酵素免疫生物檢測

林建源

岑祥公司技術指導員

ELISA---分子生物檢測技術

( Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay ):

酵素免疫分析法

What is ELISA used for?

用來準確偵測未知樣本內，某特定物質的含量及濃度，例如特定的蛋白質，賀爾蒙，藥物，細菌，病毒或其誘發之抗體

ELISA用的檢測盤

polystylene

抗原(sample)

鏈結酵素之抗體

呈色劑

ELISA 實驗原理

Coated 抗體

(Direct)Antigen detection

polystylene

Coated抗原

鏈結酵素之抗體

呈色劑

ELISA 實驗原理

(Indirect)Antibody detection

抗體(sample)

Virus A

Host:rabbit IgG

Host:Mouse IgG

Label:HRP

Rabbit anti-virus A

Mouse anti-rabbit IgG ,

HRP Labeled

Antibody? Name?

ELISA 實驗步驟

• 先將抗原coating在檢測盤的表面上4℃overnight，再進行blocking buffer處理

• 加入100ul sample, incubat 1hr

• 用wash buffer清洗3次(每次200-300ul)

• 加入100ul鍵結酵素之抗體, incubate 1hr

• 用wash buffer清洗 3次(每次200-300ul)

• 加入100ul呈色劑 ( substrate )

• 10-15min後，加入50ul終止液(stop solution)

• ELISA reader進行OD(optical density)判讀

酵素與呈色劑的種類

Enzyme

HRP(Horseradish Peroxidase)

Substrate

ABTS(405nm)

TMB(450nm)

AP(Alkaline Phosphatase) pNPP(490nm)

ELISA Reader 判讀原理

( I0)

BEER`S LAW

A = -logI/I0 = -logT =log1/T

A:吸光值 T:穿透率

filter

( I )

Light

Detector

BEER`S LAW 啤酒定律

A = -logI/I0 = -logT = log1/T

A = abc A = 吸光值

a = 常數

b = 光徑 ( 1 cm )

c = 濃度 ( g / L )

原理

利用每一種分子皆有其獨特吸收波峰

如 : Protein 280 nm

DNA ,RNA 260 nm

pNPP 405 nm

TMB 450 nm

H2O 977 nm

D N A C o n cen tra tio n C u rve

0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1

1 .2

1 .4

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

C o n c e n tra tio n (u g /m l )

Ab

so

rb

an

ce

Standard Curve(標準曲線)

ATCH

應用 1.

DNA RNA 定量

260 / 280 Ratio

DNA RNA / Phenol Ratio

Lowry Protein Quant ( 660 nm )

Bradford Protein Quant ( 595 nm )

BCA Protein Quant ( 562 nm )

應用 2.

ß-Galactosidase 定量 ( 420 nm )

NADH ( 340 nm )

ABTS ( 405 nm )

OPD ( 492 nm )

TMB ( 450 nm )

pNPP ( 405 nm )

應用 3.

Urease 定量 ( 588 nm )

MTT ( 570 / 690 nm )

XTT ( 492 / 690 nm )

WST-1 ( 450 / 690 nm )

Methylene Blue ( 658 nm )

專一測定樣本內,血清蛋白,荷爾蒙,藥物,細菌和病毒或其誘發之抗體的含量(須搭配ELISA實驗及ELISA reader)