o ENA
• Limite del metodo: l’esperienza dell’operatore
ANA test di primo livello
• Da eseguire in immunofluorescenza indiretta su cellule Hep2
• Individuabili più di 30 pattern nucleari e citoplasmatici
• Vi è associazione significativa con alcune patologie autoimmuni
• Compaiono precocemente nella malattia • Talvolta precedono i segni clinici• Da valutare con cautela: i bassi titoli, il dato isolato• Non sempre l’entità del titolo correla con
l’andamento della malattia • La titolazione è comunque utile per individuare altre
specificità presenti
Da ricordare: anticorpi anti nucleo a basso titolo possono essere presenti
• In soggetti sani• In gravidanza• Nelle donne >40 anni• Negli anziani
• In alcune neoplasie• Nell’insufficienza renale• In alcune infezioni virali (mononucleosi, AIDS)
WHO 66/233 (1:80)
L’immunofluorescenza indiretta, se effettuata in
un “sistema” ben controllato consente
• Di individuare un gran numero di autoanticorpi nucleari e citoplasmatici
• Di individuare anticorpi diretti verso antigeni espressi solo in determinate fasi cellulari
• Di rilevare la presenza di anticorpi presenti in concentrazioni molto basse
periferico
lamine nucleari
omogeneo
Granulare (speckled)
Speckled & fuso
lisosomi
ribosomi
Omogeneo+speckled+
nuclear dots
Fuso mitotico
Anticorpi anti DNA• Farr (RIA): il “gold standard”. Rileva anticorpi ad
alta affinità. Indaginoso, è poco usato per motivi pratici.
• Immunofluorescenza indiretta (su Chritidia Luciliae). Altamente specifico, rileva anticorpi ad alta affinità. Limite: qualitativo.
• ELISA: sempre più utilizzato. Vantaggio: quantitativo. Limite: a volte ad un’alta sensibiltà si contrappone una minore specificità. Si possono riscontrare falsi positivi anche utilizzando antigeni ricombinanti.
• Immunoblot : non soddisfacente• Citofluorimetria : ancora risultati scadenti• Microarray: in fase di sperimentazione
ANTICORPI anti-DNA NATIVO - double stranded DNA ( test di secondo livello)
• Uno dei criteri diagnostici per il LES secondo l’American College of Rheumatology
• Prevalenza variabile nel LES dal 40 all’80%; raramente presenti ad alto titolo in altre patologie (IgG)
• Il titolo segue l’attività della malattia
ENAtest di secondo livello
• Sono antigeni nucleari (proteine associate al DNA o all’RNA) o citoplasmatici
• La presenza di anticorpi verso uno o più di questi antigeni caratterizza il profilo sierologico della malattia
• Hanno notevole specificità per alcuni quadri clinici
• Hanno notevole significato diagnostico e prognostico
• Compaiono precocemente
• Non è necessario un risultato quantitativo (tranne semmai che per RNP): la quantità di anticorpi determinabili non correla con l’andamento della malattia
ENA
metodiche disponibili
• Immunodiffusione doppia• Controimmunoelettroforesi• ELISA• Immunoblot• Dot blot• Citofluorimetria• Microarray
ENA: nessuno è perfetto
• ELISA: molto sensibile, a volte poco specifica. Grandi differenze qualitative tra i prodotti in commercio
• Immunoblot: non adatto per tutti gli antigeni• (Immunodiffusione: specifica, con sensibilità
buona, ma difficile da interpretare : in disuso)• (Controimmmunoelettroforesi: lunga e
complessa. Poco usata)• Citofluorimetria, microarray: ancora da
perfezionare• In conclusione: l’optimum sarebbe poter
utilizzare sempre due metodiche
Immunoblot
• Proteine estratte da cellule Hep2 vengono separate con SDS PAGE
• al termine dell’elettroforesi le proteine, separate in base al peso molecolare, vengono selezionate e trasferite su nitrocellulosa in base a pannelli predefiniti
• il siero in esame viene posto in incubazione sulle strisce pretrattate: eventuali autoanticorpi si legano agli specifici antigeni. La loro evidenziazione avviene con un siero anti-immunoglobuline umane coniugato con enzima.
• La reazione con il substrato evidenzia la presenza di bande, che vengono confrontate con quelle ottenute da sieri di riferimento su una striscia di controllo
I = Controllo positivo.II= Controllo negativoIII= Campione positivo per SSA ed SSB
ELISA
• Per gli ENA esistono buoni kit in immunoenzimatica
• La determinazione quantitativa non è in realtà necessaria
• Risultati più affidabili se il coating delle piastre è fatto con l’antigene specifico piuttosto che con un pool di antigeni (ENA screening”)
Vi è notevole incertezza nel definire quale sia la modalità migliore per la preparazione degli antigeni
ENA:l’utilizzo degli Ag nativi consente il mantenimento dei principali epitopi conformazionali, ma la
preparazione è costosa e complessa.Quanto alle metodiche impiegate, quelle in cui l’antigene è allo
stato nativo sono quelle a più bassa sensibilità e a più alta specificità.
