View
12
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
i
IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*4 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Dewa Ayu Sri Handani
NIM : 168114058
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*4 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Dewa Ayu Sri Handani
NIM : 168114058
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Skripsi ini saya persembahkan kepada Ida Sang Hyang Widhi Wasa yang telah
menuntun dan memberkati saya dari awal hingga akhirnya skripsi ini selesai.
Terimakasih sebanyak-banyaknya kepada Ajik, Ibu, Mb Ayu Lestari, Iwik, Dewa
Agus dan sahabat-sahabat Gasspoll yang tak henti-hentinya memberikan
semangat, dukungan, dan selalu mendoakan saya untuk kelancaran dalam
perkuliahan maupun skripsi.
Dan dengan bangga saya ucapkan terimakasih kepada almamater tercinta
Universitas Sanata Dharma sebagai tempat saya berproses, menimba ilmu
kefarmasian, dan tempat saya bertumbuh menjadi lebih dewasa.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................ v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... vi
PRAKATA ..................................................................................................... vii
DAFTAR ISI .................................................................................................. ix
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xi
ABSTRAK .................................................................................................... xii
ABSTRACT ..................................................................................................... xiii
PENDAHULUAN ......................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ............................................................................... 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 7
KESIMPULAN ............................................................................................. 18
SARAN ......................................................................................................... 18
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 19
LAMPIRAN .................................................................................................. 22
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis
........................................................................................................ 9
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen basa nukleotida CYP2A6*1 .. 12
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*1 ......13
Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum ..............................14
Gambar 5. Jalur Metabolisme Senyawa Prokarsinogenik Nitrosamin (NNK,
NNAL, dan NNN) ...........................................................................16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik ........................................................23
Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix ................................24
Lampiran 3. Informasi Pemakaian Go Taq Green Master Mix ..........................25
Lampiran 4. Lembar Informasi Produk DNA Ladder & Markers ......................26
Lampiran 5. Hasil PCR ....................................................................................27
Lampiran 6. Hasil penelitian ............................................................................28
Lampiran 7. Informasi Pemakaian FavorPrepTM ...............................................30
Lampiran 8. Hasil kuisioner .............................................................................32
Lampiran 9. Lembar Informasi untuk Responden .............................................34
Lampiran 10. Lembar Pernyataan Persetujuan Responden ..................................36
Lampiran 11. Perhitungan jumlah sampel ..........................................................37
Lampiran 12. Primer PCR alel CYP2A6*4 ........................................................38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
ABSTRAK
Asap rokok yang dihirup oleh individu nonperokok mengandung senyawa
prokarsinogenik nitrosamin yang dapat menyebabkan kanker setelah diaktivasi oleh
enzim Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) melalui jalur α-hidroksilasi. Alel gen
CYP2A6*4 adalah bentuk polimorfi gen CYP2A6 akibat delesi sehingga terjadi
penurunan aktivitas metabolisme dan menurunkan risiko kanker terkait nitrosamin.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dan frekuensi alel gen
CYP2A6*4 pada subjek nonperokok dengan ras kulit hitam Papua Indonesia.
Keberadaan CYP2A6*4 dapat memprediksi aktivitas metabolisme senyawa
prokarsinogenik nitrosamin dan risiko kanker pada nonperokok ras kulit hitam
Papua. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Sebanyak 30
subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua yang memenuhi kriteria diambil
sampel darahnya dan dilakukan isolasi DNA. Metode yang digunakan adalah
Polymerase Chain Reaction (PCR) yang merupakan teknik memperbanyak DNA
dari sejumlah kecil isolat DNA. Analisis produk amplifikasi PCR dilakukan dengan
menggunakan metode elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada ras
kulit hitam Papua terdapat alel gen CYP2A6*4 dengan frekuensi tinggi (33,33%),
sehingga 33,33% dari ras ini memiliki aktivitas metabolisme senyawa
prokarsinogenik nitrosamin lebih lambat dan risiko kanker terkait nitrosamin lebih
rendah.
Kata kunci: Prokarsinogenik Nitrosamin, CYP2A6*4, ras kulit hitam Papua,
Metode PCR, Metode Elektroforesis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
ABSTRACT
Cigarette smoke that is inhaled by non smokers being contained a
procarcinogenic nitrosamine which can cause cancer after being activated by the
enzyme cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) via the α-hydroxylation pathway. The
CYP2A6 * 4 allele is a polymorphic form of the CYP2A6 gene due to a deletion
resulting to decrease its metabolic activity as well as to reduce the risk of
nitrosamine related cancers. This study is aimed to identify the existence and its
frequency of the CYP2A6* 4 allele in non-smokers with Indonesian Papuan black
race. The existence of CYP2A6 * 4 can predict the activity of this enzyme in
metabolizing procarcinogenic compounds associated with the risk of cancer in
Papuan non-smokers. This research is an observational descriptive study. A total of
30 Papuan non-smokers who met the criteria were sampled their blood to be isolated
their DNA. This study used Polymerase Chain Reaction (PCR) which is a technique
to multiply DNA from a small DNA isolate. The PCR product analyzed using an
electrophoresis method. The results showed that the Papua race there an indicates a
CYP2A6 * 4 gene allele with high frequency (33.33%), therefore 33,33% of these
races have slower metabolic activity of nitrosamine and a lower risk of nitrosamine-
related cancers.
