Diagnostica di laboratorio per autoimmunità non organo specifica:

tecniche analitiche ed interpretazione dei risultati

Dott.ssa Anna Maria Girardi

Diagnostica e Ricerca San Raffaele

LaboRaf

PREMESSA

• La presenza di autoanticorpi è riscontrabile in un elevato numero di patologie, sia d’organo che sistemiche

• La corretta identificazione degli autoanticorpi associati ad un certo quadro clinico fornisce informazioni utili dal punto di vista sia diagnostico che prognostico

• Soprattutto per le malattie sistemiche, il singolo dato di laboratorio non è sempre di univoca interpretazione e necessita, spesso, di ulteriori approfondimenti.

• Autoanticorpi organo specifici

• Organo bersaglio, presenza di anticorpi, alterazione della funzione d’organo: la sequenza appare ovvia, la richiesta del clinico è mirata, l’interpretazione del dato di laboratorio è semplice

• Autoanticorpi non organo specifici

• Sintomi comuni a diverse patologie, anticorpi diretti verso strutture ubiquitarie, il substrato utilizzato per la ricerca spesso non ha relazione con l’organo più colpito dalla patologia, interpretazione del dato di laboratorio è più complessa

EMA su esofago di scimmia

Le principali patologie autoimmuni sistemiche

• Lupus eritematoso sistemico (LES)• Sclerosi sistemica(SSc)• Dermatomiosite/polimiosite• Sindrome di Sjogren• Sindromi da sovrapposizione (overlap) MTCD• Vasculiti• Artrite Reumatoide• Sindrome da anti fosfolipidi

I più comuni esami disponibili per la ricerca di autoanticorpi non organo

specifici

• Anticorpi anti nucleo (ANA)• Anticorpi anti DNA nativo (dsDNA)• Anticorpi anti antigeni nucleari estraibili (ENA)• Anticorpi anti granulociti neutrofili (ANCA)• Anticorpi anti proteine citrullinate (CCP)• Anticorpi anti Istoni • Anticorpi anti fosfolipidi*

Tecniche analitiche disponibili

• Immunofluorescenza indiretta• ELISA• Immunoblot• RIA• (Immunodiffusione)• Controimmunoelettroforesi)

• Citofluorimetria• Microarray

Immunofluorescenza indiretta

• Incubazione del siero, opportunamente diluito, su un substrato ricco dell’antigene bersaglio

• Lavaggio con tampone per eliminare gli anticorpi non specifici, quindi non legati all’antigene

• Incubazione con anticorpo anti immunoglobuline IgG (IgA) umane coniugato con Isotiocianato di fluoresceina

• Lavaggio con tampone• Al microscopio a fluorescenza le strutture dove si

sono formati complessi antigene anticorpo appaiono colorate in verde

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA PER ANA

• Test di screening: immunofluorescenza indiretta su coltura di cellule epiteliali (Hep2) alla diluizione 1:80

• Titolazione: diluizioni successive fino alla scomparsa della fluorescenza

• Identificazione e descrizione del tipo o “pattern” fluorescente osservato

• In caso di positività è opportuno procedere con esami di secondo livello: ricerca di anticorpi anti DNA , ENA

• Solo in rarissimi casi pazienti negativi per anti-nucleo risultano positivi per anti DNA o ENA

• Limite del metodo: l’esperienza dell’operatore

ANA test di primo livello

• Da eseguire in immunofluorescenza indiretta su cellule Hep2

• Individuabili più di 30 pattern nucleari e citoplasmatici

• Vi è associazione significativa con alcune patologie autoimmuni

• Compaiono precocemente nella malattia • Talvolta precedono i segni clinici• Da valutare con cautela: i bassi titoli, il dato isolato• Non sempre l’entità del titolo correla con

l’andamento della malattia • La titolazione è comunque utile per individuare altre

specificità presenti

Da ricordare: anticorpi anti nucleo a basso titolo possono essere presenti

• In soggetti sani• In gravidanza• Nelle donne >40 anni• Negli anziani

• In alcune neoplasie• Nell’insufficienza renale• In alcune infezioni virali (mononucleosi, AIDS)

WHO 66/233 (1:80)

L’immunofluorescenza indiretta, se effettuata in

un “sistema” ben controllato consente

• Di individuare un gran numero di autoanticorpi nucleari e citoplasmatici

• Di individuare anticorpi diretti verso antigeni espressi solo in determinate fasi cellulari

• Di rilevare la presenza di anticorpi presenti in concentrazioni molto basse

periferico

lamine nucleari

omogeneo

Granulare (speckled)

Speckled & fuso

lisosomi

ribosomi

Omogeneo+speckled+

nuclear dots

Fuso mitotico

Anticorpi anti DNA• Farr (RIA): il “gold standard”. Rileva anticorpi ad

alta affinità. Indaginoso, è poco usato per motivi pratici.

