View
215
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Mme Danièle Sandret et Pr JC Sabourin
Etat de l’art en anatomopathologie : où en est-on en 2013 de l’automatisation ?
L’anatomie et la cytologie pathologiques
• L'Anatomie Pathologique est une spécialité médicale clinique et biologique.
• C'est la partie de la médecine qui étudie les altérations morphologiques de l'organisme au cours des maladies.
• Médecin Anatomo-cyto-pathologiste ou pathologiste.
L’Anatomie Pathologique• Quels sont les types de prélèvements
traités?
– Pièces opératoires (tous les organes)– Biopsies– Liquides de ponction, d‘épanchements….– Urines, sécrétions– Sang (CTC)
L’Anatomie Pathologique
• Les grandes étapes techniques et médicales- Fixation- Prélèvements- Déshydratation, imprégnation en paraffine- Inclusion en paraffine- Coupes tissulaires et colorations- Interprétation médicale- Compte-rendu d’histo-cytopathologie- Conservation et archivage- Destruction des pièces anatomiques
AVANT ET MAINTENANTL’ACP : une discipline en mutation
L’enregistrement
Avant Aujourd’hui
Réception du prélèvement :Enregistrement dans le SIL du laboratoire de pathologie
INFORMATISATION +++
Fixation des tissus- But : immobiliser les constituants cellulaires et tissulaires
dans un état aussi voisin que possible de l’état vivant- Sinon : autolyse (idem post-mortem), destruction des
tissus par les enzymes qu’ils contiennent, de début très rapide
- Le plus souvent assurée par le médecin préleveur, sauf hôpitaux, pièces opératoires, extempo, et cas particuliers...
- Règles impératives- Aussi précoce que possible- Pas de fixateur parfait- Volume de fixateur plusieurs fois supérieur à celui du prélèvement
- Le plus souvent par immersion, plus rarement par perfusion
- Cas particulier de la cytologie pathologique (air, chauffage, laque, acétone...)
Principal fixateur utilisé- Formol 10% (H-CHO)
- Solution aqueuse ou tamponnée (phosphate pH7), de formol du commerce à 37% dilué au 1/10ème
- Prêt à l’emploi +++- Avantages :
- Bonne pénétration- Peu de rétraction et de durcissement des tissus- Conservation longue possible- Incolore, odoriférant- Faible prix de revient- Peu de masquage antigénique
- Inconvénients- Morphologie moyenne- Toxique, inflammable pur- Peut précipiter (pigments formoliques)
- Modalités d’utilisation- Délai prélèvement fixation < 30 min- Durée de fixation environ 24H (qq heures à + 48H)- Prélèvements en tranches fines
Le tissue Processing
Milieu aqueuxMilieu
liposoluble
Prélèvement en milieu aqueux
Déshydratation tissu par alcools
Milieu soluble dans l’alcoolXylène
paraffine : enrobage, inclusion, coupe
conservation illimitée blocs
Réhydratation coupe par alcools
Coloration aqueuse (ou alcoolique)
Déshydratation des coupes par alcools
Formol 10% (H-CHO)
méthanal ou formaldéhyde ou aldéhyde formique ou formol
La fixation
Avant
• À l’ancienne
Aujourd’hui
Aujourd’hui : Sécurité du personnel ++++
La macroscopie
Avant Aujourd’hui
La macroscopie
Avant Aujourd’hui
LE BLOC DE PARAFFINEL’ACP : une discipline en mutation
Le bloc de paraffine
Avant Aujourd’hui
Les barres de Leuckart
La macroscopie aujourd’hui : lames à usage uniquegants adaptés, gants anti-coupures, blouses…
L’imprégnation en paraffine
Avant Aujourd’hui
L’inclusion en paraffine
Avant Aujourd’hui
L’inclusion en paraffine
Avant Aujourd’hui
L’autoTech
La coupe
Avant Aujourd’hui
La coupe
Avant Aujourd’hui
Reste très manuelle +++
Le rasoir
Avant Aujourd’hui
Usage unique +++Affutage...
La coupe
Avant Aujourd’hui
C’est toujours la même chose...
Coloration
Milieu aqueuxMilieu
liposoluble
Prélèvement en milieu aqueux
Déshydratation tissu par alcools
Milieu soluble dans l’alcoolXylène
Milieu liposoluble
paraffine : enrobage, inclusion, coupe
conservation illimitée blocs
Réhydratation coupe par alcools
Coloration aqueuse (ou alcoolique)
Déshydratation des coupes par alcools
La coloration
Avant Aujourd’hui
La coloration
Avant Aujourd’hui
Le montage des lames
Avant
• À la main avec le milieu de montage
Aujourd’hui
Colorations histologiques
- Déparaffinage indispensable. Aucune coloration ne peut être faite sur coupes contenant de la paraffine
- Nombreux colorants, choisis en fonction de leur capacité à colorer divers composants cellulaires et tissulaires
- Coloration de routine : HES ou HPS, automatisables- Noyau : Hématoxyline (produit d’oxydation de l’hématéine)
- Colorant basique, forte affinité pour acides nucléiques du noyau- Cytoplasme : Eosine
- Colorant acide, d’usage facile- +/- tissu conjonctif : safran
La lecture
Avant Aujourd’hui
Microscope semi automatique
Le compte rendu
Avant Aujourd’hui
La révolution « Immunohistochimie »
Avant Aujourd’hui
Avant Aujourd’hui
Colorations manuelles par paniers de 10 ou 20 lames lames Automate +++
La révolution « Immunohistochimie »
Hier
Les premiers « robots »
La révolution « Immunohistochimie »
Aujourd’hui
La révolution « Immunohistochimie »
Avant Aujourd’hui
Les kits +++
La révolution « Immunohistochimie »
Avant
• Moins de traçabilité
Aujourd’hui
Code à Barres
La révolution « Immunohistochimie »
CK7
CK7
ACE
CK20
L’image en ACP
Avant Aujourd’hui
Images numériques
L’image en ACP
Avant Aujourd’hui
Images numériques
L’image en ACP
Avant Aujourd’hui
Les lames virtuelles
Lames virtuelles
Analyse d’images
Lame virtuelle
ET DEMAIN ?L’ACP en marche vers l’avenir
Evolution des techniques :quel impact pour la pratique clinique quotidienne ?
