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Electroforesis
La electroforesis es una técnica que se basa en la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico.
De frente móvil (en solución)
Tipos:
De zona (sobre un medio soporte)
Agarosa Poliacrilamida
(DNA) (DNA y proteínas)
Geles (a través de una matríz porosa)En papel Sílice
ÁnodoCátodo
- +
Fel
Fresist
v
Fel = Q . E = Q . V/dQ = cargaE = potencial eléctricoV = voltajed = distancia entre electrodosf = coeficiente de fricciónv = velocidad
A v constante v partícula = Q . E
f
Fresist = Fel
Movilidad de la partícula = v = Q
E f
Tamaño y forma de la partícula
La movilidad del DNA depende de:
Factores extrínsecos a la partícula
[agarosa] o [poliacrilamida]
Voltaje
Buffer
Tiempo
Temperatura
pH
Factores intrínsecos a la partícula
Relación carga/masa
Conformación
Tamaño
Factores extrínsecos
Log(
PM
o K
bs)
0,5%
0,7%
1%
1,2%
% de agarosa
a b
b > a
[ ] Agarosa
A > % de agarosa la movilidad de la partícula disminuye
A > % de agarosa la resolución de partículas de PM similar aumenta
% agarosa Rango separación
poliacrilamida 1-5 pb a 500 pb
0,5 700 pb a 25 Kpb
0,8 500 pb a 15 Kpb
1 250 pb a 12 kpb
1,2 150 pb a 6 kpb
1,5 80 pb a 4 kpb
* Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante
Poliacrilamida
Alta resolución
NO para fragmentos grandes
Difícil de armar
Agarosa
Baja resolución (poros grandes)
SI fragmentos grandes
Fácil de armar
Si el % es muy bajo el gel es frágil
=
Voltaje aplicado
V típico = 10 V / cm de gel y geles de 10 – 15 cm 100 V – 130 V
Mejor resolución Voltajes menores (70 V)
(máxima resolución fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel)
OJO, V difusión
Buffer de corrida
Da la fuerza iónica al medio de corrida
Al la [ ] de iones, la resolución
Composición
TAE
TBE
TPE
Más usado. No puede reciclarse mucho.
Mayor capacidad buffer
Tiempo
Depende del tamaño de los fragmentos a separar
A tiempo resolución OJO! (Que no se caiga la muestra del gel)
Temperatura
pH
A V Temperatura y la OJO! (Se puede fundir el gel)
Hay que controlar el pHEvitar modificaciones en la carga y conformación del DNA y las proteínas
Factores intrínsecos
Relación Q/m
Imp. para proteínas: Q/m
Ac. Nucleicos: Q/m constante!
Tamaño
tamaño
Conformación del DNA
DNA circulares: 3 conformaciones posibles
CCC
Lineal
CA
Circular covalentemente cerrado
(superenrrollado)
Circular abierto
+
-
0,6 a 1% agarosa
Si el % de agarosa es de 1 a 1,4 % corren: 1ro. el Lineal, 2do. el CCC y 3ro. el CA
Loading Buffer
Glicerol o ficol o sacarosa Densidad a la muestra
Colorantes de corrida(ubicar frente de corrida)
Azul de bromofenol(corre como DNA 300 pb)
Xylene Cyanol(corre como DNA 4000 pb)
Orange G (corre como DNA 50 pb)
Revelado
Autorradiografía DNA marcado radioactivamente
(Ej. PCR radioactiva)
Agentes intercalantes
BrEt
- Se intercala cada 2,5 pb- Fluoresce naranja a la luz UV- Detecta hasta 10ng de DNA ds- En la agarosa o post-corrida
Genera SC(+). Afecta movilidad CCC.Retrasa 15% lineal
Visualización durante corrida
(tumorigénico)
SyBR Gold
- Fluoresce amarillo- Poca afinidad gel (bajo background)- Detecta hasta 20 pg DNA ds- Seguro (no tumorigénico)- Caro
Marcadores de peso molecular
cualitativos
cuantitativos
sintéticos
DNA fagos o plásmidos digeridos por ER
Sintéticos comerciales
Mar
ker
Lam
bda
Eco
R1/
Hin
dIII
MuestraTamaño DNA fago = 48,5 kb
Intensidad similar
48,5 kb 100%3,53 kb 7,28%
Si sembré 500 ng marker DNA:
100% 500 ng7,28% 36,4 ng
% por el vol de DNA muestra sembrado para obtener la [ ]
Cuantificación DNA
Tipos de geles de agarosa
Comunes
Analíticos
Preparativos
Alcalino (c/NaOH) Para cDNA
Para RNA Con formaldehído (desnaturaliza RNA)
PGFE (en campo pulsante) Separación de fragm. > a 50 kb
Recuperación del DNA del gel
- Agregar al gel membrana de DEAE-celulosa
- Colocar trozo de gel en bolsa de diálisis
- Kits de sílica gel
- Usar low melting point agarosa (funde entre 25-35 grados). Extracción con fenol.
- Corte en gel durante la corrida, seguir con UV y levantar cuando DNA cae en el pocillo
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