Electroforesis Final

5/11/2018 Electroforesis Final - slidepdf.com

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ELECTROFORESIS EN GEL DEPOLIACRILAMIDA

Docentes:BQ. PhD. Genevieve Merabachvili

BQ. Rodrigo Tapia

Integrantes:Diego Cabello

Rodrigo Santana

Bárbara TilleríaDaniel Velásquez

Sección: 1.1

AMINOÁCIDOS

Amin oácido Enl ace peptídico



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AMINOÁCIDOS

Punto isoeléctrico:

El punto isoeléctrico es el pH al que unasustancia anfótera tiene carga neta cero.

Si consideramos un AA sencillo, éste puede adoptar tres formasiónicas diferentes:



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PROTEÍNAS

Enl aces que estabilizan la estructura terciaria

PROTEÍNAS



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AGENTES DESNATURANTES

• Ácidos y bases fuertes.

• Disolventes orgánicos.

• Detergentes.

• Agentes reductores.

• Concentración salina.

• Iones metálicos pesados.

• Cambios de Tº.

• Agresión mecánica.

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DEMOLÉCULAS

Se basan en:

• Solubilidad : pH, fuerza iónica, disolvente, T°.

• Tamaño: diálisis, filtración, centrifugación,

cromatografía de filtración en geles.• Carga: cromatografía de intercambio iónico,

electroforesis.

• Afinidad:cromatografía de afinidad.



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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

Diálisis Filtración

Centrifugación


CROMATOGRAFÍA DEFILTRACIÓN EN GELES

CROMATOGRAFÍA DEINTERCAMBIO IÓNICO

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD



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CROMATOGRAFÍA ENPAPEL

¿QUÉ ES LA ELECTROFORESIS?

La técnica de electroforesis permite separarmoléculas de cargas diferentes a las que se lesaplica un campo eléctrico, donde migrarán a loselectrodos de polaridad opuesta en función asu tamaño, carga y forma

El término electroforesis proviene de losvocablos griegos “êlektron” que hace referenciaa la electricidad y “ phoros” que significa “llevar o trasladar”.



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FUNDAMENTO

• Cuando una mezcla de moléculas ionizadas ycon carga neta son colocadas en un campoeléctrico, estas experimentan una fuerza deatracción hacia el polo que posee cargaopuesta, dejando transcurrir cierto tiempo lasmoléculas cargadas positivamente sedesplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) yaquellas cargadas negativamente se desplazaranhacia el ánodo (el polo positivo).

TIPOS DE ELECTROFORESIS

Existen diversos tipos de electroforesis cuyadiferencia radica en los distintos tipos de mediosde soporte:

• Electroforesis capilar.

• Electroforesis de zona:o Electroforesis en papel, Electroforesis en gel.



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Electroforesis capilar:Esta técnica separativa se basa en la migración de lasespecies de la muestra en disolución, portadoras de unacarga eléctrica global, bajo el efecto de un campoeléctrico y en contacto con un soporte (medio dedesplazamiento) adecuado.


Electroforesis de zona:

Es una de las técnicas más utilizadas enbioquímica y biología molecular por su elevadaresolución. El campo eléctrico se aplica a un

medio o soporte estabilizante y la muestra sedeposita en una reducida zona del mismo.



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Electroforesis de zona:

Electroforesis en papel: La muestra se aplica

sobre una tira de papel filtro humedecido conuna disolución tampón, bien en el centro o encualquiera de los extremos del papel,dependiendo de las sustancias a separar y delpH del tampón.

Electroforesis en gel:

Un gel es un estadointermedio entre elsólido y el líquido. Estetipo de electroforesis sehalla entre los métodosmás resolutivos y

convenientesempleados en laseparación demacromoléculas.



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Electroforesis en gel: Tipos

• Geles de agarosa.• Geles de poliacrilamida: 1. Electroforesis en gel en una dimensión

(continuo o discontinuo)o PAGE-nativao PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE)o Isoelectroenfoque: se basa en el desplazamiento

de las moléculas en un gradiente de pH. 2. Electroforesis en gel en dos dimensiones

(bidimensional)

PASO PRACTICO



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Objetivo de la actividad práctica:

• Aislar la α-lactoalbumina de la leche ycaracterizarla por electroforesis en gel depoliacrilamida.

• Caracterizar laa-lactoalbumina porelectroforesis en gel de poliacrilamida.

• Conocer otros tipos de electroforesis• Reconocer la utilidad de los componentes del

SDS-PAGE.

COMPONENTES DE LA LECHE

• La leche es una secreción nutritiva de colorblanquecino opaco producida por las glándulasmamarias de las hembras.

