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FEBRE MACULOSA BRASILEIRA:
DIAGNOSTICO HISTOPATOLÓGICO E
IMUNOHISTOQUIMICO NA REGIÃO METROPOLITANA
DE SÃO PAULO
Dra Silvia D’Andretta Iglezias
Nucleo de Anatomia Patológica
Instituto Adolfo Lutz
Febre Maculosa Brasileira (FMB)
• A FMB é causada pela Rickettsia ricketsii,
cocobacilo intracelular Gram negativo, que
infecta células endoteliais causando graves
manifestações sistêmicas em humanos.
• É considerada uma das mais virulentas
infecções humanas e apresenta alta
letalidade em São Paulo.
Núcleo de Patologia do IAL
• Amostras de tecido de autópsia ou biópsia;
• Estado de São Paulo (também GO, DF, ES e MS)
• FMB corresponde a 5% do total dos óbitos recebidos;
• 2016 (até agosto): 390 óbitos, 9 casos provenientes do estado de São Paulo , sendo 3 da RMSP
Associação entre diagnóstico histopatológico e imunohistoquímico.
Nucleo de Patologia - IAL
Nucleo de Patologia - IAL
Febre Maculosa Brasileira (NAP – IAL)
PeríodoDRS I
Gde.S.Paulo
DRS VI
Baurú
DRS VII
Campinas
DRS IX
Marília
DRS X
Piracicaba
DRS XI
Pres.Prudente
DRS XIII
Rib.Preto
DRS XVI
SorocabaTotal/ano
2001 1 0 2 0 0 0 0 0 3
2002 1 0 1 0 0 0 0 0 2
2003 1 0 2 0 0 0 0 0 3
2004 6 0 5 0 0 0 0 0 11
2005 5 0 0 0 1 0 0 0 6
2006 3 0 5 0 0 0 0 0 8
2007 1 0 1 0 0 0 0 0 2
2008 4 0 2 2 0 0 0 0 8
2009 3 0 7 0 0 0 0 0 10
2010 4 0 5 1 0 0 0 0 10
2011 0 0 3 0 0 0 0 0 3
2012 6 1 4 0 0 0 0 0 11
2013 3 0 6 0 0 1 0 0 10
2014 3 0 7 1 1 0 0 1 13
2015 3 0 12 2 1 0 1 0 19
2016* 3 0 4 0 2 0 0 0 9
Total/DRS 47 1 66 6 5 1 1 1 128
(*) até junho/2016
128 casos FMB (15 anos, NAP – IAL)
FMB – sequência patogenética:
• Picada do carrapato (saliva)→ inoculação da bactéria na pele→ escara de inoculação → vasos linfáticos→ linfonodos→ corrente sanguínea para todos órgãos
• Células alvo: endotélio de pequenos vasos sanguíneos
• Infecção endotelial disseminada de todos órgãos sendo cérebro, fígado e pulmões os órgãos vitais mais afetados
Células endoteliais infectadas
1, 2- Attachment of rickettsia via adhesins (OmpA, OmpB) to host cell receptors (Ku70) – ubiquitin
ligase
3 - rearrangement and engulfment
4 - rickettsia in cytoplasmic endosome
5 - rickettsial enzymes (phospholipase) lyse vacuolar membrane allowing rickettsial escape into the
cytosol
6 - replication by binary fission
7 - rickettsial RickA activation of Arp2/3 leads to host actin-based mobility and extracellular release
8 - cell-to-cell spread, or invagination into the endothelial cell nucleus (N) .
llustrated by Aaron Medina-Sanchez
D. Walker 2007
rosa = cel endotelial
marron = nucleo
verde = bacteriaadesinas
Fisiopatologia FMB
• células endoteliais infectadas
• Vasculite aguda / disfunção vascular
• Aumento da permeabilidade vascular
cérebro: ↓função
• Edema extracelular pulmões: hipoxemia
fígado: ↑ transaminases
rim: insuficiência renal
Aumento da permeabilidade vascular
• Ruptura de junções “adherens” entre células endoteliais
infectadas → “gaps” → aumento de permeabilidade
microvascular → passagem de plasma para interstício →
edema tecidual
O edema pulmonar e cerebral são as principais causas de
alta morbidade e mortalidade nas infecções por rickettsia
Vasculite típica e edema perivascular no tecido
cerebral de paciente com FMB fatal (H&E)
Núcleo de Patologia do IAL
• óbitos de causa infecciosa à esclarecer de interesse em Saúde Pública: SFIHA, SRAG, meningoencefalites, miocardites, etc
• Serviços de verificação de óbito (Svos e FMs)
• Conceito órgão-alvo do agente infeccioso é fundamental na seleção de amostras
• Amostras de 7 órgãos vitais: cérebro, coração, pulmão, fígado, baço e rim, eventualmente pele, supra renal e músculo esquelético.