Keyword: Procarcinogenic Nitrosamine, CYP2A6 * 4, Papuan Black Race, PCR
Method, Electrophoresis Method
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Merokok adalah perilaku berisiko sakit yang dilakukan oleh 65,19 juta
orang (34%) penduduk Indonesia. Angka tersebut menunjukkan Indonesia
merupakan negara dengan jumlah perokok terbanyak di Asean (Southeast Asia
Tobacco Control Alliance, 2016). Menurut Riskesdas (2013) sekurang-kurangnya
25.000 orang telah meninggal akibat penyakit dengan faktor risiko paparan asap
rokok di Indonesia. Penyakit yang menyebabkan kematian pada perokok pasif yaitu
infeksi pernapasan bawah, asma dan kanker paru-paru (Öberg et al., 2011).
Asap rokok (tembakau) mengandung lebih dari 4.000 bahan kimia yang
69 diantaranya adalah senyawa karsinogenik. Nitrosamin merupakan senyawa
prokarsinogenik yang terkandung dalam asap rokok. Pada penelitian Yalcin dan de
la Monte (2016) ditemukan bahwa senyawa nitrosamin yaitu NNK (N-
Nitrosometilamino)-1-(3-piridil)-1-butanon), NNN (N-Nitrosonornikotin) dan
NNAL (Nitrosaminaldehid) merupakan senyawa prokarsinogenik paling poten.
Senyawa-senyawa ini terdapat dalam jumlah tinggi pada asap rokok dan lingkungan
yang telah terkontaminasi oleh asap rokok. Senyawa NNK dan NNN yang telah
teraktivasi dalam tubuh dikategorikan ke dalam kelompok nomor 1 agen
karsinogenik (WHO, 2014). Kelompok nomor 1 menunjukkan bahwa senyawa
NNK dan NNN yang telah teraktivasi merupakan senyawa karsinogenik untuk
manusia. Salah satu enzim pengaktivasi NNN, NNK, dan NNAL yaitu enzim
sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) (Tanner and Tyndale, 2017).
CYP2A6 merupakan gen yang mengkode enzim super famili sitokrom
P450. Enzim CYP2A6 diketahui berperan dalam proses metabolisme senyawa obat
seperti asam valproat, isoniazid, dan lain-lain (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).
Selain itu enzim ini juga berperan dalam metabolisme senyawa yang berkaitan
dengan tembakau, seperti nikotin, kotinin, dan senyawa prokarsinogenik nitrosamin
(Mwenifumbo et al., 2010).
Gen CYP2A6 telah ditemukan sebanyak 80 variasi alel, yang kemudian
berpengaruh pada ekspresi gen dan aktivitas enzim tersebut (Patramurti dan Fenty,
2017; Pharmvar, 2018). CYP2A6*4 adalah salah satu bentuk polimorfi yang paling
penting dari CYP2A6 yang terjadi akibat adanya delesi gen yang akan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
memperlambat metabolisme individu (slow metabolism) terhadap beberapa
senyawa seperti nikotin, NNN, NNK dan NNAL (Akrodou, 2015; Johansson and
Ingelman-Sundberg, 2011; Park et al., 2015; Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012;
Tanner and Tyndale, 2017; Wang et al., 2013). Slow metabolizer adalah orang yang
memiliki aktivitas metabolisme enzim yang lebih lambat hingga 50% dari aktivitas
metabolisme normal, sehingga adanya CYP2A6*4 ini dapat menurunkan aktivitas
enzim atau bahkan tidak memiliki aktivitas enzim sama sekali (Liu et al., 2011;
Tanner and Tyndale, 2017). Penurunan aktivitas enzim CYP2A6*4 akan
menurunkan aktivasi nitrosamin sehingga dapat menurunkan risiko kanker akibat
nitrosamin (He and Feng, 2015; Liu et al., 2013; Tsukino et al., 2002; Wang et al.,
2013).
Variasi ras memiliki pengaruh terhadap polimorfi CYP2A6 (Wassenaar et
al., 2015). Bentuk polimorfi alel gen CYPA2A6*4 ditemukan pada ras Negroid (ras
kulit hitam) di Afrika dengan frekuensi 0,5 - 2,7% (Liu et al., 2014; López-Flores
et al., 2017; Minematsu et al., 2006; Nakajima et al., 2006; Tanner and Tyndale,
2017; Wassenaar et al., 2015; Yusof and Gan, 2009). Ras Negroid juga terdapat di
Indonesia yaitu di daerah Papua. Keberadaan bentuk polimorfi CYP2A6*4 pada
orang ras kulit hitam Afrikan menunjukkan kemungkinan ditemukannya gen
CYP2A6*4 pada orang ras kulit hitam Papua karena keduanya merupakan ras
Negroid. Kelompok yang memiliki kesamaan ras dapat memiliki kesamaan pola
genetik. Maka pada penelitian ini digunakan subjek uji yaitu orang nonperokok ras
kulit hitam Papua untuk identifikasi keberadaan alel CYP2A6*4. Keberadaan
CYP2A6*4 dapat memprediksikan aktivitas metabolisme senyawa prokarsinogenik
nitrosamin dan risiko kanker pada nonperokok ras kulit hitam Papua.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan dan frekuensi
alel gen CYP2A6*4 pada orang nonperokok dengan ras kulit hitam Papua Indonesia
dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah
teknik memperbanyak DNA dari sejumlah kecil bahan awal asam nukleat. Metode
PCR dilakukan dengan mengadaptasi proses replikasi dalam sel hidup. PCR
memfasilitasi sintesis DNA in vitro dengan cara jauh lebih sederhana,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
menggunakan bahan dengan jumlah jauh lebih kecil, dan kondisi reaksinya
melibatkan suhu yang relatif tinggi (Verkuil et al, 2008).
Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan
mengenai alel gen CYP2A6*4 pada subjek nonperokok dengan ras kulit hitam
Papua di Indonesia. Lebih daripada itu, hal ini dapat menjadi dasar kontribusi pada
bidang kesehatan dalam usaha preventif merokok di tempat umum dapat
membahayakan individu walaupun bukan perokok karena kandungan karsinogenik
dalam asap rokoknya.
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah sampel darah non perokok ras kulit hitam
Papua. Primer forward: 5' CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3', primer
reverse: 5' CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3' diadopsi dari Patramurti
et al (2019), kit isolasi DNA (FavorPrep Genomic DNA Mini Kit) yang terdiri dari
Proteinase-K, FABG buffer, etanol, W1 buffer, Wash buffer, dan elution buffer,
Promega Go Taq Green Master Mix (berisi taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2,
dan buffer), Tris-Borat-EDTA (TBE) Buffer (10x) (Vivantis), gel agarose
(Vivantis), FluoroVueTM Nucleic Acid Gel Stain (10.000x) SMOBiO, 1 KB (0,25-
10 kb) DNA Ladder (SMOBiO), loading dye (bromofenol biru 25 mg, gliserol 3,3
mL, water for injection (6,7 mL), etanol absolut (Sigma Chemical Co., St. Louis),
akuabides steril (Ikapharmindo).
Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah Thermal cycler (Perkin Elmer 2400), satu set
elektroforesis horizontal (Sigma Aldrich), UV Transiluminator (Fisher Scientific),
mikrotube (1,5 mL) (Biologix), hot plate (CimaricTM Thermo Scintific),
mikrosentrifus (Fisher Scientific), mikropipet (Soccorex Swiss), vorteks (Fisher
Scientific), magnetic stirrer, spuit injeksi 3 mL (Terumo), vacutainer K2 yang
mengandung EDTA-NA2, tabung PCR (Axygen), neraca analitik digital dengan
ketelitian 0,0001 g (Mattler Toledo), kamera mirrorless Fujifilm XA3 dan alat-alat
gelas.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Kriteria Subjek Uji
Subjek uji yang digunakan dalam penilitian ini adalah subjek uji yang
telah diwawancarai dan telah mengisi kuisioner dengan kriteria yaitu orang dengan
ras kulit hitam Papua nonperokok sebanyak 30 orang, keturunan ras kulit hitam
Papua asli minimal sampai third degree relativies (kakek dan nenek orang dengan
ras Papua asli) dan tinggal di Yogyakarta, dan merupakan perokok pasif yang jarang
maupun sering menghirup asap rokok orang lain. Subjek uji merupakan orang
dewasa dengan jenis kelamin laki-laki atau perempuan. Penelitian ini
mengeliminasi subjek yang memiliki riwayat merokok kurang dari 5 tahun dan
subjek yang sedang terinfeksi virus atau bakteri. Subjek uji sehat jasmani dan rohani
serta dengan sadar bersedia menandatangani lembar pernyataan persetujuan
responden. Penelitian yang dilakukan di Laboratorium Biokimia Universitas Sanata
Dharma ini telah memperoleh surat keterangan layak etik yang telah disetujui oleh
Komisi Etik Penelitian Kesehatan Universitas Kristen Duta Wacana Yogyakarta.
Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji
Pengambilan sampel darah dilakukan oleh petugas profesional perawat.
Sampel darah diambil dari pembuluh vena subjek uji dan ditampung dalam
vacutainer K2 yang mengandung EDTA-NA2. Sampel darah yang telah ditampung
segera disimpan pada suhu ± 4°C. Darah tersebut akan digunakan untuk identifikasi
alel CYP2A6*4.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan menggunakan FavorPrep
Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell). Sebanyak 200 µL sampel darah
(whole blood) disiapkan dan dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge 1,5 mL.
Kemudian sampel darah tersebut ditambahkan 20 μL Proteinase-K dan 200 μL
FABG buffer dan divorteks. Campuran diinkubasi pada suhu 60ºC selama 15 menit
untuk melisiskan sampel. Selama inkubasi, masing-masing sampel dihomogenkan
dengan menggunakan vorteks setiap 3-5 menit. Selanjutnya sentrifugasi dilakukan
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik untuk menghilangkan sampel yang
menempel pada dinding tabung. Kemudian 200 μL etanol absolut ditambahkan ke
dalam sampel dan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks selama 30 detik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik.
Kolom FABG dipasangkan dengan collection tube dan pindahkan campuran sampel
dengan hati-hati ke dalam Kolom FABG. Sentrifugasi dilakukan selama 1,5 menit
pada kecepatan 13.000 rpm dan collection tube tersebut dibuang. GD column
dipasangkan dengan collection tube baru. Kemudian kolom FABG dicuci dengan
500 μL W1 buffer dan disentrifuge pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 detik dan
cairan yang ada pada collection tube dibuang. Collection tube tersebut dipasangkan
kembali dengan GD column. Kemudian ditambahkan 750 μL Wash Buffer ke kolom
FABG. Kemudian sentrifugasi dilakukan selama 1,5 detik dengan kecepatan 13.000
rpm dan cairan yang ada pada collection tube dibuang. Kemudian sentrifugasi
dilakukan kembali selama 4 menit dengan kecepatan 13.000 rpm untuk
mengeringkan Kolom FABG. Kolom FABG kemudian dipasangkan ke 1,5 ml
tabung elusi, dan ditambahkan 200 μL Elution Buffer ke tengah membran Kolom
FABG. Kolom FABG didiamkan dengan posisi tegak selama 3 menit agar Elution
Buffer dapat terserap membran kolom GD. Kemudian sentifugasi dilakukan
kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit untuk mengelusi DNA. DNA
hasil isolasi disimpan pada suhu -20ºC.
