Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes Julien Gagneur...

Étudier le métabolisme a l'état stationnaire

une approche par contraintes

Julien Gagneurdoctorant

Grenoble, 6 Mai 2004

Motivation

On cherche à « explorer différentes approches pour l'étude intégrée des réseaux géniques et métaboliques »

On se restreint à une cellule.

Régulation

MétabolismeBriques

élémentaires

Cofacteurs

Substrats du milieu

Molécules propres

Motivation

=

Roche Applied Science « Metabolic Pathways » map

E. coli:

750 réactions

500 métabolites

Motivation

Le « plan » est complet pour certains micro-organismes (H. influenzae, E. coli)

Par séquençage et annotation de génome, en cours pour d’autres micro-organismes (KEGG)

Il existe des modèles des réactions enzymatiques (MCA)

MAIS: Il est difficile d’estimer in vivo:

Les lois cinétiques

leurs paramètres

les concentrations des métabolites

Motivation

Des données structurelles, certes, mais (presque) complètes à l’échelle cellulaire

Que peut-on dire sur le métabolisme à partir du réseau seulement ou à partir du réseau et de quelques mesures?

Approche par contraintes

Plan

Analyses du métabolisme par contraintes

État quasi-stationnaire

Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Blance Analysis

propositions

Plan

Analyses du métabolisme par contraintes

État quasi-stationnaire

Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Blance Analysis

propositions

Construction du modèle

P

E

D

C

B

A

1100000100

1000001000

1001000000

1010100000

0110010010

0001110001

R10R9R8R7R6R5R4R3R2R1

N

Système

Métabolites

• Internes m=6

• Externes

Flux (réactions +transports): q=10

Stœchiométrie :

(Klamt et al, 03)

La matrice de stœchiométrie N• N est un composant essentiel du système dynamique • La dynamique du système est décrite par (MCA):

),),(()( ttft Pcr contient les paramètres cinétiques

)()(

tdt

tdrN

c

N invariant du système contient sa structure

c(t) : concentrations

r(t) : flux des réactions (reaction rates)

N matrice creuse

Hypothèse d’état quasi-stationnaire Les métabolites ont un temps de turn-over typique rapide par rapport à la régulation

Metabolite

r1

r2

r3

r4

r5 54sortantsflux rr

cc MetaboliteMetabolite

sec601.0

Le métabolisme est à l’état quasi-stationnaire (quasi steady-state)

)()(

tdt

tdrN

c

c(t) const.

Pour les métabolites internes:

Production =

Consommation

0rN }

Plan

Analyses du métabolisme par contraintes

État quasi-stationnaire

Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Blance Analysis

propositions

Metabolic Flux AnalysisDétermination d’une distribution de flux lors d’une expérience à l’état stationnaire

L’ équation Nr = 0 est souvent indéterminée(q>m : plus de réactions que de métabolites)

certains flux doivent être connuspar mesurespar hypothèses

Soit:- k (known) les indices des flux connus- u (unknown) les indices des flux inconnus

kkuu

kkuu

rNrN

0rNrNNr

Metabolic Flux Analysis

La solution utilisée est basée sur la matrice pseudo-inverse de Moore-Penrose qui résout le problème des moindres carrés:

-pour les cas sur-déterminé (moindres erreurs)-pour les cas sous-déterminé (solution parcimonieuse)

kkuu rNrN

kkuu rNNr #

Metabolic Flux Analysis

r1

r2

r3

r4A B

Sous- déterminéles flux manquants peuvent être estimés par:

- pseudo-inverse (longueur minimale)- optimisation d’autres objectifs

(croissance maximale…)

2A B 2

Déterminé2

A

0

B22

02

A B3

2.5 Sur-déterminé

Connuinconnu

MFA: Utilisation

Avec les flux externes: souvent insuffisant Combines avec des mesures (partielles) des flux internes

Isotopic Tracer Experiment

(Wiechert et al.)

Plan

Analyses du métabolisme par contraintes

État quasi-stationnaire

Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Premiers pas

Ce que l’on pourrait faire (propositions)

Irréversibilité de certaines réactions

Certaines réactions, dans les conditions de fonctionnement de la cellule, sont unidirectionnelles.

Les flux associés sont positifs ou nuls.

010 R

Construction du modèle (suite)

Flux (réactions +transports): q=10

• Rev={R2,R8}

• Irrev={R1,R3,R4,R5, R6,R7,R9,R10}

Le cône des états possibles

Les états possibles obéissent à un ensemble de contraintes linéaires:

m égalités :

|Irr| inégalités :

Cela restreint toute solution dans un cône polyédrique convexe

0rN

Irrii 0r

qr

Plan

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Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Blance Analysis

propositions

Flux Balance AnalysisDétermination d’une distribution de flux optimale à l’état stationnaire pour une fonction objectif donnée

On considère un problème d’optimisation linéaire:

Problème standard et rapidement résolubleLe argmax n’est pas unique !

rcTmax

Sous contrainte:

iii r

0Nr État stationnaire

réversibilité et capacité

Exemples: • réaction irréversible : i=0• flux maximal connu (capacité) : i=Vmax

• conditions du milieu : i= i=0

FBA: fonction objectif

1. Suivant l’idée que l’évolution a conduit à des « organismes optimaux »:

• croissance maximale (maximal growth)• rendement d’ATP

2. « metabolic engineering »: optimisation d’organisme• rendement maximal pour un certain produit• Minimisation de produits secondaires

Max cTr = (0,0,1,0,0,0,0,0,0,0) r

Sous:Nr = 0i = (0,-,0,0,0,0,0,-,0,0)i = (1,0,+,+,+,+,+,+,+,+)

“manière optimale de produire P en présence de A seulement dans le milieu ?”

