Dr. Özge KAHRAMAN ILIKKAN 6. hafta - WordPress.comDolayısıyla 10 g örnek 90 ml FTS ya da benzeri...

6. hafta Dr. Özge KAHRAMAN ILIKKAN

6. hafta

Mikroorganizmaların Aseptik Transferi

Aseptik teknikler, saf kültürlerin ve lab ekipmanlarının kontaminasyondan korunması

için alınan tedbirlerdir.

Aseptik teknikler kültürümüzü istenmeyen mikroorganizmalardan korumanın

yanında, zararlı mikroorganizmaların laboratuvara yayılmasını da önler.

6. hafta

Aseptik Uygulamalarda Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar:

Çalışma öncesi ve sonrası tezgahların üzeri sürekli olarak temizlenmelidir. Sprey şişe

ile %70 etanol yada %10 çamaşır suyu tezgah yüzeyine spreylenir ve 1 dak.

bekletildikten sonra kağıt havlu ile temizlenmelidir.

Mikroorganizma içeren örneğin bir ortamdan diğerine aktarılması sırasında

kullanılan araç ve gereç steril olmalıdır

Bütün cam ve metal araç-gereç kullanılmadan önce ve kullanılmadan sonra sterilize

edilmelidir.

Gerekli besiyerleri ve sıvılar uygun bir kap içinde hazırlanarak sterilize edilmelidir.

Besiyerleri sterilizasyondan sonra başka bir kaba veya ortama aktarılacaksa bu

kapların önceden sterilize edilmesi gerekmektedir.

6. hafta

Aseptik Uygulamalarda Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar:

Besiyerlerini içeren kapların içine, havada toz partikülleri veya aerosoller ile taşınan mikroorganizmaların girişini önlemek için pamuk tıkaç ya da vida kapak kullanılmalıdır.

Çalışma anında, pamuk tıkaç veya kapak, bunzen beki alev çatısı altında elin küçük parmağı ile çıkarılmalı ve yapılacak işlem seri bir şekilde tamamlanarak hiç bekletilmeden yerine tekrar yerleştirilmelidir.

Pamuk ve ya kapak herhangi bir yüzeye temas ettirilmemeye çalışılır. Petri kutularının kapakları mümkün olduğu kadar kapalı tutulmalıdır. Petri kapağı

tezgah yüzeyine konulmamalıdır. Bu uygulama kontaminasyon riskini ve sahte pozitif sonuç elde edilmesini önler

Kullanılacak öze alevde steril edilmelidir.

Laboratuvarda bir şey yenilip içilmemeli.

6. hafta

Aseptik Uygulamalarda Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar:

1. Ateş başında ya da kabinde çalış 2. Steril çalış 3. Seri ve dikkatli çalış

6. hafta

EKİME HAZIRLIK

Besiyerleri kabin içinde ya da kabin dışında çalışma sırasında,

herhangi bir kazaya karşı kapağı açılmaması açısından, ayrıca

besiyerlerinin üzerine su damlacıkları düşmesin diye ters

konumlandırılır

Mümkün olduğunca en az 2 ya da daha fazla paralel çalışma yapılır

6. hafta

EKİME HAZIRLIK

Petri kapağına değil !! Petrinin Altına yaz Tüplerin üzerine yaz! Kapağına değil

6. hafta

Mikroorganizmaların Ekimi ve Teknikleri Ekim(inokülasyon), mikroorganizmaların steril besiyerine aseptik tekniğe uygun olarak

aktarılması olayıdır

1. SIVI BESİYERİNE EKİM A) AKTİFLEŞTİRME B) SEYRELTME

2. KATI BESİYERİNE EKİM A) EKÜVYON İLE EKİM B) ÇİZGİ EKİM C) ZİKZAK EKİM D)DÖKME PLAK E) YAYMA EKİM F) YATIK AGARA EKİM G) İĞNE ÖZE İLE EKİM

6. hafta

1. SIVI BESİYERİNE EKİM

6. hafta

Tüplerde ya da erlenlerde hazırlanan sıvı besiyerleri;

Çeşitli amaçlarla mikroorganizma büyütme, Antibiyogram, En Muhtemel Sayı yöntemi

ile sayım ya da biyokimyasal testler için kullanılabilir

6. hafta

A) AKTİFLEŞTİRME AMACIYLA EKİM:

Tüplere genellikle 5-10 ml besiyeri dağıtılır Sıvı kültürden ekim yapıyorsak pipetle % 1 oranında örnek aktarılır Katı kültürden örnek alıyorsak genelde 1 öze dolusu mikroorganizma

yeterlidir

Örn; 5 ml ise; 50 µl 10 ml ise; 100 µl

6. hafta

B) SEYRELTME AMACIYLA EKİM:

Tüplere genelde 9 ml besiyeri dağıtılır ve steril edilir 1 ml örnek aktarılır Vortekslenir Seyreltme sayısına göre işleme devam edilir

Amaç: Mikroorganizmaları sayılabilecek seviyeye indirgemek

7. hafta

Standart Seri Dilüsyon (Seyreltme)

Bakteri Sayısı 2.106 2.105 2.10 4 2.10 3 2.10 2 2.10 1 2

101 102 103 104 105 106

Seyreltme Faktörü : 1 seyreltme oranı

Seyreltme Faktörü :

Seyreltme Oranı

1:9

6. hafta

2. KATI BESİYERİNE EKİM

6. hafta

A) EKÜVYONLA EKİM

Genelde antimikrobiyal çalışmalar için kullanılır.

6. hafta

Mikroorganizma sayılarını sistematik olarak azaltarak tek koloni oluşturmak için çizgi

ekim metodu kullanılmaktadır. Bu yöntemdeki amaç, mikroorganizma kolonilerini tek

düşürüp izolasyonu sağlamak.

B) ÇİZGİ EKİM METODU

Tek koloni

6. hafta

C) ZİKZAK EKİM METODU

Genellikle saflık kontrolü ya da kısa süreli stoklama için yapılabilir.

6. hafta

D) DÖKME PLAK EKİM METODU

Yapılacak işleme göre seyreltmeler hazırlanır,

gerekli görülen seyreltmeden 1 ml örnek

petriye aktarılır.

Üzerine 45-50oC ye soğutulmuş steril

besiyerinden 15-20 ml dökülür ve 8 hareketi

yapılarak örneğin besiyeriyle homojen şekilde

karışması sağlanır

6. hafta

E) YAYMA EKİM METODU

Mikroorganizmaların sayımı için kullanır

Yayma yönteminin esası, önceden petri kutularına dökülüp katılaştırılmış (hatta bu

şekilde stoklanmış) ve belirli bir düzeyde kurutulmuş besiyerleri üzerine 0,1 ml numune

ya da uygun seyreltisinden aktarılarak drigalski spatülü ile besiyeri yüzeyine yayılmasıdır

6. hafta

F) YATIK AGARA EKİM

Yatık agar tüplerde hazırlanır Genellikle uzun süreli stoklamalar için ya da biyokimyasal testlerde kullanılır Yatık olmasının amacı yüzeyi genişletmek

6. hafta

G) İĞNE ÖZE İLE EKİM

Genellikle hareket gözlemlemek amacıyla yapılır

PETRİLERİN İNKÜBATÖRE YERLEŞTİRİLMESİ

6. hafta

Besiyerleri inkübatöre ters yerleştirilir. 6 adetten fazla üst üste konulması tavsiye edilmez

6. hafta

Mikroorganizma

Sayım Yöntemleri

7. hafta

Mikroorganizmalar Neden Sayılır??

İlaç araştırma Çevre koşullarının mikroorganizmalar üzerine etkisi Kimyasalların mikroorganizmalar üzerine etkisi Topraktaki, havadaki mikroorganizma yükünü bulmak için

7. hafta

Mikrobiyolojik Kriteler Tebliği

NEDEN SAYIM??

7. hafta

Sayım Yöntemleri

Bugüne kadar pek çok mikrobiyolojik sayım yöntemi geliştirilmiştir.

Kültürel sayım yöntemleri;

Amaca,

Gıda analizlerinde mevzuatın gereklerine,

İncelenen örneğin özelliğine,

Eldeki olanaklara göre seçilerek uygulanır.