• La leche esta compuesta principalmente por:• Agua

• Iones (sales minerales y calcio)

• Hidratos de carbono (lactosa)

• Materia grasa

• Proteínas



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•

La leche de vaca tiene una densidad media de 1,032 g/l . Es una mezcla compleja yhe terogénea compuesta por un sistema coloidal de tres fases:

• Sol ución: los minerales así como los hidratos de carbono se encuentran disueltosen e l agua.

• Sus pensión: l as sustancias p roteicas se encuentran con el a gua en suspensión.• Emul sión: la grasa en agua se presenta como emulsión.

COMPONENTE PROTEICO

• Caseína: (del latín caseus, "queso") es unafosfoproteína (un tipo de heteroproteína)presente en la leche y en algunos de susderivados (productos fermentados como el yoguro el queso). En la leche, se encuentra en la fasesoluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en uncomplejo que se ha denominado caseinógeno.



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• α-caseína: 199 aminoácidos, 2 regioneshidrofobicas, con zonas muy polares las cuales ledan el pH 6,6 a la leche.

• β-caseína: 209 aminoácidos, extremo c-terminales hidrofóbico y el extremo n-terminal muyhidrofílico.

• κ-caseína : 169 aminoácidos, zona de carga netapositiva que permite interacción conpolisacáridos.



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α - LACTOALBUMINA

• Síntesis de lactosa: Interviene en la reacción enzimáticaimplicada en la síntesis de la lactosa. Va a existir por lotanto una relación directa entre el contenido en lactosay el contenido en α-lactoalbúmina.

• Fijación de calcio gran afinidad por el Ca2+ en las zonascon gran cantidad de ác. aspártico, de modo que ligaun átomo de Ca por molécula, que dan lugar a

interacciones iónicas aportando gran estabilidad a laestructura y haciéndola más resistente a la a ladesnaturacion irreversible por temperatura.



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a- lactoalbumina α-caseína β-caseína κ-caseína

PuntoIsoeléctrico

4,5 4,4 4,83 5,45

Peso

molecular(kD)

14,5 23,54 23,98 19,37



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PROCEDIMIENTOS

1) a)

• 100ml de leche en vaso precipitado .

1)b

• Se debe masar 20 gramos de sulfato de amonioanhídrido .



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2)

• Caliente el vaso precipitado a 40º C Y agregarentre 10 a 12 minutos el sulfato de amino.

• Esperar 10 minutos agitando la solución.

• La caseína es afectada por la concentración desulfato de amonio, la cual altera la solubilidad delmedio, precipitando la proteína.



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Procedimientos

3)

• Se filtra la solución y nos quedamos con elfiltrado.

4)

• Se ajusta el pH del filtrado a 3.0 con HClconcentrado.



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5)

• Centrifugar la suspensión por 15 minutos a 5.000rpm.

6)

• Eliminar el sobrenadante y re suspender el sedimento con10 ml de agua destilada en un vaso precipitado de 50 ml yajustar el pH entre 8,5 y 9,0 con NaOH, para re suspender laproteína.



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7)

• Centrifugar por 10 minutos a 5.000 rpm y guardarsobrenadante para cuantificar la concentraciónde proteínas por método de Biuret.

PREPARACIÓN DE GEL DEPOLIACRILAMIDA



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ELECTROFORESIS EN GEL DEPOLIACRILAMIDA

• PAGE es uno de los métodos más utilizadospara la purificación, análisis y caracterizaciónde proteínas.

• PAGE se puede realizar bajo condiciones:

PAGE-nativa

PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE)

POLIACRILAMIDA



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GEL DE POLIACRILAMIDA

• La poliacrilamida es un soporte empleadofrecuentemente en electroforesis en gel.

• Permite separar proteínas.

• Gel transparente con estabilidad mecánica

• Químicamente inerte, de propiedades uniformes.

• insolubles en agua, relativamente no iónicos• Permiten buena visualización de las bandas durante

tiempo prolongado.

POLIACRILAMIDA

Porcentaje deacrilamida

Rango deseparación(tamaño)

15% 12-45 kDa

12,5 % 15-50 kDa

10% 16-75 kDa

7,5% 30-100 kDa

5% 60-212 kDa

Rangos de linealidad de separaciónsegún el tamaño de una proteínadependiendo de los porcentajes deacrilamida y bisacrilamida en unSDS – PAGE.



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SDS-PAGE

• En SDS-PAGE, la separación es función del tamaño (masamolecular).

• Se utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas.

Detergentes: dodecil sulfato sódico (SDS).

Agentes reductores: 2- mercaptoetanol (DTT).

