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Graduação em Biotecnologia
Disciplina de ProteômicaCaroline Rizzi
Doutoranda em Biotecnologia -UFPel
Importância do cálculo do pI
1. Vector NTI
2. Expasy
Focalização isoelétrica
Solubilidade
Purificação: Proteínas ácidas:
pH>pI: troca iônica
Proteínas básicas:
pH<pI: troca catiônica
Calculado através de todos os NH e COOH livres
Importância do cálculo do pI
Com o uso de tampõesanfólitos, um gradiente de
pH é formado sob ação de um campo elétrico!
Focalização isoelétrica
Massa Molecular
Unidades de massa atômica “Atomic MassUnit” (amu ou u ou Da): utilizada para
expressar a massa molecular ou peso atômico
1 Da: 1/12 da massa do 12C
1 átomo de Hidrogênio possui cerca de 1 Da
Massa Molecular
Cálculo atráves de programas: Vector e Expasy
Importância:Gel 2D
Concentração de proteínas por filtraçãoGel filtração
Estimativa: Calculado através da soma da massa média dos isótopos
Determinação:Espectrometria de massas
Gel filtração
Eletroforese de proteínas
Teoria da eletroforese: as proteínas com carga elétrica em virtude da
ionização movem-se para o catódo (pólo negativo) ou ânodo (pólo
positivo), dependendo do tipo de carga que apresentam;
As proteínas são separadas conforme sua
carga, estrutura 3D e sua massa
Separação de proteínas através da sua
movimentação em um campo elétrico
São quase sempre realizadas em géis que
servem como peneira molecular
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel eletrophoresis
SDS: desnatura
e carrega
todas as
proteínas
negativamente
Migração para o
ânodo
Separação pelo
tamanho
Malha de
acrilamida-
bisacrilamida
Solubilidade de Proteínas
Fatores intrínsecosDepende da quantidade de pontes de H que os seus grupos polares
podem formar com a água
Solubilidade de Proteínas
Fatores extrínsecos: perturbação das interações solvente-proteínaConcentração de eletrólitos no meio
[sal] interação íons salinos e cargas das
proteínas
solubilidade
(SALTING IN)
[sal] competição entre íons salinos e
cargas das proteínas pela água
solubilidade (ppt)
(SALTING OUT)
Solubilidade de Proteínas
Fatores extrínsecospH do meio
próximo do pI solubilidade
solubilidade (ppt)
Diminuem as forças repulsivas entre
as moléculas das proteínas
Agregados= precipitação
Solventes orgânicos
Anfipáticos: acetona, etanol...
Infiltram-se no interior e
superfície das proteínas
Competição pela água, alteração do
do interior hidrofóbico, diminuição
da [água]
Precipitação
Desnaturação de proteínas
Agentes desnaturantes:
Agentes redutores
Uréia, guanidina
Altas temperaturas
pH
Detergentes
Preparação do extrato bruto para purificação
Questões?
• Qual é a fonte de proteínas?
• Tecido, bactérias, intra ou
extracelular?
• Quais são os equipamentos
disponíveis?
• Qual é a escala de purificação?
• Quais serão os procedimentos de
purificação a serem utilizados?
• Qual é o grau de pureza e
atividade biológica desejados?
Condições básicas de obtenção
• Realização rápida;
• Temperaturas baixas;
• Presença de tampão adequado e
capaz de manter o pH e de força
iônica que estabilize a amostra;
• Amostras limpas e livres de
partículas insolúveis.
Escolha do tampão
Características do tampão• Concentração: quanto maior, maior
tamponamento, mas não maior que 0,1M
• Tampões desejáveis:
1. pKa do tampão deve ser próximo ao pHfinal da solução e não exceder o limitede 1;
2. O pH do tampão não pode ser afetadopelas pequenas variações detemperatura, diluições e adição de saisneutros;
3. O tampão não deve ser reativoquimicamente;
4. Não pode absorver luz a 280 nm;
5. Para cromatografias de troca iônica,usar tampão iônico;
6. Tampões não podem interagir comcomponentes da mistura (ex; ácidobórico e glicoproteínas).
• Good’s buffers*:
• MES,ADA, PIPES,ACES, BES, MOPS, HEPES, TAPS, CHES, CAPS: quimicamente não reativos, não absorvem a 280 nm, o valor de pH não varia com temperatura e sais
• Muito mais caros
• Variações pequenas no pH (0,05 u): concentrações de 0,1 a 0,2 mM
• Variações bruscas no pH (> 0,1 u): concentrações acima de 50mM
• Reações enzimáticas: cuidar a liberação oucaptação de prótons
*N. E. Good. G. D. Winget, W. Winter, T. N. Connolly, S. Izawa, and R. M. M. Singh, Biochernisrry 5, 467 (1966)
Aditivos ao tampão
NaCl;
EDTA;
Detergentes;
Inibidores de proteases;
Agentes redutores;
DNAses e RNAses;
Estabilizantes;
Conservantes.
Detergentes
Compostos anfifílicos;
Formação de micelas;
Agentes solubilizantes e
desagregantes;
A maioria não absorve a 280
nm;
Estabilidade, funcionalidade,
estrutura e solubilidade da
proteína: não garantidas;
Concentração final de 0,01 a
5%.
CMC: concentração onde há o
início da formação das
micelas
Proteínas
integrais da
membrana
detergente micelas
Complexos
não micelares
Dependendo da concentraçãoDetergentes: iônicos e não
iônicos
Detergentes
não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
SDS
Dodecil sulfato de
sódio
Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide
Deoxicolato de sódio
Detergentes iônicos
Octilglicosídeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)
Sarcosil
Uréia
Desnaturação e solubilização de proteínas;
Barata e de fácil remoção;
Eleva a solubilidade de grupos da proteína na solução aquosa, através da acomodação dos grupos apolares;
Guanidina e tiouréia;
A tiouréia é um agente mais eficiente que a uréia, mas pouco solúvel em água;
A mistura uréia- tiouréia é bastante eficiente;
Concentrações de 6 a 8 M.