• Immunofluorescenza indiretta (su Chritidia Luciliae). Altamente specifico, rileva anticorpi ad alta affinità. Limite: qualitativo.

• ELISA: sempre più utilizzato. Vantaggio: quantitativo. Limite: a volte ad un’alta sensibiltà si contrappone una minore specificità. Si possono riscontrare falsi positivi anche utilizzando antigeni ricombinanti.

• Immunoblot : non soddisfacente• Citofluorimetria : ancora risultati scadenti• Microarray: in fase di sperimentazione

ANTICORPI anti-DNA NATIVO - double stranded DNA ( test di secondo livello)

• Uno dei criteri diagnostici per il LES secondo l’American College of Rheumatology

• Prevalenza variabile nel LES dal 40 all’80%; raramente presenti ad alto titolo in altre patologie (IgG)

• Il titolo segue l’attività della malattia

ENAtest di secondo livello

• Sono antigeni nucleari (proteine associate al DNA o all’RNA) o citoplasmatici

• La presenza di anticorpi verso uno o più di questi antigeni caratterizza il profilo sierologico della malattia

• Hanno notevole specificità per alcuni quadri clinici

• Hanno notevole significato diagnostico e prognostico

• Compaiono precocemente

• Non è necessario un risultato quantitativo (tranne semmai che per RNP): la quantità di anticorpi determinabili non correla con l’andamento della malattia

ENA

metodiche disponibili

• Immunodiffusione doppia• Controimmunoelettroforesi• ELISA• Immunoblot• Dot blot• Citofluorimetria• Microarray

ENA: nessuno è perfetto

• ELISA: molto sensibile, a volte poco specifica. Grandi differenze qualitative tra i prodotti in commercio

• Immunoblot: non adatto per tutti gli antigeni• (Immunodiffusione: specifica, con sensibilità

buona, ma difficile da interpretare : in disuso)• (Controimmmunoelettroforesi: lunga e

complessa. Poco usata)• Citofluorimetria, microarray: ancora da

perfezionare• In conclusione: l’optimum sarebbe poter

utilizzare sempre due metodiche

Immunoblot

• Proteine estratte da cellule Hep2 vengono separate con SDS PAGE

• al termine dell’elettroforesi le proteine, separate in base al peso molecolare, vengono selezionate e trasferite su nitrocellulosa in base a pannelli predefiniti

• il siero in esame viene posto in incubazione sulle strisce pretrattate: eventuali autoanticorpi si legano agli specifici antigeni. La loro evidenziazione avviene con un siero anti-immunoglobuline umane coniugato con enzima.

• La reazione con il substrato evidenzia la presenza di bande, che vengono confrontate con quelle ottenute da sieri di riferimento su una striscia di controllo

I = Controllo positivo.II= Controllo negativoIII= Campione positivo per SSA ed SSB

ELISA

• Per gli ENA esistono buoni kit in immunoenzimatica

• La determinazione quantitativa non è in realtà necessaria

• Risultati più affidabili se il coating delle piastre è fatto con l’antigene specifico piuttosto che con un pool di antigeni (ENA screening”)

Vi è notevole incertezza nel definire quale sia la modalità migliore per la preparazione degli antigeni

ENA:l’utilizzo degli Ag nativi consente il mantenimento dei principali epitopi conformazionali, ma la

preparazione è costosa e complessa.Quanto alle metodiche impiegate, quelle in cui l’antigene è allo

stato nativo sono quelle a più bassa sensibilità e a più alta specificità.

Biochip

Citofluorimetria

Le più autorevoli associazioni operanti nel campo dell’ Autoimmunità (FIRMA, SiMeL, AMCLI..) propongono linee guida per la diagnostica

autoimmune:• Per raggiungere la migliore accuratezza diagnostica• Per fornire al clinico informazioni precise• Per inquadrare il più possibile il paziente• Per limitare incertezze e dubbi in un campo in cui sovente

le patologie hanno un esordio subdolo • e nel contempo • Per limitare gli sprechi dovuti a richieste non appropriate• Per ridurre il carico economico sia sul paziente che sulla

Regione in un percorso diagnostico che richiede esami spesso costosi

• Per utilizzare al meglio le risorse umane e tecniche• Il percorso dovrebbe essere condiviso dai clinici e dagli

specialisti di laboratorio

Esistono Linee guida per

• ANA• DNA• ENA• ANCA• ANTICORPI ANTI FOSFOLIPIDI

Esistono percorsi diagnostici suggeriti per la ricerca di

autoanticorpi

• Nelle connettiviti sistemiche

• Nella celiachia

• Nelle vasculiti

• Nel diabete mellito di tipo I

SOSPETTO di LES ?