Biochip
Citofluorimetria
Le più autorevoli associazioni operanti nel campo dell’ Autoimmunità (FIRMA, SiMeL, AMCLI..) propongono linee guida per la diagnostica
autoimmune:• Per raggiungere la migliore accuratezza diagnostica• Per fornire al clinico informazioni precise• Per inquadrare il più possibile il paziente• Per limitare incertezze e dubbi in un campo in cui sovente
le patologie hanno un esordio subdolo • e nel contempo • Per limitare gli sprechi dovuti a richieste non appropriate• Per ridurre il carico economico sia sul paziente che sulla
Regione in un percorso diagnostico che richiede esami spesso costosi
• Per utilizzare al meglio le risorse umane e tecniche• Il percorso dovrebbe essere condiviso dai clinici e dagli
specialisti di laboratorio
Esistono Linee guida per
• ANA• DNA• ENA• ANCA• ANTICORPI ANTI FOSFOLIPIDI
Esistono percorsi diagnostici suggeriti per la ricerca di
autoanticorpi
• Nelle connettiviti sistemiche
• Nella celiachia
• Nelle vasculiti
• Nel diabete mellito di tipo I
SOSPETTO di LES ?
Ab anti-nucleopresenti >1:80
Pattern:Omogeneo (DNA)Periferico (DNA)Granulare (RNA)
Granulare atipico (PCNA)
Ab anti-DNA ENA
LESimprobabile
A titolo elevato possibile LES
si
no
SMPCNA:
probabilediagnosi di LES
SSA SSBRNP:
associazione anche con
altre patologie
++
LESpattern antigene specificità
omogeneo/ DNA elevataperiferico istoni LES da farmaci
granulare RNA: Sm elevataSS-A lupus discoide
SS-B, RNP
granulare atipico PCNA elevata(pleomorfico)
citoplasmatico proteine ribosomiali elevatadenso
omogeneo
Sm?
PCNA
SCLEROSI SISTEMICA
pattern antigene specificità
nucleolare RNA polimerasi elevata fibrillarina
granulare SS-A SS-B
omogeneo e DNA topoisomerasi (SCL70) elevatanucleolare Pm/Scl
centromerico centromero elevata per CREST
SINDROME DI SJÖGREN
pattern antigene specificità
granulare RNA: SS-A SS-B frequente **blocco cardiaco fetale
nucleare atipico,puntiforme (nucleardots)
apparato mitotico
Apparato di Golgi
Nuclear dots
midbody
POLIMIOSITE - DERMATOMIOSITE
pattern antigene specificità
citoplasmatico tRNA sintetasi (Jo1) elevata (non presenti ANA)
omogeneo e Pm/Sclnucleolare
JO1
MALATTIA MISTA DEL CONNETTIVO (MCTD)
pattern antigene specificità
granulare RNP presenti a concentrazione più elevata che nel LES
Seguire le linee guida
Dare al paziente ed al clinico le informazioni appropriate
Contenere i costi ed i tempi
ARTRITE REUMATOIDE
La presenza di alcuni autoanticorpi è comune in molti pazienti con Artrite Reumatoide. Tuttavia:
• sono presenti a basso titolo (ANA, DNA)
• sono generalmente poco specifici, ad eccezione degli anticorpi anti proteine citrullinate. Se la determinazione è effettuata con test di terza generazione, la specificità risulta del 98% con una sensibilità fino al 70%
• l’introduzione di tali test in combinazione con il Fattore Reumatoide può essere un utile strumento per la diagnosi precoce: alcuni studi suggeriscono che la presenza di tali anticorpi sia un marcatore prognostico
Sindrome da anticorpi antifosfolipidi
• Sintomi- criterio:
• Trombosi vascolari• Patologie ostetriche
• Test criterio:
• LAC• Anti Cardiolipina• Anti Beta 2 Glicoproteina
Criteri diagnostici
• LAC positivo• Anti Cardiolipina IgG/IgM positivo *• Anti Beta2 Glicoproteina IgG/IgM *positivo• Positività ad uno dei test in due determinazioni
ad almeno 3 mesi una dall’altra
• (*: eseguito con ELISA standardizzato; valutare con attenzione basse positività))
• All’aumentare del numero di test positivi aumenta il rischio di eventi tromboembolici
VASCULITI ANCA - ASSOCIATE
Granulomatosi di WegenerSindrome di Churg-StraussPoliangioite microscopica
• Gli ANCA sono generalmente assenti in alcune vasculiti primarie dei vasi di medio e grosso calibro: poliarterite nodosa, arterite temporale, arterite di Kawasaki, Takayasu, malattia di Bechet.
• In presenza di manifestazioni cliniche che suggeriscono la diagnosi, il riscontro di ANCA ha elevata sensibilità (>80%) e specificità (>95%)
ANCA metodiche disponibili
• Immunofluorescenza indiretta su granulociti umani fissati in etanolo
• ELISA (PR3)= fluorescenza citoplasmatica (c ANCA)
• ELISA (MPO)= fluorescenza perinucleare (p ANCA)
• Immunofluorescenza indiretta su granulociti fissati in formalina
Per una corretta diagnostica degli ANCA
• Screening su granulociti fissati in etanolo• Per i positivi (sia con pattern citoplasmatico
che perinucleare)• a) ELISA (proteinasi 3, mieloperossidasi)• b)Immunofluorescenza indiretta su granulociti
fissati in formalina. I positivi presentano sempre fluorescenza citoplasmatica
VASCULITI ANCA ASSOCIATE
pattern principale antigene
perinucleare / nucleare MPO (mieloperossidasi)
citoplasmatico PR3 (proteinasi 3)
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