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DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI
II00
I0 I1
SorgenteSorgente
RivelatoreRivelatore
CuvettaCuvetta contenente il contenente il
campione di proteina campione di proteina
a concentrazione Ca concentrazione Cll
Quando si fa passare una luce di una particolare lunghezza dQuando si fa passare una luce di una particolare lunghezza d’’onda onda λλ attraverso un attraverso un
percorso l di una soluzione di concentrazione definita, una cerpercorso l di una soluzione di concentrazione definita, una certa proporzione della ta proporzione della
luce luce èè assorbita dalla soluzione.assorbita dalla soluzione.
Se lSe l’’energia della luce incidente energia della luce incidente èè II00 e le l’’energia della luce trasmessa (dopo essere energia della luce trasmessa (dopo essere
passata attraverso la soluzione) passata attraverso la soluzione) èè II11, allora la frazione di luce trasmessa , allora la frazione di luce trasmessa èè II11/I/I00, ,
nota come nota come trasmittanzatrasmittanza TT..
Se T = 100%, la sostanza Se T = 100%, la sostanza èè trasparente.trasparente.
Se T = 0%, la sostanza Se T = 0%, la sostanza èè opaca ed assorbe completamente la luce. opaca ed assorbe completamente la luce.
LL’’assorbanza di una soluzione assorbanza di una soluzione èè direttamente proporzionale alla concentrazione del direttamente proporzionale alla concentrazione del
materiale assorbente quando il percorso della luce materiale assorbente quando il percorso della luce èè mantenuto costante. mantenuto costante.
A = logA = log1010(I(I00/I/I11) = ) = εεclcl
coefficiente dicoefficiente di
estinzioneestinzione
LL’’assorbanza assorbanza èè adimensionale.adimensionale.
Quando la concentrazione Quando la concentrazione èè espressa in molaritespressa in molaritàà (M) ed il percorso della luce in centimetri(M) ed il percorso della luce in centimetri
(cm), (cm), εε èè noto come noto come coefficiente di estinzione molarecoefficiente di estinzione molare (M(M--11cmcm--11)) di un dato composto.di un dato composto.
εε0.1%0.1%280nm280nm èè ll’’assorbanza a 280 assorbanza a 280 nmnm di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in
esame (ad es. una proteina) in una esame (ad es. una proteina) in una cuvettacuvetta lunga 1 cm. lunga 1 cm.
�� La concentrazione delle proteine può essere stimata misurandoLa concentrazione delle proteine può essere stimata misurando ll’’assorbanza assorbanza
delle soluzioni contenenti le proteine a 280 delle soluzioni contenenti le proteine a 280 nmnm (UV)(UV)
�� Il metodo Il metodo èè adoperato comunemente perchadoperato comunemente perchéé non distrugge il campione ed non distrugge il campione ed èè
molto rapidomolto rapido
�� La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento aLa maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 280 nmnm per per
la presenza degli amminoacidi aromatici la presenza degli amminoacidi aromatici triptofanotriptofano (W), tirosina (Y) e (W), tirosina (Y) e
fenilalaninafenilalanina (F)(F)
�� PoichPoichéé la composizione in amminoacidi delle proteine varia notla composizione in amminoacidi delle proteine varia notevolmente, evolmente,
ll’’assorbimento molare varierassorbimento molare varieràà anchanch’’esso di molto, a seconda del contenuto esso di molto, a seconda del contenuto
di questi amminoacidi di questi amminoacidi
Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo dProteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280 i assorbimento a 280
nmnm, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avra, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di nno elevati valori di
assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nmnm..
Il metodo non Il metodo non èè quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e nquindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto e sia noto
ll’’assorbimento molare.assorbimento molare.