Penyiapan Gel Agarose
Pada penelitian ini digunakan dua konsentrasi gel agarose yaitu 1,0% dan
1,5%. Gel agarose konsentrasi 1,0% digunakan untuk mengidentifikasi kemurnian
isolat DNA, sedangkan gel agarose konsentrasi 1,5% digunakan untuk
mengidentifikasi hasil PCR. Gel agarose 1,5% dibuat dengan cara menimbang
0,375 g agarose, kemudian gel agarose dilarutkan dalam larutan TBE 1X sebanyak
25 mL. Larutan tersebut kemudian dipanaskan diatas hot plate sambil diaduk
dengan magnetic stirrer hingga larut. Larutan gel agarose ditambahkan 2,5 µL
larutan FluoroVueTM Nucleic Acid Gel Stain dan diaduk hingga homogen. Larutan
yang telah homogen dan sudah tidak terlalu panas dituang ke dalam cetakan gel
yang telah diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut
setelah gel mengeras sehingga terbentuk beberapa sumuran.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Isolat DNA sebanyak 4,0 µL diletakkan di atas plat tetes, kemudian
ditambahkan aquabidest sebanyak 1,0 µL dan dicampur dengan loading dye
sebanyak 1,0 µL. Campuran tersebut diambil sejumlah 6,0 µL dan dimasukkan ke
dalam sumuran-sumuran gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan
1 Kb DNA ladder sebanyak 3,0 µL sebagai marker. Gel agarose 1,0% ditempatkan
ke dalam gel tray yang sudah berisi larutan buffer 1x TBE, dilakukan elektroforesis
dengan tegangan 100 volt dan running selama 30 menit. Molekul DNA pada gel
tray akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Hasil
elektroforesis dideteksi di bawah UV transiluminator dan didokumentasikan
menggunakan kamera mirrorless Fujifilm XA3. Panjang pita DNA dapat diketahui
dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi
pita DNA ladder (Patramurti dan Fenty, 2017).
Amplifikasi Alel CYP2A6*4
Fragmen DNA dari alel CYP2A6*4 dilakukan amplifikasi dengan
menggunakan primer forward: 5' CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3' dan
primer reverse: 5' CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3' diadopsi dari
Patramurti et al (2019). Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Promega Go
Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA polimerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer)
dengan volume ahkir campuran 25,0 µL, yang terdiri dari Promega Go Taq Green
Master Mix 12,50 µL primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL isolat DNA
5,0 µL, dan ditambahkan dengan nuclease-freewater 5 µL. Amplifikasi dilakukan
dengan mesin PCR (Thermal cycler parkin elmer 2400). Kondisi PCR yaitu
denaturasi awal pada suhu 95°C selama 5 menit dan dilanjutkan dengan denaturasi
pada 98°C selama 20 detik, serta annealing pada suhu 62,6°C selama 15 detik dan
ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik. Siklus amplifikasi tersebut diulangi
sebanyak 35 kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C
selama 5 menit (Patramurti et al, 2019)
Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis
Pada analisis produk PCR digunakan fase diam gel agarose 1,5% yang
telah ditambah FluoroVueTM Nucleic Acid Gel Stain. Gel agarose yang telah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
mengeras diletakkan dalam gel tray yang berisi TBE 1X hingga permukaan gel
agarose terendam. Produk PCR sebanyak 5 µL dicampur dengan loading dye
sebanyak 1,0 µL. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 6 µL dengan
menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam sumuran agarose 1,5%. Satu
sumuran gel diisi dengan DNA ladder 3,0 µL. Dilanjutkan dengan elektroforesis
pada tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Hasil elektroforesis
kemudian dievaluasi dengan lampu UV Trasilluminator (Patramurti dan Fenty,
2017).
Tata Cara Analisis Hasil
1. Adanya alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dapat dideteksi dengan menggunakan
metode elektroforesis. Adanya produk yang terbentuk dengan panjang pita 350
bp maka menunjukkan alel CYP2A6*1, namun jika tidak terbentuk produk
maka menunjukkan adanya alel CYP2A6*4.
2. Mengetahui frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dengan rumus:
Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗1
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙𝑢𝑟𝑢ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙(30) × 100%
Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗4
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙𝑢𝑟𝑢ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙(30) × 100%
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gen CYP2A6 telah diketahui memiliki banyak polimorfi. Salah satu
bentuk polimorfinya yaitu CYP2A6*4 telah diteliti pada penelitian ini dengan
subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua. Penelitian alel CYP2A6*4 ini
dilakukan dalam empat tahapan utama, yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA dari
sampel darah, analisis kualitatif isolat DNA, dan analisis produk Polymerase Chain
Reaction (PCR) dengan teknik elektroforesis. Metode utama dalam penelitian ini
yaitu PCR untuk mengamplifikasi potongan sekuen DNA target sehingga dapat
diidentifikasi polimorfi gen yang dimiliki individu atau suatu populasi. Metode
PCR diaplikasikan dalam penelitian ini untuk mengidentifikasi alel gen CYP2A6*4
pada subjek uji non perokok ras kulit hitam Papua Indonesia. Identifikasi alel ini
dilakukan pada subjek ras kulit hitam Papua karena polimorfi alel gen
CYPA2A6*4 telah ditemukan pada ras Negroid (ras kulit hitam) di Afrika dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
frekuensi 0,5 - 2,7% (Liu et al., 2014; López-Flores et al., 2017; Minematsu et al.,
2006; Nakajima et al., 2006; Tanner and Tyndale, 2017; Wassenaar et al., 2015;
Yusof and Gan, 2009).
