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新規モノマーによるRNA液相合成法

高知大学　総合センター（海洋部門）

イノベーティブマリンテクノロジー研究拠点

特任講師　片岡 正典

核酸医薬についてIMT.KOCHI

低分子医薬 抗体医薬核酸医薬

規格化が容易 高い生産性

特異性が高い 強い効果

『核酸医薬品等共同製造施設設置に向けた事前調査』（株）シード・プランニング2011年2月

・RNAi ・miRNA ・RNAアプタマー ・アンチセンスDNA ・デコイ核酸

核酸医薬の分類IMT.KOCHI

siRNA miRNA アプタマー アンチセンス デコイ核酸

構造 二重鎖RNA （20-23量体）

一本鎖RNA （20-25量体）

一本鎖RNA （12-40量体）

一本鎖DNA （6-40量体）

二重鎖DNA （＞10量体）

標的 mRNA miRNAタンパク質 糖鎖

2次代謝物mRNA 転写因子

作用機序 mRNAを分解 miRNAの 機能を制御

標的に結合、 機能を阻害

mRNAに結合、翻訳を阻害

転写因子の 機能を阻害

その他 体内のRNAiを 利用 診断薬も対象 分子進化法 核酸医薬

の始まり

『核酸医薬品等共同製造施設設置に向けた事前調査』（株）シード・プランニング2011年2月

核酸医薬の開発状況IMT.KOCHI

『核酸医薬品等共同製造施設設置に向けた事前調査』（株）シード・プランニング2011年2月

核酸医薬市場規模の予測IMT.KOCHI

『核酸医薬品等共同製造施設設置に向けた事前調査』（株）シード・プランニング2011年2月

40億円300億円

5000億円

RNA製造手法のイメージ

固相合成法 液相合成法

× ◯IMT.KOCHI

既存のRNA固相合成法の例

activator =

1995−2002年 早川・片岡 が開発

2010年 Gilindusが開発

oxidizing agent = butanone peroxide などを片岡が開発

優位性!・基本特許が2000年台初頭に失効!・プロセス技術の改良でコスト削減!・実績のある少量製造技術を適用!・実績のある修飾技術を適用!問題点!・スケールメリットの限界!・危険な薬品の大量使用!・大量の廃棄物!・精製技術の低効率!

②

③

①

シーズ1：ＲＮＡ合成用モノマーの製造技術優位性!

・短工程（3工程）!

・高い合成収率!・安価な化学薬品!・塩基部の保護基が不要!課題!・非酵素工程の確立!

・kgスケール製造技術の確立

3工程収率40-55%

従来技術

課題!

・長工程（7-9工程）!

・低い合成収率!・高価な化学薬品!・塩基部の保護基が必要!優位性!・自動合成装置での実績!・高い溶解性7-9工程

収率<20%

シーズ IMT.KOCHI

①②③

①

ＲＮＡ合成用モノマーの製造技術

OBHO

HO OH

OBTBDMSO

HO OH

TBDMSClpyridine, 0 °C

OBTBDMSO

HO O

OBTBDMSO

O OHP OH O– PO

–O H

OBTBDMSO

O OCOCH3PO–O H

H-phosphonate monomer

CH2Cl2—pyridine, –40 °C

CH3COXt-BuOH, 37 °C

38-77%

PCl3, imidazole NH4OH

regioselectivechemoselective

chemoselective

overall yield 41-53%

52-88%

76-87%

IMT.KOCHI

ヌクレオシド リパーゼ 反応剤、溶媒 反応温度、時間 位置選択性2’：3’ 収率（％）

アデノシン lipase from porcine pancreas, Type II

AcOC(CHpyridine 60 °C, 24 h >99.5 : 0.5 58-70

シチジン lipase from porcine pancreas, Type II

AcOCH=CHpyridine 60 °C, 24 h 93 : 7 67-80

ウリジン lipase from porcine pancreas, Type II

AcOCH=CHpyridine 60 °C, 24 h >99.5 : 0.5 76-81

グアノシン lipase from porcine pancreas, Type II

AcOCH=CHpyridine 60 °C, 24 h 92 : 8 47-55

RNA液相合成サイクル（アセチル液相法）

OBNH2TBDMSO

O OCOCH3PO–O H

OBNH2TBDMSO

O OCOCH3POTMSO O

OBNH2

O OCOCH3CO—support

ODS

GPC

monomer unit (100 mM)

100 mM I2, H2O–pyridine !CH3CN, 25 °C, 15 min

100 mM TBAF!THF, 25 °C, 15 min

esterase (in reaction vessel)!PBS buffer pH 7.4, 37 °C, 8 h

500 mM pivaloyl chloride!500 mM triethylamine!CH3CN, 25 °C, 30 min

oxidation

deprotectiondetachment

coupling

RNA

support = linear polymer (ex. polyethylene glycol, surfactants for protein); BNH2 = Ade, Gua, Cyt, Ura without base protection

