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1S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Jean-Pierre Astier,Françoise Bonneté,Natalie Ferté,Stéphane Veesler
Diffusion de la LumiDiffusion de la Lumièère et Cristallisationre et Cristallisation
2S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Pour Comprendre les Mécanismes de la Croissance Cristalline:Pour Comprendre les Mécanismes de la Croissance Cristalline:Même Mécanismes pour Petites et Macro MoléculesMême Mécanismes pour Petites et Macro Molécules
Bon Modèle pour les PhysiciensBon Modèle pour les Physiciens↓↓
Application:Application:Utilisation de cette Connaissance pour Concevoir des ExpériencesUtilisation de cette Connaissance pour Concevoir des Expériences
pour obtenir les Premiers Cristauxpour obtenir les Premiers Cristauxet Produire des Cristaux de Meilleurs Qualitéet Produire des Cristaux de Meilleurs Qualité
Pour la résolution Structurale (BioPour la résolution Structurale (Bio--cristallographie)cristallographie)
Une Question de Physicien:Pourquoi Etudier la Cristallisation des Protéines?
Diffusion de la LumiDiffusion de la Lumièère et Cristallisationre et Cristallisation
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3S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Diffusion de la LumiDiffusion de la Lumièère et Cristallisationre et Cristallisation
INTRODUCTIONINTRODUCTION
Depuis 1978, où la diffusion quasi-élastique de la lumière (DQEL) a été utilisée, pour la première fois, pour étudier les premiers moments de la cristallisation des protéines, on utilise souvent l’anglicisme PRENUCLEATION pour décrire les premiers stades de la cristallisation [Kam Z., Shore H.B. and Feher G. (1978). "On the crystallization of proteins." J. Mol. Biol. 123: 539-555].
Les études des solutions de protéines par les techniques de diffusion des rayonnements (lumière, X et neutrons) couplées à des outils de simulation numérique, ont apporté une aide à la cristallisation et une compréhension du lien entre conditions de cristallisation et interactions.
Dans le but de rationaliser les essais de cristallisation on peut proposer des tests/diagnostics à partir de l'étude de l’états des molécules en solution et de leur interactions.
Dans la présentation suivante, je ferai quelques rappels sur la technique de diffusion de la lumière puis je présenterai quelques exemples.
4S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Une Approche PhysicoUne Approche Physico--chimique:chimique:Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution→→ Diffusion de la Lumière Diffusion de la Lumière –– Statique et DynamiqueStatique et Dynamique→→ DDiffusion des RX aux Petits Anglesiffusion des RX aux Petits Angles
Besoin de Critères pour Choisir/DéterminerBesoin de Critères pour Choisir/Déterminerde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisationde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisation
«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de Phases
Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)
Diffusion de la LumiDiffusion de la Lumièère et Cristallisationre et Cristallisation
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5S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Macromolécule en solution, Detergent + Lipide⊕
Température, pH, Force Ionique et Nature, [PEG],...
Diagramme de Phases / Courbes de SolubilitéDiagramme de Phases / Courbes de Solubilité
Dépletion
van der Waals, Coulombienne,et Hofmeister
+
-+
+
+
+
+
+
- --
--
-
6S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
DXPA0°< 2θ <5°λ = 1.54 Å
Diffusion Lumière150°< 2θ <10°λ = 514 nm
d
d
Techniques Idéales pour Étudier les Solutions deTechniques Idéales pour Étudier les Solutions deMacromolécules, Nanoparticules…Macromolécules, Nanoparticules…
Principes de la Diffusion des RayonnementsPrincipes de la Diffusion des Rayonnements
Faisceau incident λRayon X ou lumière
s =1/d= 2sinθ/λ (Å-1)
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7S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Diffusion de la Diffusion de la LumièreLumière1. Rappels Théoriques (de 1869 aux années 1980)
Interactions Photons-Matière: Ici Diffusion (Rayleigh ou Mie).Le Laser induit une polarisation de la molécule qui elle même ré-émet de la Lumière comme une source secondaire : c’est la Diffusion de la Lumière.
Variation de Fréquence (Δν), I(θ) et la Polarisation = f(Taille - Masse, Forme, Interactions)
Soit d<<λ diffusion des petites particules assimilées à des points (isotropes)Soit d≥λ plus complexe, il faut tenir compte de la dépendance angulaire, des
problèmes de polarisation et d’indice optique des particules.
