Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
DIJAGNOZA
BAKTERIOZA
Dijagnoza ili Identifikacija?
Detekcija ili Dijagnoza?
DIJAGNOZA Dijagnoza je proces određivanja uzroka bolesti
Dijagnoza može biti preliminarna (90%) i potvrdna (100%)
- Preliminarna obuhvata izolaciju i neku vrstu identifikacije patogena
- Potvrdna podrazumeva i proveru patogenosti na domaćinu, mada u nekim slučajevima molekularne metode zamenjuju potrebu za ovim testom
DIJAGNOZA
Precizna i brza dijagnoza prouzrokovača
biljnih bolesti je preduslov za efikasnu
zaštitu.
DIJAGNOZA
1. Informacije o rasprostranjenosti oboljenja,
njegova pojava u prošlosti, distribucija u
okviru parcele, nega useva, primena
đubriva i pesticida, plodored...
2. Posmatranje promena na obolelom tkivu,
mikroskopski pregled biljnog materijala,
Kohovi postulati, identifikacija
DIJAGNOZA
A. Simptomi (uvelost, nekrotična pegavost, plamenjača, vlažna trulež, hipertrofija, žutilo.........)
B. Mikroskopski pregled
C. Izolacija fitopatogenih bakterija
D. Provera patogenosti
E. Identifikacija (bakteriološke karakteristike, analiza masnih kiselina - FAA, Biolog, fagi, serologija, molekularne metode)
A) Simptomi
B) Mikroskopski pregled
Prisustvo bakterija
Reakcija po Gramu
C) Izolacija fitopatogenih bakterija i
D) reprodukcija simptoma bolesti
Kohovi postulati (Robert Koch, 1843-1910) 1. Sumnjivi mikroorganizam mora biti prisutan u svim
testiranim uzorcima obolelog domaćina.
2. Sumnjivi mikroorganizam mora biti izolovan iz obolelog domaćina i gajen u čistoj kulturi.
3. Kada se čista kultura sumnjivog mikroorganizma inokuliše u zdravog osetljivog domaćina mora doći do reprodukcije karakterističnih simptoma.
4. Identičan mikroorganizam mora biti ponovo izolovan iz experimentalno inokulisanog i zaraženog domaćina, tj. mora posedovati identične karakteristike kao i mikroorganizam u tački 2.
E) Identifikacija
Identifikacija je proces postavljanja izolata
u neki od poznatih taksona
Često se još zove i Determinacija
Započinje dobijanjem čiste kulture
patogena
E) Identifikacija
Biohemijsko-fiziološke karakteristike
Automatizovane metode (BIOLOG, FAA)
Enzimski imunoadsorpcioni test (ELISA)
Lančano umnožavanje fragmenta DNK
(PCR)
DNK hibridizacija
Bakteriološke karakteristike Aerobni ili anaerobni razvoj
• Bakterije sa ćelijskim zidom Gram-negativni štapići –Aerobne
Pseudomonas
Acidovorax
Burkholderia
Ralstonia
Xanthomonas
Rhizomonas
Rhizobacter
Xylella (fastidious)
Agrobacterium
Rhizobium
–Fakultativno anaerobne
Erwinia
Gram-pozitivni štapići Bacillus
Clostridium (anaerobne)
Clavibacter (neke su fastidiozne)
Curtobacterium
Filamentozne (Actinomycetes) Streptomyces
• Molikute (Mollicutes), nemaju
ćelijski zid Fitoplazme
Spiroplazme
Detekcija
Detekcija je proces dokazivanja prisustva patogena u nekom uzorku
Obično se zasniva na primeni pojedinačne metode kao što je test imuno-fluorescentnosti (IF) , lančano umnožavanje fragmenta nukleinske kiseline (PCR) ili ELISA test
Detekcija može da rezultira preliminarnom dijagnozom
SEROLOŠKE
REAKCIJE
SEROLOGIJA
Zasniva se na reakciji specifičnih antitela
i antigena. Odlikuje se specifičnošću i
brzinom reakcije.
Reakcija antigen – antitelo je veoma
specifična i slikovito se prikazuje kao
odnos ključ – brava.
SEROLOGIJA
Antigen
To je supstanca koja, uneta u životinjski
organizam, stimuliše stvaranje određenih
proteina (antitela) koji se vezuju za antigen in
vivo ili in vitro.
Bakterijska ćelija ne predstavlja jedinstven antigen,
već se sastoji od više antigena koji formiraju tzv.
antigeni mozaik ili epitop. Ovi antigeni se nalaze
u ćelijskom zidu (somatski ili O-antigeni),
flagelama (flagelarni ili H-antigeni) i fimbrijama.