CondMon

realtime reaction monitor

OBNH2HO

O OCOCH3PO–O O

OBNH2

O OCOCH3CO—support

n m

n = m: after deprotectionm =n+1: after coupling

合成サイクルと未精製rGCAU5AU12のHPLC図

カラム：COSMOSIL AR-II 4.6x250mm!溶出条件：5%→25% CH3CN in 0.1M　TEAA buffer!　　　　　（pH7.0, 40 °C）

短鎖RNA!（ゲルろ過精製!で除去可能）

目的のRNA

RNA保護体や塩基部リン酸化体は確認できない

未精製RNAのHPLC分析図

新規RNA合成法と従来法の比較IMT.KOCHI

新合成法 Kochi method 可溶性ポリマー液相H-ホスホネート法

従来法 【競合技術1】 固相ホスホロアミダイト法

従来法 日本新薬 固相ホスホロアミダイト法

合成鎖長 ~21 量体* ~40 量体 ~100 量体

大量合成への適応

グラム合成の実績あり 10億円規模の投資により実現 10億円規模の投資により実現

モノマーの使用量

化学量論量 基質の10−15倍、大量合成時は2-5倍 基質の25倍、大量合成時は2-5倍

モノマーの合成 3段階、41-53%** 9段階、20%以下 8段階、20%以下

仮保護基シリル系（

理論的最小量トリチル系（強酸で除去）

大量の廃棄物トリチル系（強酸で除去）

大量の廃棄物

2’−水酸基保護基 アセチル、脂肪酸 酵素で簡便に除去

シリル系HF・baseで除去 切出しは別

シアノエチルアセタール 2段階除去

塩基部保護基 不要 ベンゾイル系保護基 除去に強塩基

ベンゾイル系保護基 除去に強塩基

切出し・脱保護 酵素などで脱保護と同時に おこなえる→化学的手法に

強塩基、水酸基の脱保護を 切り出しの後におこなう

強塩基、水酸基の脱保護を 切り出しの後におこなう

プロドラッグ としての可能性

DDSポリマーを合成担体として使用可能。切出し前の保護体を投与し、患部でRNAが発

合成後にDDSポリマーを結合させる。高価で反応効率、精

製に問題あり。

合成後にDDSポリマーを結合させる。高価で反応効率、精

製に問題あり。

*長鎖RNAの合成実験はまだおこなっていない。21量体までの実績あり　　** 改善の余地あり

○ ×

×

×

○ △ △

△ △

△

×

×

△ △

△ △

△

△ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ×

優位性!・液相法採用による低い合成コストと大量供給と実現!

・H-ホスホネート法採用によるモノマーの使用量低減!

・アセチル基採用による高い反応性と温和な除去条件!・対カチオンの工夫で反応溶媒に対して高い溶解性!

・DDSポリマーを採用しアセチル基を細胞内で除去

　（プロドラッグとしての可能性）!・高い汎用性（低分子ヌクレオチド合成に応用）!

!課題!

・モノマー製造における非酵素化（GMP対応）!

・サイクル毎におこなう精製技術の確立!・キャッピング技術の確立

シーズ技術４：短鎖ＲＮＡ製造技術

OBHO

HO OH

OBTBDMSO

HO OH

TBDMSClpyridine, 0 °C

OBTBDMSO

HO O

OBTBDMSO

O OHP OH O– PO

–O H

CH2Cl2—pyridine, –40 °C

CH3COXt-BuOH, 37 °C

38-77%

PCl3, imidazole NH4OH

regioselectivechemoselective

chemoselective52-88%

76-87%

coupling & oxidation (without capping)

OH activation100 mM TBAF in THF 25 °C, 30 min

1. 500 mM pivaloyl chloride 1000 mM trietylamine acetonitrile, 25 °C, 60 min2. 100 mM I2, H2O-pyridine 25 °C, 30 min

B = nucleobase without protectionsupport = linear polymer (ex. polyethylene glycol, surfactants for protein)

RNA

deprotection & detachmentlipase or esterase37 °C, 8 h

OBHO

O OCOCH3PO–O O

OB

O OCOCH3CO—support

OBTBDMSO

O OCOCH3PO–O O

OB

O OCOCH3CO—support

GPC

OBTBDMSO

O OCOCH3PO–O H

monomer unit (330 mM)

MONOMER SYNTHESIS

ELONGATION CYCLE

regioselective

n

n+1

本技術に関する知的財産

発明の名称：ＲＮＡ合成用モノマー、その製造方法、およびＲＮＡ製造方法

出願番号：PCT/JP2013/70247 出願人：国立大学法人高知大学 発明者：片岡正典　

お問い合わせ先

四国TLO（株式会社テクノネットワーク四国）

技術移転部

TEL: 087-811-5039　FAX: 087-811-5040

E-MAIL: yasuda@s-tlo.co.jp