8S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Diffusion de la Diffusion de la LumièreLumière
Dans la cas (1) on s’intéresse aux valeurs de l’Id sans mesurer la Δν = Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)Dans la cas (2) on s’intéresse à Δν = Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)
(1) Intensité Diffusée (Id)Théorie des fluctuations (Smoluchowski, Einstein) pour expliquer la valeur de l’Id: les Fluctuations Thermiques donnent des Fluctuations de Concentrations.Id est reliée à ces Fluctuations… Compressibilité Isotherme … Interactions.
Debye et Zimms de leur cotés s’intéressent à la dépendance angulaire de l’Id:cela donne la mesure de Mw, Rg, Forme et A2.
(2) Fréquence de l’Id, variation temporelle1964 Pecora montre que l’on peut mesurer DT (et DR dans certain cas) à partir de l’étude des Fréquences
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9S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
(1) Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)d < λ/10 (≈ 50nm)
Particules isotropes assimilées à des diffuseurs ponctuels
Intensité diffusée indépendante de l’angle d’observation (θ)
KC/ΔI=1/Mw +2A2C
avec K= K’(dn/dC)2 Iref2π2/λ04 n0
On obtient Mw et A2 par la mesure Isolvant, Iref et I en Fonction de C
A2 < 0 Interactions Attractives,A2 > 0 Interactions repulsives,A2 = 0 Peu ou Pas d'Interaction.
A2 est relié à la distribution spatiale des particules
« Wilson Slot »
10S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
(1) Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)
d ≥λ/10 (≈ 50nm)
Intensité diffusée dépend de l’angle d’observation (θ)
Interférences (déphasage) entre les différentes parties d’une particule
Introduction du facteur de forme P (θ).
KC/ΔI=1/Mw (1+ q2Rg23) +2A2C
On obtient Mw, Rg et A2 par la mesure Isolvant, Iref et I en f(C, θ) (Zimm Plot)
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11S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
(2) Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)
Les macromolécules en solution sont en mouvement (translation, rotation et vibration)donc l'Intensité Diffusée va fluctuer au cours du temps.Analyse des fluctuations = informations structurales et dynamiques
Ces fluctuations vont ressembler à du bruit.Pour sortir le signal du bruit l’outil c’est la fonction de corrélation.
12S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Fonction d’autocorrélation G(τ) = <I(0).I(τ)>Décroît de <I(0)2> à <I(0) >2
(2) Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)
<I(0)2>
<I(0)>2
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13S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Fonction d’autocorrélation G(τ) = <I(0).I(τ)>
Cas d’une Solution idéale* monodisperse G(τ) ≈ exp(-D0q2/τ)Ln(G(τ)) ≈ B0- D0q2 τ
et D0 = kBT/6πη0Rh
Cas d’une Solution idéale* polydisperse G(τ) ≈ Σexp(-Di,0q2/τ)
* Sans interaction
En général particules en interactions alors on mesure un Deff
(2) Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)
14S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
On approche G(τ) ≈ exp(-<D>zq2/τ)Et on développe Ln(G(τ)) ≈ B0- <D>zq2 τ +B2 τ2… (Cumulants)
<D>z= ΣNiMi2Di/ ΣNiMi
2
B2 = variance du <D>z ou facteur de qualité ou Polydispersité
(2) Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)
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15S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Les Fluctuations d'Intensité Diffusée sont Reliées à la Diffusion des Macromolécules dans le Solvant
Dm , D0, KD , Rh et vDm=D0(1+KD C)
KD < 0 Interactions Attractives,KD > 0 Interactions repulsives,KD = 0 Peu ou Pas d'Interaction.
D0 = kBT/6πη0Rh
v : Facteur de Qualité ou Polydispersité.
(2) Diffusion Dynamique de la Lumière(ou Quasi-Élastique)
Rq: en Général Dm ≠ D0 donc Rh ≠kBT/6πη0Dm
16S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
I(c,s) = I(0,s) ≠ S(c,s)
Facteur de Structure S(c,s)⇓
Coefficient du Viriel (A2)
I(c,s) quand c : RepulsiveI(c,s) quand c : Attractive
Dm = D0 (1 + kD. C)
kD = kH –kS
Statique (kS)+ Hydrodynamique
(kH)
kD > 0 : RepulsifkD < 0 : Attractif
Coefficient du Viriel A2
A2 > 0 : Repulsif
A2 < 0 : Attractif
AvecInteractions
Rg , MwD0 , Rh , v%Mw
Rg (> λ/10)
Sans Interaction
DXPALab. ou Synchrotron
DQELLab.
DELLab.
