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酵素免疫生物檢測
林建源
岑祥公司技術指導員
ELISA---分子生物檢測技術
( Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay ):
酵素免疫分析法
What is ELISA used for?
用來準確偵測未知樣本內,某特定物質的含量及濃度,例如特定的蛋白質,賀爾蒙,藥物,細菌,病毒或其誘發之抗體
ELISA用的檢測盤
polystylene
抗原(sample)
鏈結酵素之抗體
呈色劑
ELISA 實驗原理
Coated 抗體
(Direct)Antigen detection
polystylene
Coated抗原
鏈結酵素之抗體
呈色劑
ELISA 實驗原理
(Indirect)Antibody detection
抗體(sample)
Virus A
Host:rabbit IgG
Host:Mouse IgG
Label:HRP
Rabbit anti-virus A
Mouse anti-rabbit IgG ,
HRP Labeled
Antibody? Name?
ELISA 實驗步驟
• 先將抗原coating在檢測盤的表面上4℃overnight,再進行blocking buffer處理
• 加入100ul sample, incubat 1hr
• 用wash buffer清洗3次(每次200-300ul)
• 加入100ul鍵結酵素之抗體, incubate 1hr
• 用wash buffer清洗 3次(每次200-300ul)
• 加入100ul呈色劑 ( substrate )
• 10-15min後,加入50ul終止液(stop solution)
• ELISA reader進行OD(optical density)判讀
酵素與呈色劑的種類
Enzyme
HRP(Horseradish Peroxidase)
Substrate
ABTS(405nm)
TMB(450nm)
AP(Alkaline Phosphatase) pNPP(490nm)
ELISA Reader 判讀原理
( I0)
BEER`S LAW
A = -logI/I0 = -logT =log1/T
A:吸光值 T:穿透率
filter
( I )
Light
Detector
BEER`S LAW 啤酒定律
A = -logI/I0 = -logT = log1/T
A = abc A = 吸光值
a = 常數
b = 光徑 ( 1 cm )
c = 濃度 ( g / L )
原理
利用每一種分子皆有其獨特吸收波峰
如 : Protein 280 nm
DNA ,RNA 260 nm
pNPP 405 nm
TMB 450 nm
H2O 977 nm
D N A C o n cen tra tio n C u rve
0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1
1 .2
1 .4
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
C o n c e n tra tio n (u g /m l )
Ab
so
rb
an
ce
Standard Curve(標準曲線)
ATCH
應用 1.
DNA RNA 定量
260 / 280 Ratio
DNA RNA / Phenol Ratio
Lowry Protein Quant ( 660 nm )
Bradford Protein Quant ( 595 nm )
BCA Protein Quant ( 562 nm )
應用 2.
ß-Galactosidase 定量 ( 420 nm )
NADH ( 340 nm )
ABTS ( 405 nm )
OPD ( 492 nm )
TMB ( 450 nm )
pNPP ( 405 nm )
應用 3.
Urease 定量 ( 588 nm )
MTT ( 570 / 690 nm )
XTT ( 492 / 690 nm )
WST-1 ( 450 / 690 nm )
Methylene Blue ( 658 nm )
專一測定樣本內,血清蛋白,荷爾蒙,藥物,細菌和病毒或其誘發之抗體的含量(須搭配ELISA實驗及ELISA reader)
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