7. hafta

Sayım Yöntemleri

1. Katı besiyerinde Sayım Yöntemleri 1.1. Dökme Plaka 1.2.Yüzeye Yayma 1.3.Damlatma 1.4.Çift Tabaka 1.5.Spor Sayımı 1.6. Anaerobik Sayım 2. Sıvı Besiyerinde sayım 2.1. En Muhtemel Sayı Yöntemi (EMS) 2.2. McFarland Skalasıyla sayım 3. Membran Filtrasyon Tekniği

4. Mikroskopta Sayım -Howard Lamı -Breed yöntemi -Thoma Lamı

Canlı Sayım Yöntemleri

Canlı ve cansız Sayım Yöntemleri

7. hafta

Sayıma Hazırlık

Dilüsyon (Seyreltme)

Sağlıklı bir sayım için öncelikle örnekteki canlı mikroorganizma sayısının sayılabilir

seviyeye indirilmesi gerekir. Bu nedenle seyreltme denilen teknik uygulanır.

Seyreltme tekniğinin esası, materyaldeki hücre sayısını bir seri seyreltme yaparak

kademeli bir şekilde azaltmaktır. Bu amaçla genellikle 1:9 oranında (10 kat)

seyreltme yapılır.

7. hafta

Sayıma Hazırlık Dilüsyon (Seyreltme)

Seyreltme sonrası yapılan ekim sonucu sağlıklı bir sayım için petrilerde bakteri

sayımlarında 15-300 arası koloni içeren, maya-küf sayımlarında 15-150 koloni

içeren, damlatma yönteminde 10-30 arasında koloni içeren seyreltmeler seçilir.

9 90 900

7. hafta

Sayıma Hazırlık

Standart Seri Dilüsyon (Seyreltme)

Örn; Bakteri Sayısı 2.106 2.105 2.10 4 2.10 3 2.10 2 2.10 1 2

101 102 103 104 105 106 Seyreltme Faktörü

15-300

Seyreltme Faktörü : 1 seyreltme oranı

7. hafta

Sayıma Hazırlık

Seyreltmede Kullanılan Çözeltiler

1. Fizyolojik Tuzlu Su (Serum Fizyolojik-FTS)

Osmotik basıncı mikroorganizmaların osmotik basıncına eşdeğer %0.85-0.90’luk tuzlu sudur. Hazırlanışı; 8.5 g sodyum klorür 1000 ml damıtık su (saf su) içinde çözdürülür.

2. Peptonlu Su (% 0.1 )

Genel amaçlı bir seyreltme çözeltisidir

3. Tamponlanmış Peptonlu Su

Tamponlanmış peptonlu çözeltiler çok özel bakterilerle çalışıldığında kullanılır. Ekim yapılıncaya kadar geçen sürede tamponlanmış peptonlu çözelti, mikroorganizmaların hücre yapısında bir değişiklik meydana gelmeden stabil kalmasını sağlar.

6. hafta

Gıda Analizlerinde analize alınacak örnek genelde 10 g ya da Salmonella gibi bakteriler aranıyorsa 25 g dır ; Dolayısıyla 10 g örnek 90 ml FTS ya da benzeri seyreltme çözeltisinde hazırlanırsa

başlangıçta 10 kat seyreltme yapıldığı göz önünde bulundurulmalıdır ve seyreltmelere devam edilmelidir

25 g örnek ise 225 ml ön zenginleştirme sıvısında hazırlanır ki bu durumda yine

başlangıçta 10 kat seyreltme yapılmıştır

Sayıma Hazırlık

7. hafta

1.1.Dökme Plak Yöntemiyle Kültürel Sayım

Bu yöntemle bakteri, maya ve küf saymak mümkündür.

Üzerlerine seyreltme değerleri yazılmış petri kutularına gerekli seyreltmelerden

1’er ml konulur.

45oC’a kadar soğutulmuş besiyeri her petriye 15-20 ml besiyeri dökülür.