SEROLOGIJA
Antitela
To su specifični proteini (globulini krvnog seruma) stvoreni u organizmu životinje kao reakcija na prisustvo antigena. Serum koji sadrži antitela naziva se antiserum. Antitela ili imunoglobulini su podeljeni u nekoliko klasa (IgG, IgM, IgA, IgD i IgE), koje se razlikuju po svojoj molekulskoj težini.
SEROLOGIJA
Pliklonska antitela.- Nastaju u životinjama
imuniziranim kompleksnim antigenima ili
epitopima bakterijske ćelije.
Monoklonska antitela.- Nastaju u kulturi ćelija in
vitro. Prednosti su: 1) može se proizvesti velika
količina antitela pomoću oganičene količine
antigena; 2) proizvodnja potpuno identičnog
antitela je neograničena; 3) antitela specifična
za jedan antigen mogu se proizvesti iako je za
imunizaciju korišćen kompleksan antigen.
SEROLOŠKE REAKCIJE
1. Aglutinacija
2. Precipitacija
3. Difuzija u agaru
4. Imunofluorescencija
5. Enzimski imunoadsorpcioni test (ELISA)
6. Dot-blot
Detekcija serološkim
metodama
Aleksa Obradović
Poljoprivredni fakultet, Zemun
Institut za zaštitu bilja i prehrambenih proizvoda
Aglutinacija na pločici
Spot check LF Neogen
Spot check LF je novi dijagnostički proizvod, pogodan za
primenu na terenu ali i u dijagnostičkim laboratorijama.
Upotreba ovog testa je veoma jednostavna, ali pažljivim
praćenjem datog uputstva osiguraćete njegovu maksimalnu
efikasnost i pouzdanost.
Spot check LF Neogen
1. Priprema uzorka
Fragment lista, na kome su uočeni karakteristični simptomi,
ubaciti u bočicu sa ekstrakcionim puferom, zatvoriti i dobro
promućkati 20ak sekundi.
Spot check LF Neogen
2. Uvući pipetom polovinu
sadržaja macerata iz
bočice, sipati 2 kapi u
rezervoar na pločici i
posmatrati pojavu plave
boje u test polju na pločici.
Sačekati pojavu plave
kontrolne linije i zatim
očitati rezultat.
Negativan Nevažeći Pozitivan
C T
Enzimski imunoadsorpcioni test
(ELISA test)
P. Šta znači skraćenica ELISA?
O. Enzimski imunoadsorpcioni test.
P. Šta je ELISA test
O. To je brz imunohemijski test zasnovan na odnosu imunoloških molekula (antigen i antitelo) i aktivnosti enzima (proteina koji katališe biohemijsku reakciju).
ELISA test
P. Čemu služi ELISA test
O. ELISA test služi za detekciju supstanci antigene
prirode
P. Kako radi ELISA test
O. Postoji nekoliko varijanti ELISA testa ali u
osnovi metod je zasnovan na specifičnom
prepoznavanju i vezivanju antitela za antigen
ELISA test
Može se podeliti prema tome da li je
antigen ili antitelo vezano za zidove
mikrotitar ploče i da li je enzim konjugovan
za primarna (direktna Elisa) ili sekundarna
(inirektna Elisa) antitela.
ELISA test
ELISA test
U postupku DAS ELISA za zidove ploče prvo se vezuju specifična antitela.
Posle inkubacije i ispiranja dodaje se antigen koji se vezuje za antitela i formira imuni kompleks.
Posle inkubacije i ispiranja dodaju se enzimom konjugovana antitela koja se vezuju za specifična mesta na antigenu
Posle inkubacije i ispiranja na kraju se dodaje supstrat (AP ili HRP) koji biva razložen aktivnošću enzima što se uočava pojavom žute boje u bunarčićima
E
antitela
antigen
E enzimom konjugovana antitela
supstrat
ELISA test
ELISA test
ELISA test
MOLEKULARNE
METODE
Lančana reakcija polimeraze
(Polymerase Chain Reaction - PCR)
Osmislio je Kary Mullis 1983. godine i dobio
Nobelovu nagradu
Imitira proces umnožavanja DNK
PCR metod omogućava selektivno umnožavanje
ciljanih delova DNK u uslovima in vitro
Služi za detekciju prisustva nukleinske kiseline
poznatog organizma
PRAJMERI - kratki jednolančani molekuli DNK
(oligonukleotidi, 15-35 nt) koji su komplementarni
krajevima ciljane sekvence DNK
Oni omogućavaju kontrolisanu sintezu samo
željenih fragmenata DNK
Građa prajmera (njegove sekvence) određuje koji
će se delovi genoma umnožiti
PRAJMERI
Vizuelizacija proizvoda PCR testa