Rendement optimal = R3/R1= 1

FBA: exemple

Prédiction du taux de croissance optimal (et observation !)(Edwards et al., Ibarra et al. )

Identification de rendement optimaux (Nielsen et al., Stephanopoulos et al. )

Prédiction de viabilité de mutants (Edwards et al.)

Invalidation de réseaux

Une variante pour les mutants: MoMA Minimization of Metabolic AdjustmentLe mutant serait à un état sous optimal mais voisin de l’état optimal de la souche sauvage(Segre et al.)

Simulation dynamique

FBA: application et variante

« fonction objectif naturelle » les organismes sont-ils optimaux? Pour quel objectif?

la solution optimale n’est pas unique!

Solution (1): P/A=1 Solution (3) Solution (2)

FBA: Limitations

Pas de prédiction certaine de la distribution des flux

Plan

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Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Blance Analysis

propositions

Metabolic Pathway AnalysisDéfinition de la notion de « voie métabolique » comme route fondamentale fonctionnelle a l’équilibre.

L’idée part du cône (espace des réactions):

Problème : le cône n’est pas toujours pointé(réactions réversibles)

Tout r admissible est combinaison à coefficients positifs des rayons extrêmes

rayons extrêmes = base convexe

espace linéaire

Pour avoir une définition canonique : 2 voies…

MPA: Extreme Pathways

Par reconfiguration du réseau

L’idée classique: pour toute variable libre x, on pose:x = x+ - x-

x+ >=0 ; x- >=0Toute réaction réversible est partagée en 2: forward et backward

=A AB BR Rf

Rb

0rN 0r et : cône pointé

Extreme pathways = extreme rays

MPA: Elementary Flux Modes

En se basant sur une propriété des rayons extrêmes

Tout rayon extrême satisfait un maximum de contraintes avec égalité (maximum au sens de l’inclusion)

Dans le cas irréversible:

0rN

0r

Elementary Flux Mode = une distribution de flux minimal (pour l’inclusion) en terme de réactions utilisées

Toujours satisfaites avec égalité

Un maximum avec égalité un minimum de réactions utilisées

Cas général:

MPA: 2 voies = 1 voie

En fait, extreme pathways = elementary flux modes

Sauf:

bi-cycle futile (futile 2-cycle)

utiliser les Elementary Flux Mode

(extreme pathway)A B

Rf

Rb

A B

problèmes de convention a l’interface (flux entrants et sortants) pour les extremes pathways: certains pathways optimaux peuvent être omis

MPA: exemple

(Klamt, 03)

ensemble des solutions optimales

pour P/A

R6 et R9 sont parfaitement corrélées

MPA: applications et limitations

Identification de « voie métabolique »: Base qui engendre toute solution admissible

Contient une base pour les solutions optimales aux problèmes linéaires

Corrélations de réactions

Définition des délétions létales minimales (minimal cut set)

Flexibilité du réseau (par le nombre d’EFMs)

Limitation: explosion combinatoireMétabolisme central d’E.coli (109 réactions, 500 000 EM)

Plan

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État quasi-stationnaire

Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Blance Analysis

propositions

Modèles intégrés? vue d’ensemble

réseauQuantités / temps

?

MPA

FBA

MFA

J.P.

rFBA

Plan

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État quasi-stationnaire

Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Balance Analysis

proposition

Regulatory Flux Balance Analysis

Covert, Palsson « transcriptional regulation in constraints-based metabolic models » J. Bio. Chem. 2002

Réseau génique modélise comme un réseau booléen, qui réagit a la présence ou absence de métabolites internes ou externes.

A une condition fixee par le reseau genique, FBA est appliquee

Amélioration de la prédiction de viabilité de simples mutants (de 97 a 106 sur 116 )

Amélioration des modèles dynamiques

La régulation contraint le métabolisme

Plan

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État quasi-stationnaire

Metabolic Flux Analysis

Irréversibilité

Flux Balance Analysis

Metabolic Pathway Analysis

Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?

Vue d’ensemble

Regulatory Flux Blance Analysis

proposition

Proposition

Quels degrés de liberté reste-t-il au réseau génique étant donné le réseau métabolique?

gène constitutivement exprime?

logique du réseau?

un exemple : enzyme subset

Le métabolisme contraint la régulation

Enzyme subset

Pour l’instant détecté au sein du noyau de N comme lignes colinéaires utilise pour réduire les modèles « vraisemblablement coregules »

Ensemble de réactions qui opèrent a ratio de flux fixe 2 a 2 a l’état stationnaire.

A BOu correlation plus “distante”

Exemple: cascadeA B C

01

11

10

01

K

Menaquinone synthesis operon

Enterochelin synthesis operon

A quel point peut-on prédire des opérons par contraintes structurelles issues du métabolisme?

Des structures logiques plus complexes (OU) comme un iso-enzyme ?

Proposition

Références (points d’entrée)

Metabolic Flux Analysis:

Klamt et al. 2002« Calculability analysis in underdetermined metabolic networks illustrated by a model of the central metabolism in purple nonsulfur bacteria. » Biotechnol Bioeng. Mar 30;77(7):734-51

Flux Balance Analysis:

Edwards et al 2001 « In silico predictions of E. coli metabolic capabilities are consistent with experimental data » Nature Biotech. 19:125-130

Metabolic Pathway Analysis:

Klamt, Stelling 2003 « Two approaches for metabolic pathway analysis? » Trends in Biotech. 21 (2):64-69