1 ml örnek petriye aktarılır

Agar katılaşmadan hemen, petri kutularına düz bir yüzey üzerinde üç kez sekiz hareketi çizdirilir

7. hafta

1.2.Yüzeye Yayma Yöntemiyle Kültürel Sayım Yayma yönteminde tekniğine uygun olarak petri kutularında hazırlanmış ve belirli

düzeyde yüzeyi kurutulmuş agarlı besiyerleri üzerine uygun seyreltilerinden 0,1 ml

(100µl) numune aktarılarak tüm yüzeye eşit şekilde yayılır

Petriye aktarılan miktar 0,1 ml olduğu için, sayım sonucu 10 kat daha seyreltik olacak şekilde hesaplanır

6. hafta

1.3.Damlatma Yöntemiyle Kültürel Sayım

7. hafta

1.4.Çift Tabakalı Dökme Plak Yöntemiyle Kültürel Sayım Bu yöntemde 45-500C‟ye soğutulmuş steril agarlı besiyerinden 5ml plağın bütün

yüzeyini kaplayacak şekilde ikinci bir besiyeri katmanı dökülür.

İkinci kat besiyeri, ekim yapılan birinci kat besiyerinin üstünü kaplamak ve

dolayısıyla da fakültatif anaerop mikroorganizmaların gelişebileceği anaerop

koşulları yaratabilmek için kullanılmaktadır

7. hafta

1.5.Spor Sayımı

7. hafta

1.6. Anaerobik Sayım

Anaerobik ortamda gelişen bakteriler için sayım anaerobik koşullarda yapılır ama prosedür aynıdır. Bu mikroorganizmaları çalışabilmek için;

1. Anaerobik kabin

2. Anaerobik etüv ve ya anaerobik jarlar (Gas-Pack anaerobik sistem) kullanılır Anaerobik etüvlerde hava vakum pompası ile alınıp bunun yerine gaz doldurulur. Anaerobik koşulların yaratılması için genelde H2, N2, CO2 gaz karışımları kullanılır Anaerobik jarlarda; Palladium adı verilen katalist ve ticari bir kitle anaerobik ortam sağlanır

7. hafta

Sayım Sonucu Hesaplama

Sayı/ml veya g = Koloni Sayısı x Seyreltme Faktörü Seyreltmede Alınan inokulum miktarı(ml)

Katı besiyeri kullanılarak yapılan sayımın prensibi «her canlı hücrenin belirli bir inkübasyon sonunda 1 adet koloni oluşturması"dır». Bununla birlikte, canlı olduğu halde hasar görmüş ve gelişip koloni oluşturamayacak canlı hücreler de gıda maddesinde bulunabilir. Bu nedenle sayım sonuçları "sadece koloni oluşturabilenlerin" sayıldığını göstermek üzere "koloni oluşturan birim; kob (colony forming unit; cfu)" olarak verilmektedir.

Sayım Sonucu Verme

7. hafta

Sayım Sonucu Verme

1. Standardizasyon amacıyla sayım sonuçları; Sıvı örnekse kob/ml Katı örnekse kob/g olarak ya da Sıvı örnekse cfu/ml Katı örnekse cfu/g olarak 2. Virgünden sonra bir desimal olacak şekilde verilir. Örn; 2,3.104

3. Eğer mikroorganizma sayısı 300’den fazla ise; yani sayılamayacak kadar çok ise – Sayılamayacak kadar çok (SKÇ) olarak verilir

6. hafta

Seyreltme Oranı Nasıl Seçilir?

7. hafta

Örnek problem

Sıvı bir örnekte bakteri sayısı belirlenmek isteniyor. Dökme plak yöntemine göre

çalışılarak aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir.

Sayı/ml = Koloni Sayısı x Seyreltme Faktörü Seyreltmede Alınan inokulum miktarı(ml)

15-300

212 226 230 250

Seyreltme Faktörü : 1 seyreltme oranı

918/4=229,5=230.106 =

Seyreltme Faktörü: 106

Bu değer virgülden sonra 1 desimal ile gösterilmeli ve sonuç 2,3X108kob/ml olarak verilmelidir.

7. hafta

10 g tartılarak analize alınmış ve dökme plak yöntemi uygulanmış ve her seyreltiden 2 petri kutusuna ekim yapılmıştır. 10-3 seyreltide 199 ve 163, 10-4

seyreltide 21 ve 17 adet koloni elde edilmiştir (Katı numune ile çalışılmıştır.).Bu verilere göre numunenin 1 gramında bulunan canlı mikroorganizma sayısını hesaplayınız

Bu değer virgülden sonra 1 desimal ile gösterilmeli ve sonuç 1,9X104kob/g olarak verilmelidir.