Ab anti-nucleopresenti >1:80

Pattern:Omogeneo (DNA)Periferico (DNA)Granulare (RNA)

Granulare atipico (PCNA)

Ab anti-DNA ENA

LESimprobabile

A titolo elevato possibile LES

si

no

SMPCNA:

probabilediagnosi di LES

SSA SSBRNP:

associazione anche con

altre patologie

++

LESpattern antigene specificità

omogeneo/ DNA elevataperiferico istoni LES da farmaci

granulare RNA: Sm elevataSS-A lupus discoide

SS-B, RNP

granulare atipico PCNA elevata(pleomorfico)

citoplasmatico proteine ribosomiali elevatadenso

omogeneo

Sm?

PCNA

SCLEROSI SISTEMICA

pattern antigene specificità

nucleolare RNA polimerasi elevata fibrillarina

granulare SS-A SS-B

omogeneo e DNA topoisomerasi (SCL70) elevatanucleolare Pm/Scl

centromerico centromero elevata per CREST

SINDROME DI SJÖGREN

pattern antigene specificità

granulare RNA: SS-A SS-B frequente **blocco cardiaco fetale

nucleare atipico,puntiforme (nucleardots)

apparato mitotico

Apparato di Golgi

Nuclear dots

midbody

POLIMIOSITE - DERMATOMIOSITE

pattern antigene specificità

citoplasmatico tRNA sintetasi (Jo1) elevata (non presenti ANA)

omogeneo e Pm/Sclnucleolare

JO1

MALATTIA MISTA DEL CONNETTIVO (MCTD)

pattern antigene specificità

granulare RNP presenti a concentrazione più elevata che nel LES

Seguire le linee guida

Dare al paziente ed al clinico le informazioni appropriate

Contenere i costi ed i tempi

ARTRITE REUMATOIDE

La presenza di alcuni autoanticorpi è comune in molti pazienti con Artrite Reumatoide. Tuttavia:

• sono presenti a basso titolo (ANA, DNA)

• sono generalmente poco specifici, ad eccezione degli anticorpi anti proteine citrullinate. Se la determinazione è effettuata con test di terza generazione, la specificità risulta del 98% con una sensibilità fino al 70%

• l’introduzione di tali test in combinazione con il Fattore Reumatoide può essere un utile strumento per la diagnosi precoce: alcuni studi suggeriscono che la presenza di tali anticorpi sia un marcatore prognostico

Sindrome da anticorpi antifosfolipidi

• Sintomi- criterio:

• Trombosi vascolari• Patologie ostetriche

• Test criterio:

• LAC• Anti Cardiolipina• Anti Beta 2 Glicoproteina

Criteri diagnostici

• LAC positivo• Anti Cardiolipina IgG/IgM positivo *• Anti Beta2 Glicoproteina IgG/IgM *positivo• Positività ad uno dei test in due determinazioni

ad almeno 3 mesi una dall’altra

• (*: eseguito con ELISA standardizzato; valutare con attenzione basse positività))

• All’aumentare del numero di test positivi aumenta il rischio di eventi tromboembolici

VASCULITI ANCA - ASSOCIATE

Granulomatosi di WegenerSindrome di Churg-StraussPoliangioite microscopica

• Gli ANCA sono generalmente assenti in alcune vasculiti primarie dei vasi di medio e grosso calibro: poliarterite nodosa, arterite temporale, arterite di Kawasaki, Takayasu, malattia di Bechet.

• In presenza di manifestazioni cliniche che suggeriscono la diagnosi, il riscontro di ANCA ha elevata sensibilità (>80%) e specificità (>95%)

ANCA metodiche disponibili

• Immunofluorescenza indiretta su granulociti umani fissati in etanolo

• ELISA (PR3)= fluorescenza citoplasmatica (c ANCA)

• ELISA (MPO)= fluorescenza perinucleare (p ANCA)

• Immunofluorescenza indiretta su granulociti fissati in formalina

Per una corretta diagnostica degli ANCA

• Screening su granulociti fissati in etanolo• Per i positivi (sia con pattern citoplasmatico

che perinucleare)• a) ELISA (proteinasi 3, mieloperossidasi)• b)Immunofluorescenza indiretta su granulociti

fissati in formalina. I positivi presentano sempre fluorescenza citoplasmatica

VASCULITI ANCA ASSOCIATE

pattern principale antigene

perinucleare / nucleare MPO (mieloperossidasi)

citoplasmatico PR3 (proteinasi 3)