Le séquençage de nouvelle génération NGS
c
La révolution technologiqueLe séquençage de nouvelle génération
(NGS) :
� séquençage massif, en parallèlede millions de fragments d’ADN.
Préparation d’une banque d’ADN :
11
22La capture permet la « sélection » et l’enrichissement des cibles à séquencer
33� Amplification sur lame
de verre
� Hybridation de chaque fragment d’ADN
� PCR en pont
� Ainsi, chaque fragment va former un cluster de 1000 molécules
� Clivage des brins anti-sens pour séquençage
44
� Séquençage massif, en parallèle, utilisant des terminateurs réversibles couplés à un fluorochrome spécifique de chaque base
Les images utilisées
proviennent
de la société Illumina®.
NEXT GENERATION SEQUENCING
Permet le séquençage de grandes régions dugénome, de plusieurs 100 de gènes (voire de 1000de gènes), de l’exome et même du génomecomplet d’une tumeur dans un seul tempsréactionnel !
Permet un saut d’ échelle
NEXT GENERATION SEQUENCING
Permet le séquençage de grandes régions dugénome, de plusieurs 100 de gènes (voire de 1000de gènes), de l’exome et même du génomecomplet d’une tumeur dans un seul tempsréactionnel !
Permet un saut d’ échelle
NGS : le tissu
Tissu tumoral :
� FFPE +++ : ADN suffisamment préservé
� Accessibilité des archives +++
� Complémentaire de l’histologie
� Autorise une bonne pré-analytique
� Aujourd’hui environ de 1200 €/patient pour un exome
� Mais décroissance rapide +++
NGS : le coût
Sequencers 454 GS FLX HiSeq 2000 SOLiDv4 3730xl
Instrument price Instrument $500 000,$7 000 per run
Instrument $690 000,$6 000/ (30x) human
genome
Instrument $495 000,$15 000/100 Gb
Instrument $95 000,about $4
per 800 bp reaction
CPU 2* Intel Xeon X5675 2* Intel Xeon X5560 8* processor 2.0 GHz Pentium IV 3.0 GHz
Memory 48 GB 48 GB 16 GB 1 GB
Hard disk 1.1 TB 3 TB 10 TB 280 GB
Automation in library preparation Yes Yes Yes No
Other required device REM e system cBot system EZ beads system No
Cost/million bases $10 $0.07 $0.13 $2 400
Jeffrey S. Ross & Maureen Cronin, Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012; doi:10.1155/2012/251364
NGS : durée de l’analyse
Compatible avec une pratique clinique
Avantages du NGS Comparison of Sanger and NGS for the Cancer Cell Genome
Parameter Traditional NGS Advantage
Costper baseper Single clinical « test » ($)per 10-gene multiplex multigene test ($)Equipment
HighLow to moderate, 300-500
High, 3 000-5 000Moderate
LowModerate to high, 800-2 000 (estimated)
Moderate, 800-2 000High
NGSTraditional
NGSTraditional
Expertise required for sequencing and data analysis Moderate High Traditional
Can be performed using FFPE samples Yes Yes _
Challenged by small samples, necrotic tumor, tumor heterogeneity and low percentage of tumor sample DNA Yes Yes _
Generally restricted to 1 gene at 1 time Yes No NGS
Can easily sequence hundreds of cancer-relatedgenes in 1 sample No Yes NGS
Generally restricted to hot-spot analysis Yes No NGS
Can detect deletions No Yes NGS
Can detect translocations No Yes NGS
Can detect gene copy number alterations No Yes NGS
Sensitivity Low High NGS
Accuracy High High _
Regulatory status « Gold standard » Pending Traditional
Turnaround timeSingle geneper multiplex multigene test
ShorterLonger
LongerLonger
Traditional_
Jeffrey S. Ross & Maureen Cronin, Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012; doi:10.1155/2012/251364
FFPE: Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded; NGS: Next-Generation Sequencing
Utilisation du NGS en pathologie :apport au diagnostic
Vers une nouvelle classification des tumeurs
� Le phénotype d’une tumeur est le reflet des altérations
génétiques présentes dans toutes les cellules tumorales
qui la composent !
Séquençage complet de tumeurs :
� Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.
� The Cancer Genome Atlas Research Network Nature. 2008
Création de consortium de séquençage, ex du Cancer Genome Atlas (TCGA)� Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 2011.
� Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers Nature. 2012.� Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature.2012.
� Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 2012.
21 Signatures of mutational processesin human cancer
doi:10.1038/nature12477
2 à 6 signatures / cancers (foie, utérus et estomac)
Nature. ; 474(7353) : 609-615. doi: 10.1038/nature 10166
La nouvelle histoNGS-pathologie ?
NGS : changement de paradigmepour la pathologie
Universum - C. Flammarion, Holzschnitt, Paris 1888
L’ACP s’automatise• PLUS DE SÉCURITÉ
• PLUS DE TRAÇABILITÉ
• AIDE AU DIAGNOSTIC
• PATHOLOGIE MOLÉCULAIRE
• ACCRÉDITATION...
CONCLUSION
Merci pour votre attention
Recommended