199 163 210 170

Seyreltme Faktörü :103

185,5.103 = 1,9.105 /10

Örnek problem

7. hafta

Bir sıvı gıdada yüzeye yayma yöntemi kullanılmış ve orijinal örnekten (10oseyrelti) 280, 260, 10-1 seyreltiden ise 21 ve 16 adet koloni elde edilmiştir.

280 260 210 160

Seyreltme Faktörü :100

227,5.100 /0,1=2,3.103kob/ml

Örnek problem

6. hafta

Örnek problem

Damlatma yöntemiyle 10-3 lük seyreltmeden 2 farklı alanda elde edilen koloni sayıları 12 ve 18 dir. Mikropipetle 0,02 ekim yapıldığına göre inceleme materyalindeki canlı sayısı nedir?

Aritmetik ortalama 12+18/2 = 15 15.103 =7,5.105 kob/ml~g 0,02

7. hafta

2.1. EMS (En Muhtemel Sayı) YÖNTEMİYLE SAYIM

Yöntemin prensibi ardışık üç seyreltiden sıvı besiyerlerine ekim yapıp inkübasyon sonunda asit oluşumuna bağlı renk değişimi veya gaz oluşturanları pozitif olarak değerlendirmek ve istatistik yöntemlerle elde edilmiş tablolardan yararlanılarak numunenin mikroorganizma yükünü hesaplamaktır.

Genellikle koliform grubu bakteri sayımlarında kullanılırlar

3 lü ya da 5 li tüpler şeklinde olabilir

Besiyeri olarak Brillant Green Lactose Bile Broth ya da Lactose Broth hazırlanır

6. hafta

7. hafta

2. EMS (En Muhtemel Sayı) YÖNTEMİYLE SAYIM

7. hafta

3 2 0

İlk aşamada incelenecek örneğin 3 adet seri

dilüsyonu hazırlanır. Her bir dilüsyondan; üçer

adet (3 tüp tekniği) veya beşer adet (5 tüp

tekniği) olmak üzere, tüpteki sıvı besiyerine

ekimler yapılabilir.

9,3.101 / 10 =9,3

100 10-1 10-2

Örnek problem

7. hafta

3 2 0

Senaryo-2 10-2 10-3 10-4

Örnek problem

7. hafta

2.2. McFarland Skalası ile Sayım

Baryum Klorür ile sülfirik asidin karıştırılmasından oluşan Baryum Sülfat’ın opak renkli

bulanıklığından, sıvı besiyerinde üreyen bakterilerin benzer bulanıklık oluşturması

nedeniyle belli ilişkisi olduğu belirlenmiştir.

7. hafta

2.2. McFarland Skalası ile Sayım

Uygulama : Sıvı haldeki örnek homojenize edildikten sonra önceden hazırlanmış

McFarland serisindeki tüplerle karşılaştırılarak (çıplak gözle ya da 545-650nm’de

absorbans ölçerek) kendisine en yakın bulanıklığı gösteren tüp belirlenir. Buna karşılık

gelen mikroorganizma sayısının orijinal örnekte var olduğu kabul edilir.

7. hafta

3. MEMBRAN FİLTRASYON TEKNİĞİ

Membran filtrasyon; Su ( içme ve kullanma ), Meşrubat gibi sıvı gıdalar, Şeker, tuz gibi suda tam olarak çözülen katı gıdaların analizlerinde, Ve özellikle gıdada aranılan mikroorganizma sayısının 10 ml’de 1 veya

daha az olduğu durumlarda kullanılan bir yöntemdir

Membran filtrasyonda kullanılan filtreler çok ince, çok gözenekli, selüloz asetat,

selüloz nitrat veya selüloz ester karışımlarıdır.

Membran fitrelerin gözenek büyüklükleri 10 nm ile 8 μm arasında değişmektedir.

Mikrobiyolojik analizlerin çoğunluğunda 0,22 – 0,45μm gözenekli filtreler

kullanılmaktadır.

Membran filtreler sayımı kolaylaştırmak amacıyla kare şeklinde alanlar (çizgiler)

basılı olarak hazırlanmıştır.

