DIJAGNOZA BAKTERIOZA - University of Belgrade 6... · C) Izolacija fitopatogenih bakterija i D)...

DIJAGNOZA

BAKTERIOZA

Dijagnoza ili Identifikacija?

Detekcija ili Dijagnoza?

DIJAGNOZA Dijagnoza je proces određivanja uzroka bolesti

Dijagnoza može biti preliminarna (90%) i potvrdna (100%)

- Preliminarna obuhvata izolaciju i neku vrstu identifikacije patogena

- Potvrdna podrazumeva i proveru patogenosti na domaćinu, mada u nekim slučajevima molekularne metode zamenjuju potrebu za ovim testom

DIJAGNOZA

Precizna i brza dijagnoza prouzrokovača

biljnih bolesti je preduslov za efikasnu

zaštitu.

DIJAGNOZA

1. Informacije o rasprostranjenosti oboljenja,

njegova pojava u prošlosti, distribucija u

okviru parcele, nega useva, primena

đubriva i pesticida, plodored...

2. Posmatranje promena na obolelom tkivu,

mikroskopski pregled biljnog materijala,

Kohovi postulati, identifikacija

DIJAGNOZA

A. Simptomi (uvelost, nekrotična pegavost, plamenjača, vlažna trulež, hipertrofija, žutilo.........)

B. Mikroskopski pregled

C. Izolacija fitopatogenih bakterija

D. Provera patogenosti

E. Identifikacija (bakteriološke karakteristike, analiza masnih kiselina - FAA, Biolog, fagi, serologija, molekularne metode)

A) Simptomi

B) Mikroskopski pregled

Prisustvo bakterija

Reakcija po Gramu

C) Izolacija fitopatogenih bakterija i

D) reprodukcija simptoma bolesti

Kohovi postulati (Robert Koch, 1843-1910) 1. Sumnjivi mikroorganizam mora biti prisutan u svim

testiranim uzorcima obolelog domaćina.

2. Sumnjivi mikroorganizam mora biti izolovan iz obolelog domaćina i gajen u čistoj kulturi.

3. Kada se čista kultura sumnjivog mikroorganizma inokuliše u zdravog osetljivog domaćina mora doći do reprodukcije karakterističnih simptoma.

4. Identičan mikroorganizam mora biti ponovo izolovan iz experimentalno inokulisanog i zaraženog domaćina, tj. mora posedovati identične karakteristike kao i mikroorganizam u tački 2.

E) Identifikacija

Identifikacija je proces postavljanja izolata

u neki od poznatih taksona

Često se još zove i Determinacija

Započinje dobijanjem čiste kulture

patogena

E) Identifikacija

Biohemijsko-fiziološke karakteristike

Automatizovane metode (BIOLOG, FAA)

Enzimski imunoadsorpcioni test (ELISA)

Lančano umnožavanje fragmenta DNK

(PCR)

DNK hibridizacija

Bakteriološke karakteristike Aerobni ili anaerobni razvoj

• Bakterije sa ćelijskim zidom Gram-negativni štapići –Aerobne

Pseudomonas

Acidovorax

Burkholderia

Ralstonia

Xanthomonas

Rhizomonas

Rhizobacter

Xylella (fastidious)

Agrobacterium

Rhizobium

–Fakultativno anaerobne

Erwinia

Gram-pozitivni štapići Bacillus

Clostridium (anaerobne)

Clavibacter (neke su fastidiozne)

Curtobacterium

Filamentozne (Actinomycetes) Streptomyces

• Molikute (Mollicutes), nemaju

ćelijski zid Fitoplazme

Spiroplazme

Detekcija

Detekcija je proces dokazivanja prisustva patogena u nekom uzorku

Obično se zasniva na primeni pojedinačne metode kao što je test imuno-fluorescentnosti (IF) , lančano umnožavanje fragmenta nukleinske kiseline (PCR) ili ELISA test

Detekcija može da rezultira preliminarnom dijagnozom

SEROLOŠKE

REAKCIJE

SEROLOGIJA

Zasniva se na reakciji specifičnih antitela

i antigena. Odlikuje se specifičnošću i

brzinom reakcije.

Reakcija antigen – antitelo je veoma

specifična i slikovito se prikazuje kao

odnos ključ – brava.

SEROLOGIJA

Antigen

To je supstanca koja, uneta u životinjski

organizam, stimuliše stvaranje određenih

proteina (antitela) koji se vezuju za antigen in

vivo ili in vitro.

Bakterijska ćelija ne predstavlja jedinstven antigen,

već se sastoji od više antigena koji formiraju tzv.

antigeni mozaik ili epitop. Ovi antigeni se nalaze

u ćelijskom zidu (somatski ili O-antigeni),

flagelama (flagelarni ili H-antigeni) i fimbrijama.