Karakteristik Subjek Uji
Subjek uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah orang dengan ras
kulit hitam Papua nonperokok sebanyak 30 orang. Jumlah subjek uji yang
digunakan telah memenuhi jumlah minimal yang diperlukan untuk penelitian
polimorfisme gen menurut B-Rao (2001) yang dihitung dengan taraf kepercayaan
95% yang perhitungannya telah terlampir (lampiran 11). Subjek uji merupakan
orang dewasa dengan jenis kelamin laki-laki atau perempuan. Subjek uji dewasa
dalam hal ini adalah mampu mengerti penjelasan peneliti, memahami manfaat
mengikuti penelitian, dan secara sadar menandatangani inform consent. Subjek uji
merupakan perokok pasif yang jarang maupun sering menghirup asap rokok orang
lain, hal ini dikaitkan dengan banyaknya kematian perokok pasif akibat terpapar
asap rokok karena dalam asap rokok terkandung banyak senyawa karsinogenik
yang kemudian dimetabolisme oleh tubuh sehingga memicu kanker. Mengeliminasi
subjek yang memiliki riwayat merokok kurang dari 5 tahun karena menurut
penelitian (Beane et al., 2007) merokok dapat menyebabkan perubahan gen pada
yang reversibel maupun ireversibel dan waktu yang dibutuhkan untuk
menormalkan kembali gen tersebut yaitu minimal 5 tahun. Eliminasi juga dilakukan
pada subjek yang sedang terinfeksi virus atau bakteri. Hal tersebut dilakukan karena
DNA diisolasi dari sampel darah, jika dalam darah subjek terdapat bakteri atau virus
maka dikhawatirkan DNA bakteri dan virus juga terisolasi dan membiaskan hasil
penelitian.
Isolasi DNA dari sampel darah
Isolasi DNA dari sampsel darah subjek uji dilakukan menggunakan
Genomic DNA Mini Kit (FavorPrepTM). Sampel yang digunakan yaitu whole blood
karena kandungan DNA dalam sel darah lebih banyak dibandingkan dengan sampel
lainnya sehingga akan diperoleh lebih banyak DNA dengan jumlah sampel yang
sedikit (Verkuil et al, 2008).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Tujuan dilakukannya isolasi DNA yaitu untuk memperoleh DNA murni
dengan memisahkan DNA dari komponen lainnya seperti protein, lemak dan
karbohidrat yang terdapat dalam sel sampel darah (Murtiyaningsih, 2017). Prinsip
isolasi DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (FavorPrepTM) yaitu
pelisisan sel darah dengan menggunakan Proteinase K dan FABG buffer untuk
melisiskan sel darah merah yang tidak mengandung DNA agar dapat dipisahkan
dengan sel darah putih dan melisiskan sel darah putih untuk mengeluarkan DNA
yang terdapat dalam nukleus (Siswanto et al, 2016). Proses pelisisan sel ini juga
dibantu dengan peningkatan suhu hingga 60OC melalui inkubasi untuk mendukung
degradasi protein pada sel. Etanol absolut kemudian ditambahkan bertujuan agar
DNA mengalami dehidrasi sehingga DNA akan terpresipitasi. Lalu W1 buffer dan
wash buffer ditambahkan untuk membersihkan DNA dari sisa etanol dan senyawa
lainnya. Kemudian DNA dielusi dan dilarutkan dengan menggunakan elution
buffer. Isolat DNA tersebut kemudian disimpan pada suhu sekitar -20OC di dalam
freezer untuk mencegah kerusakan DNA akibat degradasi kimia dan enzimatik.
Kemurnian DNA dapat diidentifikasi dengan menggunakan metode elektroforesis.
Analisis kualitatif isolat DNA
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis
Keterangan: M : DNA ladder
1-5 : isolat DNA dengan pita tebal dan tunggal
Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarose 1%; fase gerak larutan TBE 1x; tegangan 100 V, running time 30 menit; volume injeksi 6 μL
3000 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Isolat DNA yang akan dianalisis kemurniannya yaitu isolat DNA yang
diperoleh dari sampel darah subjek nonperokok ras kulit hitam Papua. Analisis
kualitatif isolat DNA ini dilakukan dengan menggunakan teknik elektroforesis dan
hasilnya dilihat dengan menggunakan lampu UV transiluminator. Parameter
kemurnian isolat DNA yang dimiliki yaitu jika terbentuknya pita tunggal dan tebal
dengan ukuran lebih dari 3000 bp maka isolat DNA dikatakan murni, tidak rusak
maupun terkontaminasi. Namun jika hasil elektroforesis menunjukkan pita yang
tidak tunggal atau pita terdapat pada ukuran lebih kecil dari 3000 bp maka isolat
DNA dinyatakan tidak murni karena telah rusak maupun telah terkontaminasi.
Isolat DNA yang dihasilkan pada penelitian ini dapat dinyatakan murni karena
membentuk pita tunggal dan berukuran lebih besar dari 3000 bp (Gambar 1).
Analisis produk PCR dengan Teknik Elektroforesis
Isolat DNA yang diperoleh diamplifikasi dengan menggunakan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan primer yang spesifik untuk mendeteksi alel
CYP2A6*4. Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam PCR antara lain templat DNA,
primer, deoksinukleotida trifosfat (dNTPs), enzim DNA polimerase, MgCl2 dan
buffer. Templat DNA merupakan isolat DNA dari sampel darah orang ras kulit
hitam Papua yang akan diamplifikasi. Primer yang merupakan suatu untai DNA
pendek (18 – 28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai
DNA dengan cara menempel pada sekuen yang komplementer pada templat DNA.