H2N CH C
CH2
OH
O
HN
Trp (Triptofano)
H2N CH C
CH2
OH
O
OH
Tyr (Tirosina)
H2N CH C
CH2
OH
O
Phe (Fenilalanina)
Determinazione della concentrazione proteica Determinazione della concentrazione proteica
mediante spettrofotometriamediante spettrofotometria
Ass
orb
imen
toA
ssorb
imen
to
Lunghezza dLunghezza d’’onda onda ““λλ”” ((nmnm))
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
Spettro di assorbimento UVSpettro di assorbimento UV--VIS di una proteinaVIS di una proteina
Picco di assorbimento diPicco di assorbimento di
Tirosine, Tirosine,
TriptofaniTriptofani e e
FenilalanineFenilalanine
UV = 200 UV = 200 nmnm –– 350 nm350 nm
NecessitNecessitàà di utilizzare di utilizzare cuvettecuvette di quarzodi quarzo
A meno che la proteina non sia libera da altri composti che assA meno che la proteina non sia libera da altri composti che assorbono luce a orbono luce a
280 280 nmnm, i risultati saranno poco accurati, i risultati saranno poco accurati
Gli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perchGli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perchéé gli anelli purinici e gli anelli purinici e
pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 a 260 nmnm, con un , con un
assorbimento considerevole che si estende fino a 280 assorbimento considerevole che si estende fino a 280 nmnm
Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentraSe gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione zione
della proteina può essere stimata adoperando una formula della proteina può essere stimata adoperando una formula che che
corregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nuclecorregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nucleici: ici:
[proteina] (mg/ml) = 1,55 A[proteina] (mg/ml) = 1,55 A280280 –– 0,76 A0,76 A260260
�� Non Non èè distruttivodistruttivo
�� Consente misure in continuo, ad esempio su un eluente di una coConsente misure in continuo, ad esempio su un eluente di una colonna lonna
cromatograficacromatografica
�� Il limite di sensibilitIl limite di sensibilitàà può essere aumentato in maniera significativa può essere aumentato in maniera significativa
misurando i massimi di assorbimento a lunghezza dmisurando i massimi di assorbimento a lunghezza d’’onda comprese traonda comprese tra
190 e 220 190 e 220 nmnm
Il reattivo del Il reattivo del biuretobiureto èè costituito da una soluzione di solfato di rame costituito da una soluzione di solfato di rame
alcalino contenente potassio tartrato di sodioalcalino contenente potassio tartrato di sodio
In condizioni alcaline gli ioni rameici CuIn condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+2+ formano un complesso formano un complesso
di coordinazione con quattro gruppi di coordinazione con quattro gruppi ––NH presenti in altrettanti NH presenti in altrettanti
legami peptidicilegami peptidici
Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, conIl complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a un picco a
550 550 nmnm
N
CU+2
NR
O
N
N R
O
CuCu2+2+
Scarsa sensibilitScarsa sensibilitàà: il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione : il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione
di concentrazioni inferiori ad 1 mg/mldi concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml
Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su campioni proteici campioni proteici
ottenuti per precipitazione con ammonio solfato peottenuti per precipitazione con ammonio solfato perchrchéé questi campioni questi campioni
contengono alte concentrazioni di ammonio contengono alte concentrazioni di ammonio
Essendo basato sullEssendo basato sull’’interazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodointerazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodo
èè universabileuniversabile e molto riproducibile e molto riproducibile
Consiste nella reazione del Consiste nella reazione del biuretobiureto, seguita dalla riduzione in condizioni alcaline , seguita dalla riduzione in condizioni alcaline