0D..6k T.B Rh ηΠ= )3
Rgs4 exp( I(0) I(s)222Π−=
CΔI
K( dndC
)2Iref
2Mw+ ...CA1 +=
Techniques Techniques de Diffusion en Solutionde Diffusion en Solution
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17S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
0,1
1
10
100
1000
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
DXPADEL
Intensité Diffusée (a.u.)
s = 2 sinθ/λ (A-1)
Techniques ComplémentairesTechniques Complémentaires
ApoferritinRg = 55,8Å
Techniques Techniques de Diffusion en Solution:de Diffusion en Solution:DEL + DXPADEL + DXPA
18S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Montages ExpérimentauxMontages Expérimentaux
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19S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
θ
Laser
Échantillon
Détecte
ur
q= 4π/λsin(θ/2)λ=514,5nm
Montage de Diffusion de la LumièreMontage de Diffusion de la Lumière
(1) On s’intéresse aux valeurs de l’ Intensité Diffusée (moyenne)sans mesurer la Δν = Diffusion Statique de la Lumière (ou Élastique)
(2) On s’intéresse à Δν = Diffusion Dynamique de la Lumière (ou Quasi-Élastique)Variation temporelle de Id
20S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
θ
Laser Echantillon
Photomultiplicateur
PC Correlateur
Diffusion de la LumièreDiffusion de la Lumière
q= 4π/λsin(θ/2)λ=514,5nm
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21S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
NanoSTAR
ESRF Synchrotron CRMCN
AppareillagesAppareillagesde Diffusion de la Lumièrede Diffusion de la Lumière
22S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
AppareillageAppareillagede Diffusion de la Lumièrede Diffusion de la Lumière
Banc de Mesure en Diffusion de la Banc de Mesure en Diffusion de la LumièreLumière
Système d’Acquisition des Système d’Acquisition des DonnéesDonnées
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23S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Cellule de Cellule de MesureMesureΦΦ=8mm=8mm
Cellule de Diffusion de la LumièreCellule de Diffusion de la Lumière
Bouchon Hermétique
Cellule en Verre
SolutionVolume mini=80µl
24S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Pratiquement:Attention aux poussièresAttention à la Diffusion Multiple (transparence)< I(t) > ou dI(t) en Fonction de C :
Attention oligomèrisation = f(C)En Diffusion Statique de la Lumière On s’intéresse à<I(t)>
Connaître dn/dC et l’indice de réfraction du milieuouverture maximale (détecteur)
En Diffusion Dynamique de la Lumière On s’intéresse à dI(t)Connaître la viscosité et l’indice de réfraction du milieuouverture minimale (détecteur)
Diffusion de la Diffusion de la LumièreLumière
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25S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Exemples / ApplicationsExemples / Applications
26S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
αα--AmylaseAmylasev < 10%
v > 10%
Monomères
Do = 5,8 x 10¯ cm²/s
Rh = 37Å
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Veesler et al. Acta Cryst. D (1994)
PrénucléationPrénucléation par DQELpar DQELDiagnosticDiagnostic
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27S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
0
20
40
60
80
0 0.5 1 1.5 2 2.5
v < 5%
v > 15%
Concentration (mg/ml)
NaCl (M)
20°C
Lafont et al. J. Cryst. Growth (1994)
PrénucléationPrénucléation par DQELpar DQELDiagnostic Diagnostic BPTIBPTI pH 4pH 4,,55
D0 = 9,2 × 10-7 cm2/s
Rh = 23,1 Å
Oligomères de BPTIDXPA
28S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
En Résumé
- La Monodispersité* est un bon Critère
- Les Agrégats sont à Éviter
*à la Résolution de la DQEL
PrénucléationPrénucléation par DQELpar DQELDiagnosticDiagnostic
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29S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
5 10-6
6 10-6
7 10-6
8 10-6
9 10-6
1 10-5
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01
Tris 50mM pH8
NaPhosphate 100mM pH8
Tris 50mM NaCl 100mM pH8
Kc/R90
(mol.g-1)
c (g/ml)
A2>0 repulsion
A2<0 attraction
Exemple de l’Urate Oxidase(F. Bonneté – M. Giffard)
Mexp =127000Da (Muox=135000Da)1/M
c2AM1
ΔIKc
290
+=
Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DELpar DEL
30S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10
Tris 50mM pH 8
Tris50mM NaCl 100mM pH 8
% PEG 8000
Solubility uox (g/l)
Solubilité Augmente
Solubilité Diminue
A2>0 repulsion
A2<0 attraction
Exemple de l’Urate Oxidase(F. Bonneté – M. Giffard)
Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DELpar DEL
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31S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Détermination de la cmc Determination du A2
Loll et al. Mesurent les Interactions entre Micelles de Détergent (sans Protéine)
Milieu de Cristallisation de la Porine Ompf (Protein Science 2000)
Interactions Moléculaires par DELInteractions Moléculaires par DEL
32S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Détermination du A2 Comparaison des A2
Interactions Moléculaires par DELInteractions Moléculaires par DEL
Loll et al. Mesurent et Comparent les Interactions entre Micelles de Détergent et entre Complexes Protéine-Détergent
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33S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Interactions Moléculaires par DELInteractions Moléculaires par DEL1. Les solutions de Micelles de Détergents sans protéine ont un comportement proches de celles avec la Protéine.