Bu yöntem, hem toplam bakteri sayısının hem de canlı bakteri sayısının

belirlenmesine uygundur.

7. hafta

3. MEMBRAN FİLTRASYON TEKNİĞİ

7. hafta

4. DİREKT MİKROSKOBİK SAYIM YÖNTEMLERİ

- Howard Lamı - Thoma Lamı - Breed Yöntemi

7. hafta

4. DİREKT MİKROSKOBİK SAYIM YÖNTEMLERİ

- Howard Lamı

Howard küf sayımı; domates suyu, salça, ketçap gibi domates ürünlerinin

ve diğer meyve ürünlerinin üretiminde kullanılan ham maddenin

mikrobiyolojik kalitesinin belirlenmesi ve işletmede sanitasyon

uygulamalarının etkinliğinin saptanması amacıyla uygulanan mikroskobik

bir sayım yöntemidir.

7. hafta

4. DİREKT MİKROSKOBİK SAYIM YÖNTEMLERİ

- Howard Lamı

yüzde küflü saha oranı, üretim sırasında

kullanılan ham maddede hangi oranda

küflü domates olduğu hakkında bir ön

bilgi verebilir

7. hafta

4. DİREKT MİKROSKOBİK SAYIM YÖNTEMLERİ

- Howard Lamı

Sonuçlar ‟ % küflü saha ‟‟ olarak verilir

Mikroskopta 90-125X büyütme uygun olacaktır (örn; 10x oküler, 10x objektif)

Analiz, 25 görüş sahası olan özel bir lamda yapılır. Amaç, incelenen görüş sahasının küf miselleri açısından (+) ya da (–) olarak değerlendirilmesi

% pozitif saha = Pozitif saha sayısı x 100 Sayıların toplam saha sayısı

Newton Halkası

6. hafta

Örnek Problem;

Domates salçasından yapılan sayım sonucuna göre 1. preperatta 10 + ve 15 -, 2. preperatta 8 + ve 17- çıkmıştır. Salça’da küflü madde oranı nedir? 10+8/2 = 9 9x 100 =% 36 25

100 kg salçanın 2 kilosu küflü domatesten yapılmış

7. hafta

4. DİREKT MİKROSKOBİK SAYIM YÖNTEMLERİ

- Thoma Lamı

Özellikle mikrobiyolojide maya ve tıpta kan sayımlarında kullanılan ve Thoma

lamı (hemositometre ) adı verilen özel bir lamla yapılan sayımdır. Thoma

lamında bakteri sayılması oldukça güç olup önerilen bir yöntem değildir.

Thoma lamının esası, 0.1 mm3 hacimde sayım yapılmasıdır.

Thoma lamında 16 büyük kare, her büyük karede 25 küçük kare vardır ya da 25

büyük kare, 16 küçük kare. Sayım bu karelerde yapılır. 16 büyük kare sayılır ya da

çapraz 8 kare sayılıp 2 ile çarpılır

Toplam hücre sayısı = 16 büyük karedeki hücre sayısı x 10,000 x seyreltme faktörü

0.1 mm3 teki sayıyı 1 ml ye çeviren katsayı

7. hafta

10X lik ya da 20X lik objektifte sayım yapılır

6. hafta

Örnek Problem; 16 büyük kareli olan lamda 10-3 lük seyreltmeden alınan örnekte 8 büyük karede toplam 40 adet maya sayılmıştır 1 ml maya sayısı nedir?

(40x2)x103x104 =8,0x108

7. hafta

- Breed Yöntemi

4. DİREKT MİKROSKOBİK SAYIM YÖNTEMLERİ

Çiğ sütte bakteri sayısını belirlemek için kullanılır. Breed yönteminde 0,01 mL süt örneği 1 cm2 alana yayılır.

Preparat kurutulur ve tespit işlemi yapılır. Daha sonra preparat boyanarak

mikroskopta immersiyon objektifi ile sayımlara geçilir

Mikroskop görüş alanı bilinmelidir. Buradan mikroskop faktörü hesaplanır Sayı: AxMFx100xseyreltme faktörü (adet/mL)

6. hafta

SAYIMDA NELER TERS GİDEBİLİR ?

6. hafta

SAYIMDA NELER TERS GİDEBİLİR ?