del reagente di Folindel reagente di Folin--Ciocalteu (acidi misti di Ciocalteu (acidi misti di fosfomolibdotungstatofosfomolibdotungstato))
Gli ioni di rame facilitano il processo di riduzioneGli ioni di rame facilitano il processo di riduzione
I gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici coI gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici complessati con rame mplessati con rame
((biuretobiureto) ed i ) ed i molibdotungstatimolibdotungstati ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da
tirosina, triptofano ed amminoacidi polaritirosina, triptofano ed amminoacidi polari
Il prodotto della reazione, Il prodotto della reazione, eteropolimolibdenoeteropolimolibdeno, ha una forte colorazione blu, , ha una forte colorazione blu,
con un massimo di assorbimento a circa 750 con un massimo di assorbimento a circa 750 nmnm
Poco costosoPoco costoso
Di facile esecuzioneDi facile esecuzione
Altamente riproducibileAltamente riproducibile
Molto sensibile: Molto sensibile: èè possibile determinare concentrazioni fino a 10 possibile determinare concentrazioni fino a 10 µµg/mlg/ml
EE’’ soggetto ad interferenze da parte di una varietsoggetto ad interferenze da parte di una varietàà di sostanze, quali Tris, di sostanze, quali Tris,
HEPES ed EDTAHEPES ed EDTA
Le curve Le curve standardstandard sono lineari solo a basse concentrazioni proteichesono lineari solo a basse concentrazioni proteiche
Sono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riSono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riproducibiliproducibili
La reazione dipende dal pH ed La reazione dipende dal pH ed èè necessario avere un pH compreso tra 10 necessario avere un pH compreso tra 10
e 10.5 e 10.5
Recentemente sono stati introdotti un certo numeroRecentemente sono stati introdotti un certo numero
di reagenti alternativi per la determinazionedi reagenti alternativi per la determinazione
degli ioni rameici, i quali consentono di effettuaredegli ioni rameici, i quali consentono di effettuare
un saggio un saggio pipiùù conveniente e riproducibileconveniente e riproducibile ……
La reazione del BCA (acido La reazione del BCA (acido bicinconinicobicinconinico) ) èè simile a quella del reattivo simile a quella del reattivo
di di LowryLowry
CuCu+2+2 èè ridotto a Curidotto a Cu+1+1 dalle molecole proteiche in soluzione alcalinadalle molecole proteiche in soluzione alcalina
Due molecole di BCA Due molecole di BCA chelanochelano uno ione rameoso (Cuuno ione rameoso (Cu+1+1))
Tale evento determina la formazione di un intenso colore violetTale evento determina la formazione di un intenso colore violetto con to con
un massimo di assorbimento a 562 un massimo di assorbimento a 562 nmnm
N- OOC
N- OOC
Cu+1Cu+1 2BCA+
N COO-
N COO-
Cu+1
OH-
Proteina + Cu+2
SensibilitSensibilitàà simile a quella del metodo di simile a quella del metodo di LowryLowry (10 (10 µµg/ml)g/ml)
RidottaRidotta suscettibilitsuscettibilitàà allaalla presenzapresenza didi detergentidetergenti
DopoDopo unun’’incubazioneincubazione didi 30 30 minutiminuti a 37a 37°°C C ilil colorecolore èè sufficientementesufficientemente stabilestabile
per per misurazionimisurazioni attendibiliattendibili ((spostamentospostamento del 2,5% in 10 del 2,5% in 10 minutiminuti))
Il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempoIl colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo
InterferenzaInterferenza dada parte parte didi carboidraticarboidrati
EccoEcco un un elencoelenco didi unauna parte parte delledelle sostanzesostanze cheche interferisconointerferiscono con con
ilil metodometodo BCA: BCA: catecolaminecatecolamine, , triptofanotriptofano, , lipidilipidi, , rossorosso fenolofenolo, , cisteinacisteina,,
tirosinatirosina, , saccarosiosaccarosio, , glicerologlicerolo non non puropuro, H, H22OO22, , acidoacido uricourico e e ferroferro. .
