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Expressão de Antígenos
Recombinantes para
Aplicação em Imunologia
Bióloga Mariana Monezi Borzi
Mestranda em Microbiologia Agropecuária
Laboratório de Imunologia e Virologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV
CAMPUS DE JABOTICABAL
• Cópia das sequencias de nucleotídeos de uma molécula de DNA parental de fita dupla em duas moléculas filhas de DNA de fita dupla.
• Semi-conservativa
Replicação
Fita molde
Fita nova
É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula
de DNA de fita dupla (gene)
Transcrição
Núcleo
Informação genética
Citoplasma
Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de
aminoácidos que constituem a proteína.
Tradução
Expressão gênica
Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10.000 Da, com cada aminoácido unido ao seu vizinho por um tipo específico de ligação
covalente.
Proteína
Ligações peptídicas
Ligações peptídicas
Pontes de hidrogênio
Ligações peptídicas
Pontes de hidrogênio
Ligações dissulfeto
Interações eletrostáticas
Forças de Van der Walls
Produção em larga escala de proteínas recombinantes - a partir da expressão de uma
molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.
Tecnologia do DNA recombinante
Uso terapêutico
Estudos bioquímicos
- Estrutura 3D
Dificuldades a partir do tecido original
Células de mamíferos, células de insetos, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis e
Escherichia coli
Taxa de crescimento celular;
Complexidade do meio de
cultura;
Custo do meio de cultura;
Nível de expressão;
Capacidade de expressão
extracelular.
Capacidade de produzir as
modificações pós-tradução tais
como:
- enrolamento correto;
- formação das pontes dissulfito;
- glicosilação;
- fosforilação;
- acetilação.
Sistemas de Expressão
• Crescimento rápido, em um período curto de tempo, requerem pouco espaço físico e possuem uma nutrição fácil de ser suplementada.
• Genética relativamente simples e bem compreendida
• Único cromossomo de aproximadamente 4,6 milhões de pares de bases e completamente sequenciado
• Código genético quase universal
Escherichia coli
Vetor: molécula de DNA usada como um veículo para carregar sequências de DNA estrangeiras dentro de uma célula hospedeira.
Plasmídeos:
• Mais simples
(1.000 a 2.000 pb)
• Circulares
• Independentes do cromossomo bacteriano
Vetores de expressão
Vetor linearizado Preparo do inserto
Reação de ligação
Plasmídeo recombinante
Transformação de E. coli
competente
Plaqueamento e seleção
dos clones recombinantes
Extração do
DNAp e
Sequenciamento
Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)
• Separação de proteínas conforme o peso molecular, as quais migram pelos poros do gel de poliacrilamida
• Quanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará em relação às outras proteínas
• Após a corrida das proteínas pelos poros do gel, estas poderão ser visualizadas com a aplicação do corante Coomassie Blue
Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e 2-mercapto-etanol
Confere carga negativa Separa as cadeias
260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
10 kDa
Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do
Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
Western blotting
• Técnica bioquímica utilizada para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou outras moléculas.
• Detecção de antígenos proteicos - uso de anticorpos específicos
72 kDa
52 kDa
42 kDa
260 kDa
10 kDa
Caracterização por Western Blotting da Nucleoprotéina
recombinante do Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
• Substâncias (moléculas) estranhas ao SI que são reconhecidas por receptores específicos em linfócitos B e T e também por anticorpos.
Antígenos
Anticorpos
• Proteínas do tipo imunoglobulinas com sítios específicos para interação com os antígenos e que são sintetizadas por linfócitos B e plasmócitos.
• O Ac se liga somente a uma parte do Ag, denominada epítopo ou determinante antigênico.
• Quando o parátopo do Ac se liga ao epítopo do Ag
Interação Ag-Ac
Imunodiagnóstico
• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos virais e bacterianos específicos
Preparações antigênicas:
Propagação viral em ovos
Ultra-centrifugação
Expressão de proteínas
Imunodifusão em gel de agarose
Inibição da
Hemaglutinação
ELISA
Diagnóstico da Influenza Aviária
• Clonagem e expressão da NP do VIA
• Aplicação em testes de ELISA
• 121 soros testados
• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com a NP recombinante
• Negativos – não ocorria reação
• Apresentam sequencias do material genético do agente infeccioso que codificam antígenos
Vacinas de DNA
Clonagem e expressão do gene (propagação)
Administração ao indivíduo (transfecção)
Células produzem a própria proteína (antígeno)
Resposta imunológica com memória
AIDS
Malária
Dengue
Tuberculose humana e bovina
Hepatite B
Raiva
Leptospirose
Teníase
Exemplos: vacinas de DNA
ABBAS, A. K.; LICHTMA, A. H. Imunologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005, 5º ed.
BRAMMER, S. P. A técnica de eletroforese: importância e aplicações em análises genéticas. 2001. Disponível em: <http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_do06.htm>. Acesso em: 14 de Abril de 2013.
BROWN, T.A. Clonagem gênica e análise de DNA: Uma introdução. 4 ed., Porto Alegre, Ed Artmed, 2003.
LIMA, T. Western Blotting – Immunoblotting. Imunologia & Hematologia. 2010. Disponível em: <http://www.imunologiahematologia.wordpress.com/category/imunologia/>. Acesso em: 07 de Maio de 2013.
MICKLOS, D. A.; FREYER, G.A.; DNA Science: A First Course. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, 575 pg.
NELSON, D. L.; COX, M.M. Princípios de bioquímica de Lehninger. 5ª edição. Porto Alegre: Artmed, 2011
PELCZAR JR., M. J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2. ed. São Paulo: Makron Books, 1996. v. I.
SAMBROOK, J., RUSSEL, D.W. Molecular Cloning: a laboratory manual (3-Volume Set), 3ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 1531 pg.
SOUZA, A.A.U. Separação de proteínas por eletroforese desnaturante descontínua na presença de SDS (SDS-PAGE). Universidade Federal de Santa Catarina. 2010. Disponível em: <www.enq.ufsc.br/disci/eqa5517/pratica_eletroforese.doc> Acesso em: 14 de Abril de 2013.
SøRENSEN, H. P.; Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology 115 (2005) 113–128.
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