Amostra tecidual
• Frasco boca larga
• Fragmentos 2 x 2cm
• Formalina tamponada qsp
• Temperatura ambiente
• Identificação correta
INADEQUADO
Fixação inadequada da amostra tecidual
Quantidade
insuficiente de
formol: a fixação
não ocorreu na
totalidade da
amostra.
Quantidade insuficiente
de formol: a fixação não
ocorreu na totalidade da
amostra.
INADEQUADO
Fixação da amostra tecidual
• Formol p.a. = solução de formaldeído a ~ 40% = Formalina 100%
• Solução fixadora: Formalina neutra tamponada
Formaldeído p.a. .................................100 mL
Fosfato monobásico de sódio ............. 4,0 g
Fosfato dibásico de sódio ................... 6,5 g
Água destilada q.s.p. ........................1000 mL
• Mecanismo de fixação: Formação de pontes de metileno
• Tempo recomendável para procedimento de fixação: 18 – 24 h.
• Tecidos mal e/ou excessivamente fixados = problemas para
utilização em reações IHQ e de biologia molecular técnicos
Processamento histológico
SVO
Tempo: 24h
histotécnicobloco
micrótomo
lâmina em branco
cassete
Coloração
Ex histológico e IHQ
+ informações clínicas
LAUDO FINAL
H&E
IHQ
lâmina em branco
O que é imuno-histoquímica?
• É a localização em corte histológico de um antígeno
conhecido por meio de anticorpos diretamente
direcionados a esse antígeno.
• O complexo Ag-Ac é visualizado usando-se um marcador:
Reação imuno-histoquímica (IHQ)
IHQ:
• Reação antígeno-anticorpo diretamente em corte histológico, avanços a partir da década de 80.
• 1990’s: polímero de Dextranconjugado com enzimas e anticorpos (camundongo, coelho) Envision TM
• Sabattini et al, J.Clin Pathol 1998;
51:506-511.
Envision TM
Antígeno
Enzima
Polímero
Ac 2º
Ac 1º
lâmina
IHQ- protocolo básico:
• Microtomia – uso de lâminas silanisadas/carga/adesivo
• Desparafinização e reidratação dos cortes histológicos
• Recuperação de antígenos (fonte de calor)
• Reação imuno-histoquímica propriamente dita (Ag-Ac)
• Substratos e cromógenos (DAB, FA, True Blue etc)
• Desidratação dos cortes e montagem em meio de
montagem permanente para exame microscópico.
• Tempo médio: 30 a 36 horas
Reação imuno-histoquímica
Limitações:
• disponibilidade do anticorpo
• preservação de epitopos com fixação adequada
IHQ no diagnóstico de doenças infecciosas
1. Resultados rápidos
2. Menor risco de exposição de agentes infecciosos altamente patogênicos já que utiliza amostra fixada e emblocada em parafina
3. Alta sensibilidade
4. Possibilidade de diagnóstico retrospectivo
5. Permite identificação de agentes infecciosos específicos pela utilização de anticorpos monoclonais e alguns policlonais
Utilizamos sempre painel de pesquisa de anticorpos relacionados à sindrome clínica
IHQ no dg de doenças infecciosas - Dificuldades:
1. Qualidade técnica adequada
2. Obtenção de caso controle positivo adequado
3. Anticorpos policlonais (↑sensibilidade) x
monoclonais (↑especificidade)
4. Anticorpos “in house” x comerciais
5. Reação cruzada: especialmente entre as várias
espécies de fungos entre si e algumas
bactérias entre si
Laudo de IHQ em doenças infecciosas
• POSITIVA a pesquisa IHQ de antígenos de ...