Il legame del colorante Il legame del colorante CoomassieCoomassie BrilliantBrilliant BlueBlue GG--250 alle proteine 250 alle proteine
determina uno spostamento del massimo di assorbimento del cdetermina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante olorante
da 465 da 465 nmnm (rosso) a 595 (rosso) a 595 nmnm (blu) in soluzioni acide ((blu) in soluzioni acide (BradfordBradford, 1976), 1976)
Tale colorante forma forti complessi non covalenti con leTale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine proteine
tramite interazioni elettrostatiche con gruppi tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminiciaminici e carbossilici e e carbossilici e
tramite forze di tramite forze di vanvan derder WaalsWaals
Il colorante Il colorante èè preparato come soluzione preparato come soluzione stockstock in acido fosforicoin acido fosforico
Il metodo Il metodo èè un semplice procedimento costituito da un unico passaggio un semplice procedimento costituito da un unico passaggio
in cui il colorante in cui il colorante èè aggiunto ai campioni e si determina laggiunto ai campioni e si determina l’’assorbanza a assorbanza a
595 595 nmnm
N+
N
Coomassie Brilliant Blu R
HN
OCH2CH3
SO3Na
SO3Na
La quantitLa quantitàà di colorante che si lega di colorante che si lega èè proporzionale alla quantitproporzionale alla quantitàà di proteina di proteina
presente in soluzione.presente in soluzione.
Pertanto lPertanto l’’intensitintensitàà del colore blu (e dunque ldel colore blu (e dunque l’’assorbimento) assorbimento) èè proporzionaleproporzionale
alla concentrazione proteica.alla concentrazione proteica.
In genere quantitIn genere quantitàà uguali di proteine differenti legano la stessa quantituguali di proteine differenti legano la stessa quantitàà di di
colorante colorante →→ il saggio il saggio èè indipendente dal tipo di proteinaindipendente dal tipo di proteina
1 mg/ml1 mg/ml 2 mg/ml2 mg/ml 4 mg/ml4 mg/ml 8 mg/ml8 mg/ml 16 mg/ml16 mg/ml
X mg/mlX mg/ml
PoichPoichéé ll’’intensitintensitàà della colorazione non della colorazione non èè lineare in una vasta gamma di lineare in una vasta gamma di
concentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparaconcentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparare una re una
curva curva standardstandard per ogni saggio. per ogni saggio.
µµµµµµµµg di proteinag di proteina
Inte
nsi
tIn
ten
sit àà
del
colo
re b
lud
el c
olo
re b
lu
Ass
orb
an
zaA
ssorb
an
zaa 5
95
a 5
95 n
mn
m
1 2 4 8 16
�� SemplicitSemplicitàà di preparazione del reattivodi preparazione del reattivo
�� SviluppoSviluppo del del colorecolore immediatoimmediato
�� StabilitStabilitàà del del complessocomplesso
�� ElevataElevata sensibilitsensibilitàà ((finofino a 22 a 22 µµg/ml)g/ml)
�� Il Il saggiosaggio èè compatibilecompatibile con la con la maggiormaggior parte parte deidei tamponitamponi comunicomuni,,
deglidegli agentiagenti denaturantidenaturanti come come guanidinaguanidina··HClHCl 6M e urea 8 M e 6M e urea 8 M e deidei
preservantipreservanti come come sodiosodio azideazide
�� Il reagente colora le Il reagente colora le cuvettecuvette ed ed èè piuttosto difficile da rimuoverepiuttosto difficile da rimuovere
�� La La quantitquantitàà didi colorantecolorante cheche sisi legalega allaalla proteinaproteina dipendedipende daldal
contenutocontenuto in in aminoacidiaminoacidi basicibasici →→ ciòciò renderende difficiledifficile la la sceltascelta didi
unouno standardstandard
�� MolteMolte proteineproteine non non sonosono solubilisolubili nellanella miscelamiscela didi reazionereazione acidaacida
Kjeldahl Method --- Nitrogen Determination
(1) Digestion
+ conc. H2SO4
+ a catalyst
nitrogen converted into an ammonium ion.
(2) Neutralize to get NH3 with NaOH
(3) Steam distillation of NH3 and trap in boric acid.
(4) Titrate with hydrochloric acid.
Calculation:
Gram nitrogen/ gram of sample =
*(ml of sample - ml of blank) × N standard acid × 0.014g/meq
weight of sample
* ml of hydrochloric acid required to titrate sample solution.
Disadvantages: not all N is protein.
Purine
Pyrimidine DNA, RNA, etc.
Urea
Many plant tissues have > 50% non-protein N.
% N × 6.25 = % Protein
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