(C12H25NaSO4)HO(CH2)2SH

SDS-PAGE



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SDS-PAGE

• Persulfato de amonio (PSA):Catalizador

• Tetrametiletilendiamina (TEMED):Inici ador de la reacci ón

SDS-PAGE

• Presenta dos medios o buffer:

-Gel concentrado superior (menor %acrilamida/bisacrilamida, pH mas ácido)

-Gel resolutivo inferior (medio alcalino, separa las proteínas)



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Separación y caracterización deα-lactoalbumina de otras proteínas de

la leche por SDS-PAGE

Reactivos:

• Acrilamida

• Bisacrilamida

• Tris

• HCl concentrado

• SDS• PSA

• Glicina

• Glicerol

• Azul de bromofenol

• 2-mercaptoetanol

• Isopropanol

• Metanol

•

CH3COOH glacial• TEMED

• Azul de Coomassie R-250

• Agua desionizada



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Materiales:

• Vasos precipitados

• Tubos eppendorf

• Tubos falcon

• Cámara Electroforesis(mini-PROTEAN tetra cell, bio-Rad)

• Fuente de poder

Persulfato de amonio

10% p/v (10ml)

Solución de decoloración

(500 ml):Metanol 10% v/v

CH3COOH 10% v/v

Solución de tinción (500ml):Azul de Coomas sie 0.1% p/v

Metanol 45% v/vCH3COOH 10% v/v

Dodecil sulfato sódico

10% p/v (100ml)

Acrilamida- bisacrilamida

30:0.8 % p/v(100 ml)

Preparar:



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Buffer Gel Resolutivo Inferior(100 ml):Tris 1.5 M

SDS 0.4% p/VHCl (ajustar a pH 8.8)

Buffer de carga (10ml)Tris 0.06 M pH 6.8Glicerol 10% p/v

SDS 2% p/vAzul de bromofenol 0.05%

Buffer de corrida 5X(1L):

Tris 125 mMGlicina 1M

SDS 0.5% p/V

Buffer Gel Concentrador Superior(50 ml):

Tris 0.5 MSDS 0.4% p/V

HCl (ajustar a pH 6.8)

Preparar:

PROCEDIMIENTO

Gel resolutivo Inferior

(10 ml)

Gel concentrador superior

(5 ml)

Acrilamida- Bisacrilamida

12.5%

Acrilamida- Bisacrilamida

5%

TRIS 0.375 M pH 8.8

60µl PSA 10%

20µl TEMED

TRIS 0.120 M pH 6.8

50 µl PSA 10%

20µl TEMED

Agua desionizada Agua desionizada

4°

3°

2°

1°



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Vaciar el gel resolutivo inferior entre las placas

y dejar polimerizar a T° ambiente (20 min. aprox)

Una vez polimerizado, vaciar el gel concentrador superior

sobre el otro gel inferior. Insertar la peineta

y dejar polimerizar a T° ambiente (15 min. Aprox)

Cuando el gel concentrador superior haya polimerizado,

retirar la peineta, verificando que los pocilloshayan quedado bien formados.

Montar las placas de Vidrio en la cámarade e lectroforesis en forma vertical

PROCEDIMIENTO



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Preparar las muestras y el estándar de peso molecular.

Cargar e l volumen de muestra necesario en los pocillosde gel concentrador.

Iniciar la migración electroforética,aplicando un voltaje de 100 volts por 2 horas. Aprox

Luego se introduce dentro de la cámara electroforesisy agregar hasta el borde con buffer de corrida 1X

PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTO



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Se retira el gel da la cámara, se abren las placas

y se saca cuidadosamente del gel

El gel se deja inmerso en un deposito con la

solución de tinción, durante 30 min. a T° ambiente

Luego se retira el gel y se deposita en la soluciónde decoloración durante 24 horas a T° ambiente.

Cuando el frente de migración haya llegado cerca del

extremo Inferior del gel, se apaga la fuente de poder.

PROCEDIMIENTO



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PROCEDIMIENTO

COLORACIÓN DECOLORACIÓN

PESO MOLECULAR

• Podemos estimar el peso molecular de unaproteína corrida en electroforesis con ayudade una curva estándar de razón de migración.



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• Se corre junto con las muestrasexperimentales una mezcla de proteínas depeso conocido

PESO MOLECULAR

• Midiendo luego de la corrida, la distanciaviajada por el tinte y las muestras, podemoscomparar la razón de migración de losestándares con la de los experimentales y

determinar el tamaño aproximado de estos.

PESO MOLECULAR



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RESULTADOS

Documents

Electroforesis Final