• NEGATIVA a pesquisa IHQ de antígenos de ...
• INCONCLUSIVA a pesquisa IHQ de antígenos de ...
(refere-se a problemas da reação)
• INADEQUADA a pesquisa IHQ de antígenos de ...
(refere-se a problemas da amostra)
É obrigatório que o aspecto histológico seja
concordante com resultados obtidos pela IHQ!
IHQ na Febre Maculosa Brasileira
• IHQ tem sido usada com sucesso para detectar
antígenos do grupo Rickettsiae em cortes
histológicos: imunomarcação positiva em endotélio
vascular de qualquer órgão!
• Alta especificidade e sensibilidade tanto em
amostras de autópsia como de biópsia (bi de pele)
• Anticorpo policlonal fornecido pelo CDC/USA (grupo
Rickettsiae: R. rickettsii, R. parkeri; R. conorii)
Demonstração imuno-histológica de antígenos do grupo Rickettsiae no
endotélio vascular no fígado em caso fatal de FMB
Lesão de pele - FMB
• Infiltrado perivascular
• Edema e necrose de
células endoteliais
• Extravazamento de
hemácias
• Edema tecidual
• Vasculite leucocitoclásica
• Trombos de fibrina focais.
• Escara de inoculação (H&E)
Lesão de pele - FMB
• Rash cutâneo
Lesão de pele - FMB
Biópsia de pele
A IHQ é útil no
diagnóstico de FMB,
especialmente quando a
biópsia é realizada na fase
aguda do rash cutâneo.
IHQ
Sistema nervoso central - FMB
↓função neurológica
• Inflamação angiocêntrica
(linfócitos e macrófagos)
• Vasculite
• Trombose , microinfartos
e hemorragia perivascular
• Edema extracelular
H&E
Sistema nervoso central - FMB
H&E IHQ
Meninges - FMB
H&E IHQ
Coração - FMB
H&E - Miocardite IHQ
Pulmões - FMB
Insuficiência respiratória
hipoxemia
• Lesão microvascular de
septos alveolares
• Edema intersticial
• Edema intralveolar
• Congestão
H&E
Pulmões - FMB
H&E IHQ
Fígado - FMB
icterícia
↑ transaminase
• Inflamação portal
• Vasculite portal
• Trombos vasculares portais
• Hemorragia do trato portal
• Leucocitose sinusoidal
Necrose focal de hepatócitos, porém sem falência
hepática!!
H&E
Fígado - FMB
• H&E: espaço porta • veia centrolobular
Fígado - FMB
Imunomarcação positiva em vasos portais
Baço - FMB
H&E: esplenite inespecífica IHQ
Rim - FMB
↓ função renal
• Nefrite intersticial
• Edema
• Necrose de células
tubulares
• Vasculite leucocitoclásica
H&E - vasculitis
Rim - FMB
H&E IHQ
Músculo esquelético
H&E - miosite IHQ
Outros órgãos:
miométrio
Pâncreas
Aspectos histológicos marcantes na FMB:
• Típicamente lesões multifocais em vários órgãos,
caracterizada por vasculite leucocitoclásica em
pequenos vasos.
• Apesar do estado de propensão à coagulação, a
CIVD é rara, mesmo em casos graves!
• Também são raras as hemorragias e os trombos
vaso-oclusivos causando infartos!
Diagnóstico diferencial anátomo-patológico da FMB
• Leptospirose
• Dengue
• Febre amarela
• Malária
• Sepsis
• Meningococcemia
Síndrome febril íctero-hemorrágica
(SFIHA)
Sintomas clínicos iniciais são semelhantes à FMB!
Leptospirose - fígado
• H&E • IHQ
Dengue - fígadoH&E IHQ
Febre amarela - fígadoH&E IHQ
Malária - fígado
Meningococcemia
• Dg diferencial com FMB
especialmente em
crianças e jovens
• Amostras de SNC e de
supra-renal, sempre que
possível!
SNC -Imunomarcação positiva
para N. meningitidis
OBRIGADA !
Dra Silvia D’Andretta Iglezias
Nucleo de Anatomia Patológica -IALimunohistoquimicaial@yahoo.com
Cinthya dos S Cirqueira,
Maria Cristina Kanamura,
Natalia Fernandes,
Rodrigo Ressio
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