Deoksinukleotida trifosfat (dNTPs) yang terdiri atas deoksiadenosin trifosfat
(dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), deoksisitidin trifosfat (dCTP), dan
deoksiguanosin trifosfat (dGTP) yang akan bertindak sebagai bahan penyusun
DNA dalam proses ekstensi. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’
dari primer dan membentuk susunan DNA baru komplementer dengan untai
Templat DNA. Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis
reaksi sintesis rantai DNA dan akan membantu melepaskan ikatan primer yang
tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder. Dalam
proses PCR juga diperlukan buffer yang berfungsi untuk mempertahankan pH
sehingga dapat mempertahankan stabilitas enzim DNA polimerase. Ion Mg2+ yang
diperoleh dari MgCl2 berfungsi untuk meningkatkan kelarutan dNTP dengan cara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
membentuk kompleks dengan dNTP, meningkatkan aktivitas enzim DNA
polimerase serta meningkatkan nilai Tm (melting temperature) dari untai ganda
templat DNA maupun interaksi antara primer dengan templat (Asy’ari et al, 2005;
Somma and Querci, 2006; Yusuf, 2010)
Pada proses PCR terdapat tiga fase utama yaitu denaturasi, annealing, dan
ekstensi. Denaturasi Templat DNA dilakukan untuk memisahkan untai ganda DNA
menjadi untai tunggal. Pemisahan untai DNA tersebut memungkinkan hibridisasi
primer PCR dengan sekuen DNA target. Pada tahap denaturasi digunakan suhu
sebesar 95°C berguna untuk memutuskan interaksi hidrogen pada basa nitrogen
yang menghubungkan dua untai DNA, karena interaksi hidrogen tidak stabil pada
suhu tinggi. Proses annealing pada penelitian ini menggunakan suhu sebesar
62,6°C. Penyesuaian suhu dilakukan agar primer dapat secara spesifik mengikat
DNA target dan tidak akan terlepas setelah proses annealing. Primer akan
menempel dengan berinteraksi hidrogen pada cetakan nukleotida DNA yang sesuai.
Tahap ekstensi merupakan tahap sintesis DNA. Tahap ini diperlukan untuk
memperpanjang primer PCR ujung 5’ menuju 3’ dari urutan DNA target (Verkuil,
2008). Pada penelitian ini digunakan suhu ekstensiyaitu sebesar 72 °C. Ketiga
tahapan tersebut diulangi kembali hingga 35 kali siklus agar hasil amplifikasi DNA
yang diperoleh cukup untuk dideteksi dengan teknik elektroforesis.
Situs penempelan primer pada DNA ditunjukkan pada gambar 2. Melalui
gambar tersebut dapat dijelaskan bahwa primer forward (panah merah) akan
menempel pada templat DNA 3’ ke 5’ sehingga nantinya akan terbentuk produk
PCR berupa sekuen DNA 5’-3’ yang merupakan salinan dari Templat DNA.
Sedangkan primer reverse (panah biru) akan menempel pada Templat DNA 5’ ke
3’ sehingga nantinya akan terbentuk produk PCR berupa sekuen DNA 3’-5’ yang
merupakan salinan dari Templat DNA. Ketika kedua sekuen produk PCR tersebut
terbentuk maka terbentuklah produk PCR berupa potongan DNA untai ganda
berukuran 350 bp.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen nukleotida CYP2A6*1 Keterangan:
: arah penempelan primer forward
: arah penempelan primer reverse
Primer memegang peranan penting dalam menentukan keberhasilan proses
PCR. Suatu primer dikatakan baik jika primer tersebut spesifik, yaitu hanya dapat
menempel pada satu jenis alel DNA saja sehingga didapatkan produk yang sesuai
dengan target. Primer yang digunakan pada penelitian ini akan menghasilkan
produk PCR dengan alel CYP2A6*1 dengan ukuran 350 bp. Primer yang digunakan
akan spesifik mengamplifikasi alel CYP2A6*1 dari nukleotida urutan 10643 hingga
10993. Gen CYP2A6*4 memiliki banyak perbedaan dengan gen CYP2A6*1 seperti
yang ditunjukkan pada gambar 3. CYP2A6*4 mengalami whole gene deletion
akibat adanya unequal crossover junction. Unequal crossover junction
menyebabkan susunan nukleotida gen CYP2A6 alel *4 berbeda dengan alel *1
(normal). Hal ini menyebabkan tidak terekspresinya mRNA yang mengkode
CYP2A6, melainkan mengkode mRNA yang nantinya akan membentuk protein
yang berbeda sehingga tidak memiliki aktivitas enzim CYP2A6 (Fukami et al,
2007). Nukleotida urutan 10643 hingga 10993 dari kedua alel tersebut telah
ditemukan 6 perbedaan nukleotida. Adanya perbedaan nukleotida urutan ke-10993
(bertanda kuning) yaitu pada CYP2A6*1 adalah G sedangkan pada CYP2A6*4
mengkode A, sehingga menyebabkan primer reverse tidak dapat menempel pada
gen CYP2A6*4. Jika primer reverse tidak dapat menempel (annealing) pada
Templat DNA maka tidak akan terjadi amplifikasi pada proses PCR dan tidak akan
terbentuk produk.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
CYP2A6*1 :CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGT
CYP2A6*4 :CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGT
CYP2A6*1 :GTTCCCTATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCT
CYP2A6*4 :GTTCCCTATGCTGGGCTCCGTGCTGAGAGACCCCAGCTTCTTCT
CYP2A6*1 :CCAACCCCCAGGACTTCAATCCCAGCACTTCCTGAATGAGAAGG
CYP2A6*4 :CCAACCCTCAGGACTTCAATCCCAGCATTTCCTGAATGAGAAGG