Importance du Milieu de Cristallisation
2. La valeur du A2 est un bon Critère de Cristallisation
34S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Etude du Milieu de Cristallisation sans Protéine:Detergent + Lipide
⊕Température, pH, Force Ionique et Nature, [PEG],...
Interactions Moléculaires par DELInteractions Moléculaires par DEL
Attention Contre-Exemple:J. Blouwolff JCG 303 (2007)
« Crystallization conditions of membrane protein CLC-ec1:An example outside the crystallization slot »
N-octyl-β-maltoside / PEG 400 /pH=4,5
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35S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
5
6
7
8
9
0 20 40 60
1.4 M NaCl1.7M NaCl2M NaCl0.35M KSCN
D 10 7 (cm2/s)×
C (mg/ml)
= 1.25M (NH4)2SO4
Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DQELpar DQEL
Rh = 23,1 Å
D=D0(1+KDC)
BPTIBPTIpH 4pH 4,,55
En Conditions de En Conditions de CristallisationCristallisation les Interactions les Interactions sontsont AttractivesAttractives
36S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Solubilités (mg/ml)
Force Ionique (M)
KSCN
NaCl
(NH4)2SO4
-40
-30
-20
-10
0
10
0 1 2 3 4 5 6Force Ionique (M)
NaClKSCN
(NH4)2SO4
ΚD
Solubilités Solubilités Interactions MoléculairesInteractions Moléculaires
Lafont et al. J. Cryst. Growth (1997)
BPTIBPTIpH 4pH 4,,55
Très Bonne Très Bonne CorrelationCorrelation entre l’Intensité des Interactionsentre l’Intensité des Interactionset la Solubilité:et la Solubilité:
Plus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est FaiblePlus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est Faible
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37S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
SiSi les Interactions les Interactions sontsont trop trop IntensesIntensesDemixtionDemixtion
cas ducas du BPTIBPTI--KSCNKSCN
Grouazel et al. Acta Cryst. 2002, D58, 1560.
38S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Concentration
Températureou[Cristallisant]-1
Cc
Tc
Séparation de Phases ThermoSéparation de Phases Thermo--InduiteInduiteFacile à RéaliserFacile à Réaliser
Séparation de PhasesSéparation de Phases par Variation de Compositionpar Variation de CompositionBalayage IsothermeBalayage Isotherme
Séparation de Phases LiquideSéparation de Phases Liquide--LiquideLiquide
MeilleursConditions
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39S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
En Résumé
-En Conditions de Cristallisation les Interactions sont Attractives
-Très Bonne Corrélation entre l’Intensité des InteractionsAttractives et la Solubilité
--Interactions Attractives Trop Intenses =Précipitation ou Démixtion
Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DLpar DL
40S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution
Besoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière RationnellBesoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière Rationnelle les e les Conditions de CristallisationConditions de Cristallisation
La La MonodispersitéMonodispersité est un bon Critère est un bon Critère -- Les Les AgrégatsAgrégats sont à Évitersont à Éviter
«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de PhasesTrès Bonne Corrélation entre les InteractionsTrès Bonne Corrélation entre les Interactions et les Conditions de et les Conditions de CristallisationCristallisation
Approche PhysicoApproche Physico--chimiquechimique Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS(HTS))
Diffusion de la LumiDiffusion de la Lumièère et Cristallisationre et Cristallisation
En Conclusion:En Conclusion:
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41S. Veesler - Atelier Cristallisation Carry 26-29 novembre 2007
Diffusion de la Lumière et Cristallisation
Jean-Pierre Astier,Françoise Bonneté,Natalie Ferté,Stéphane Veesler
A Tester/Valider sur les Protéines Membranaires
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