Corpos de Inclusão
• E. coli: a proteína superexpressapode acumular-se no interior dacélula como uma forma insolúvel(corpos de inclusão);
• Facilita a purificação;
• Forma ativa?
• Desnaturadas e reduzidas;
• Dímeros e multímeros;
• Purificação de corpos de inclusão:– Lise celular
– Isolamento dos corpos de inclusão
– Solubilização
– Purificação
– Refolding
Lise celular e obtenção do extrato bruto
Suaves
• Choque osmótico: hemácias
• Digestão enzimática com lisozima:– 0.2 mg/ml, 30 min, 4 C
– Bactérias gram negativas e proteínas
intracelulares
– Expõe a membrana citoplasmática pela
degradação dos peptídeos da parede
celular
– Minimiza desnaturação e é
independente da escala
– pH ótimo: 6,7 a 8,6
• Trituração, moagem
• Método Freeze-Thaw
Vigorosas• Sonicação:
– Suspensão celular: proteínas intracelulares, periplasma, corpos de inclusão
• Prensa Francesa:– Bactéria, tecidos de plantas
• Fracionamento por precipitação:– Proteínas extracelulares:secretadas,
anticorpos monoclonais, lisadoscelulares
– Baixo custo, grandes volumes
• Agitação com abrasivos:– Pérolas de vidro
• Liquefação:– Potter
tecidos
células
Homogeneização
(para romper tecidos e células)
por pressão(prensa francesa)
liquefação(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material
de
partida
Material na
fonte
por ultra-som comdetergente
Lise Celular
Sonicação Ultrasons que rompem as amostras
Mistura com esferas de vidro para
estruturas mais resistentes
(micobactérias, estafilococos..)
Aumenta a temperatura da amostra
Formação de bolhas
Preparação do extrato bruto
Centrifugação
Remoção de ácidos
nucléicos
Precipitação de proteínas
Diálise
Filtração
Concentração
Eliminação da maior parte dos contaminantes e substâncias
insolúveis
Centrifugação
• Peletilização:
– Separação por densidade
– Útil após lise, precipitação
de DNA e proteínas,
concentração e diálise.
A centrífuga
Câmara blindadaAmostra sedimentando
refrigeração vácuo
rotorângulo
fixo
fração
citoplasmática
Remoção de ácidos nucléicos
RNAses
DNAses
Sulfato de estreptomicina: ajuda a
precipitar proteínas
contaminantes.
Fracionamento por precipitação
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
- adição de sais (Precipitação salina)
- adição de solventes
- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
So
lub
ilid
ad
e d
a h
em
og
lob
ina
(S
/S’)
KCl
NaCl
MgSO4
(NH4)2SO4
K2SO4
Concentração do Sal,, Molar
Salting-in X Salting-out
Baixa concentração: solubilidade↑(íons do sal ajudam a reforçar a
camada de solvatação)
Alta concentração: solubilidade↓
(competição pelas moléculas de
água disponíveis)
Sais com ânions divalentes são mais
eficientes do que os monovalentes
na precipitação de proteínas.
Efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da
hemoglobina.
Precipitação por sais
So
lub
ilid
ad
e,
log
FibrinogênioPseudoglobulina
MioglobinaAlbumina
Hemoglobina
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar
Proteínas apresentam diferentes sensibilidades
para a precipitação salina.
- precipitam primeiro:
proteínas maiores
proteínas mais hidrofóbicas
.
Sulfato de amônia: estabiliza as proteínas, não é desnaturante,
sobrenadante pode ir à cromatografia, preservação de proteínas
Sulfato de amônia: preparação da solução saturada
Adição a concentrações crescentes
Volume para 1 litro de solução: 1000(C2-C1) / 100 – C2
C1= concentração inicial sulfato de amônia(%)C2 = concentração final sulfato de amônia (%)
20%, 35%, 45%, 60%, 75%....
Solventes miscíveis com a água diminuem a
constante dielétrica do meio e diminuem sua
interação com a água.
Água
Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
78.5
48.9
32.6
24.3
20.7
Solvente Constante
Dielétrica
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu pI tendem
a precipitar
Precipitação por solventes e pI
Diálise
Usos:
Troca de tampão
Remoção de sais
Remoção de
detergentes
Princípios:
Membrana de
celofane com poros
de até 10.000 Da
Imersão no solvente
Trocas
solvente/amostra
Volume
solvente/amostra
Concentração
Ultrafiltração:
• Uso de membranas
semipermeáveis e
pressão;
• Separação de proteínas
por tamanho e remoção
de solventes;
• Remoção do excesso de
sais ou troca de tampões
(concentrações repetidas);
Concentração
Membranas:
• Cut off: 5, 8, 10, 30, 50,100,
300, 500 e 1000 kDa;
• Níveis de redução da ligação
não específica de proteínas;
• Resistência à pressão;
Microconcentrador:
• Volumes de 0,5 a 15 mL;
• Centrifugação;
Exemplos de Estratégias
Extratos de E. coli
Lise por lisozima
Lise por sonicação
Centrifugação
Precipitação de ácidos nucléicos
Centrifugação
Precipitação de proteínas
Centrifugação
Proteínas secretadas
Centrifugação
Precipitação de proteínas
Centrifugação
Solubilização
Diálise
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