CYP2A6*1 :GGCAGTTTAAGAAGAGTGATGCTTTTGTCCCTTTTCCATCGGTA
CYP2A6*4 :GGCAGTTTAAGAAGAGTGATGCTTTTGTCCCTTTTCCATCGGTA
CYP2A6*1 :AGACCACTGTTTGGCTGCCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGGG
CYP2A6*4 :AGACCACTGTTTGGCTGCCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGCG
CYP2A6*1 :CCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGCGGTGTAGCCTGGTATTT
CYP2A6*4 :CCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGCGGTGTAGCCTGGTATTT
CYP2A6*1 :CTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCCTTGAGCCAGCA
CYP2A6*4 :CTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCCTTGAGCCAGCA
CYP2A6*1 :GCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCG
CYP2A6*4 :GCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCA
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*4
Produk hasil PCR kemudian dianalisis dengan menggunakan teknik
elektroforesis. Proses elektroforesis pada analisis produk PCR digunakan gel
agarose dengan konsentrasi 1,5%. Karena prinsip pemisahan teknik elektroforesis
dengan gel agarose yaitu berdasarkan bobot molekul dan ukuran sekuen DNA yang
dihasilkan setelah PCR lebih kecil (350 bp), maka pori-pori fase diam (gel agarose)
harus diperkecil dengan cara meningkatkan konsentrasi gel agarose agar diperoleh
pemisahan yang lebih baik pada produk PCR. Produk PCR dicampurkan dengan
loading dye sebelum dimasukkan dalam sumuran gel agarose. Loading dye berguna
sebagai penambah densitas suspensi produk PCR sehingga suspensi tetap berada
dalam sumuran dan sebagai penanda migrasi DNA (Novitasari et al., 2014). Proses
elektroforesis dilakukan dengan menggunakan fase gerak buffer TBE 1X dengan
tegangan 100 volt selama 30 menit (Patramurti dan Fenty, 2017). Hasil
elektroforesis produk PCR kemudian dilihat hasilnya dengan menggunakan UV
Transiluminator untuk memvisualisasikan posisi pita yang terbentuk setelah
pemisahan DNA pada gel (gambar 4).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum Keterangan :
M : DNA Ladder
1 dan 3-6 : Produk PCR dari isolat DNA dengan alel CYP2A6*1 (wild type) 2 dan 7 : Produk PCR dari isolat DNA dengan alel CYP2A6*4 (polimorfi delesi)
Kondisi elektroforesis: Fase diam gel agarose 1,5%; fase gerak larutan TBE 1x; tegangan
100 V, running time 30 menit; volume injeksi 6 μL
Hasil yang diperoleh setelah visualisasi dengan UV transiluminator dapat
memberikan dua kesimpulan hasil, yaitu jika terbentuk pita tebal pada panjang basa
nukleuotida 350 bp maka menunjukkan sampel memiliki alel CYP2A6*1,
sedangkan jika tidak terbentuk pita menunjukkan sampel memiliki alel CYP2A6*4.
Hasil elektroforesis yang dilakukan dengan media gel agarose tersebut diperoleh
pita yang tebal dan tunggal dengan ukuran 350 bp. Namun pada gel terlihat pita
tipis dengan ukuran
15
menunjukkan bahwa sebanyak 10 isolat DNA pada produk PCR memiliki alel
CYP2A6*4 dengan frekuensi 33,33% dan 20 isolat DNA lainnya memiliki tipe alel
normal atau wild type yaitu CYP2A6*1 dengan frekuensi 66,67%. Polimorfi
CYP2A6*4 dengan frekuensi 33,33% termasuk jumlah yang tinggi jika
dibandingkan penelitian Elisa (2018) pada individu perokok ras kulit hitam Papua
yaitu diperoleh frekuensi CYP2A6*4 sebanyak 26,6%. Selain itu, hasil penelitian
ini juga lebih tinggi dibandingkan beberapa penelitian sebelumnya pada ras
Negroid di Afrika yang hanya berkisar 0,5-2,7% (Liu et al., 2014; López-Flores et
al., 2017; Minematsu et al., 2006; Nakajima et al., 2006; Tanner and Tyndale, 2017;
Wassenaar et al., 2015; Yusof and Gan, 2009).
Dilihat dari frekuensi alel CYP2A6*4 pada subjek uji nonperokok ras kulit
hitam Papua Indonesia yang telah diperoleh yaitu sebesar 33,33%, maka dapat
diketahui bahwa pada ras tersebut terdapat variasi alel CYP2A6*4 dan 33,33% dari
ras tersebut memiliki kemampuan metabolisme yang lambat (slow metabolism)
terhadap senyawa yang seharusnya dimetabolisme oleh enzim CYP2A6.
Rendahnya metabolisme yang dihasilkan oleh individu dengan alel CYP2A6*4
akan mempengaruhi proses metabolisme senyawa-senyawa yang seharusnya
dimetabolisme oleh enzim CYP2A6 seperti senyawa prokarsinogenik nitrosamin
dan beberapa senyawa obat.
Normalnya senyawa prokarsinogenik nitrosamin seperti NNN, NNK, dan
NNAL diaktivasi oleh CYP2A6 melalui proses α-hidoksilasi (Chiang et al., 2011;
Tanner and Tyndale, 2017). NNK diubah menjadi NNAL melalui proses reduksi
oleh enzim karbonil reduktase. NNK dan NNAL dapat menjadi agen karsinogenik
setelah dimetabolisme oleh enzim CYP2A6 melalui dua jenis jalur, yaitu α-
hidoksilasi pada gugus metil dan α-hidroksilasi pada gugus metilen. Proses
hidroksilasi yaitu adanya penambahan gugus hidroksi (-OH) pada senyawa. NNK
dan NNAL akan mengalami metabolisme α-hidoksilasi pada gugus metil atau
metilen oleh enzim CYP2A6 sehingga nantinya akan terbentuk senyawa ionik dan
menyerang DNA sebagai senyawa karsinogenik (Chiang et al., 2011; He and Feng,
2015). NNN dimetabolisme oleh CYP2A6 melalui jalur 2’- dan 5’-α-hidroksilasi.