SEROLOGIJA

Antitela

To su specifični proteini (globulini krvnog seruma) stvoreni u organizmu životinje kao reakcija na prisustvo antigena. Serum koji sadrži antitela naziva se antiserum. Antitela ili imunoglobulini su podeljeni u nekoliko klasa (IgG, IgM, IgA, IgD i IgE), koje se razlikuju po svojoj molekulskoj težini.

SEROLOGIJA

Pliklonska antitela.- Nastaju u životinjama

imuniziranim kompleksnim antigenima ili

epitopima bakterijske ćelije.

Monoklonska antitela.- Nastaju u kulturi ćelija in

vitro. Prednosti su: 1) može se proizvesti velika

količina antitela pomoću oganičene količine

antigena; 2) proizvodnja potpuno identičnog

antitela je neograničena; 3) antitela specifična

za jedan antigen mogu se proizvesti iako je za

imunizaciju korišćen kompleksan antigen.

SEROLOŠKE REAKCIJE

1. Aglutinacija

2. Precipitacija

3. Difuzija u agaru

4. Imunofluorescencija

5. Enzimski imunoadsorpcioni test (ELISA)

6. Dot-blot

Detekcija serološkim

metodama

Aleksa Obradović

Poljoprivredni fakultet, Zemun

Institut za zaštitu bilja i prehrambenih proizvoda

Aglutinacija na pločici

Spot check LF Neogen

Spot check LF je novi dijagnostički proizvod, pogodan za

primenu na terenu ali i u dijagnostičkim laboratorijama.

Upotreba ovog testa je veoma jednostavna, ali pažljivim

praćenjem datog uputstva osiguraćete njegovu maksimalnu

efikasnost i pouzdanost.

Spot check LF Neogen

1. Priprema uzorka

Fragment lista, na kome su uočeni karakteristični simptomi,

ubaciti u bočicu sa ekstrakcionim puferom, zatvoriti i dobro

promućkati 20ak sekundi.

Spot check LF Neogen

2. Uvući pipetom polovinu

sadržaja macerata iz

bočice, sipati 2 kapi u

rezervoar na pločici i

posmatrati pojavu plave

boje u test polju na pločici.

Sačekati pojavu plave

kontrolne linije i zatim

očitati rezultat.

Negativan Nevažeći Pozitivan

C T

Enzimski imunoadsorpcioni test

(ELISA test)

P. Šta znači skraćenica ELISA?

O. Enzimski imunoadsorpcioni test.

P. Šta je ELISA test

O. To je brz imunohemijski test zasnovan na odnosu imunoloških molekula (antigen i antitelo) i aktivnosti enzima (proteina koji katališe biohemijsku reakciju).

ELISA test

P. Čemu služi ELISA test

O. ELISA test služi za detekciju supstanci antigene

prirode

P. Kako radi ELISA test

O. Postoji nekoliko varijanti ELISA testa ali u

osnovi metod je zasnovan na specifičnom

prepoznavanju i vezivanju antitela za antigen

ELISA test

Može se podeliti prema tome da li je

antigen ili antitelo vezano za zidove

mikrotitar ploče i da li je enzim konjugovan

za primarna (direktna Elisa) ili sekundarna

(inirektna Elisa) antitela.

ELISA test

ELISA test

U postupku DAS ELISA za zidove ploče prvo se vezuju specifična antitela.

Posle inkubacije i ispiranja dodaje se antigen koji se vezuje za antitela i formira imuni kompleks.

Posle inkubacije i ispiranja dodaju se enzimom konjugovana antitela koja se vezuju za specifična mesta na antigenu

Posle inkubacije i ispiranja na kraju se dodaje supstrat (AP ili HRP) koji biva razložen aktivnošću enzima što se uočava pojavom žute boje u bunarčićima

E

antitela

antigen

E enzimom konjugovana antitela

supstrat

ELISA test

ELISA test

ELISA test

MOLEKULARNE

METODE

Lančana reakcija polimeraze

(Polymerase Chain Reaction - PCR)

Osmislio je Kary Mullis 1983. godine i dobio

Nobelovu nagradu

Imitira proces umnožavanja DNK

PCR metod omogućava selektivno umnožavanje

ciljanih delova DNK u uslovima in vitro

Služi za detekciju prisustva nukleinske kiseline

poznatog organizma

PRAJMERI - kratki jednolančani molekuli DNK

(oligonukleotidi, 15-35 nt) koji su komplementarni

krajevima ciljane sekvence DNK

Oni omogućavaju kontrolisanu sintezu samo

željenih fragmenata DNK

Građa prajmera (njegove sekvence) određuje koji

će se delovi genoma umnožiti

PRAJMERI

Vizuelizacija proizvoda PCR testa