2’-hidroksi NNN akan membuka cincin pirolidin sehingga terbentuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
pirisiloksobutildiazohidroksida sedangkan jika 5’-hidroksi NNN akan membentuk
elektrofilik diazohidroksi yang akan menyerang DNA (gambar 5) (Xue et al.,
2014).
Gambar 5. Jalur Metabolisme Senyawa Prokarsinogenik Nitrosamin (NNK, NNAL, dan
NNN) (Chiang et al., 2011; He and Feng, 2015)
Namun individu dengan alel CYP2A6*4 yang slow metabolism, tidak dapat
memetabolisme senyawa prokarsinogen nitrosamin tersebut dengan baik karena
enzim tersebut tidak aktif. Hal ini menguntungkan bagi individu yang memiliki alel
CYP2A6*4, karena NNK, NNAL, dan NNN tidak dapat diaktivasi sehingga tidak
akan terbentuk senyawa aktifnya yang dapat menyebabkan DNA adducts yang
berujung kanker.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Meskipun enzim CYP2A6 tersebut tidak aktif, senyawa prokarsinogenik
nitrosamin yang telah masuk ke dalam tubuh tetap akan dimetabolisme agar dapat
diekskresikan. Terdapat tiga cara yang dapat dilalui nitrosamine agar dapat
diekskresikan, yaitu metabolism fase I, metabolism fase II dan ekskresi dalam
bentuk utuh melalui urin. Selain enzim CYP2A6, enzim CYP2A13 juga berperan
memetabolisme senyawa ini melalui metabolisme fase I yaitu dengan jalur α-
hidroksilasi (Chiang et al., 2011; He and Feng, 2015). Sehingga senyawa
prokarsinogenik nitrosamin tetap akan dimetabolisme yaitu oleh enzim CYP2A13,
namun proses metabolismenya menjadi lebih lambat dibandingkan CYP2A6
normal. Metabolism fase II senyawa nitrosamine yaitu melalui proses glukoronidasi
oleh enzim glukoronidase karena nitrosamin sudah cukup polar (Richie et al.,
1997). Sehingga dapat dipastikan bahwa senyawa prokarsinogenik nitrosamin tidak
akan terakumulasi dalam tubuh, namun tetap dimetabolisme meskipun dengan
proses yang lebih lambat.
Keberadaan CYP2A6*4 pada ras kulit hitam Papua ini dengan frekuensi
33,33% memprediksikan bahwa risiko kanker terkait nitrosamin pada ras ini
rendah. Namun dengan diperolehnya hasil penelitian ini perokok pasif harus tetap
menghindari paparan asap rokok, karena polimorfi gen CYP2A6 ini hanya salah
satu aspek prediksi risiko kanker akibat nitrosamin yang perlu diketahui, sementara
masih ada faktor lain yang dapat menjadi faktor risiko terjadinya kanker.
Hasil dari penelitian ini juga dapat digunakan sebagai dasar dalam
penentuan terapi yang akan diperoleh pasien (individual therapy). Selain
bertanggung jawab dalam metabolisme senyawa prokarsinogenik nitrosamin,
enzim CYP2A6 juga bertanggung jawab dalam metabolisme senyawa-senyawa
obat seperti asam valproat, isoniazid, halothane, dan lain-lain (Raunio and
Rahnasto-Rilla, 2012). Ketika individu telah diketahui memiliki alel CYP2A6*4
dan memperoleh terapi obat-obatan yang dimetabolisme oleh enzim CYP2A6 maka
dosis yang diterima pasien harus disesuaikan. Enzim CYP2A6*4 bersifat slow
metabolism sehingga jika dosis obat-obatan tersebut tidak disesuaikan dengan
penurunan dosis maka dikhawatirkan senyawa obat akan lebih lama dimetabolisme
dan diekskresikan. Jika proses metabolisme lama, maka konsentrasi senyawa obat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
tersebut akan lebih tinggi dan lebih lama berada di dalam tubuh sehingga berpotensi
terakumulasi. Hal tersebut dapat menyebabkan efek toksik yang merugikan
individu dengan enzim CYP2A6*4 yang memperoleh terapi tersebut (Tan et al,
2010; McDonagh et al, 2012). Berdasarkan penelitian Tan et al (2010) individu
dengan CYP2A6*4 yang mengonsumsi asam valproat memiliki konsentrasi asam
valproate dalam plasma darah tinggi dibandingkan individu dengan gen CYP2A6*1
(normal). Hal tersebut terjadi akibat penurunan aktivitas metabolisme enzim
CYP2A6. Tingginya konsentrasi asam valproate dalam plasma dapat
mengakibatkan peningkatan paparan obat, peningkatan standar konsentrasi steady
state asam valproat dan risiko ketoksikan. Maka adanya informasi mengenai
polimorfi CYP2A6 sangat bermanfaat dalam pemilihan terapi individu yang lebih
sesuai karena antar individu memiliki genetik yang bervariasi.
KESIMPULAN
Alel gen CYP2A6*4 ditemukan pada orang nonperokok ras kulit hitam
Papua Indonesia dengan frekuensi 33,33%. Hal ini mengartikan bahwa pada
populasi tersebut sebanyak 33,33% individu memiliki aktivitas metabolisme
senyawa prokarsinogenik nitrosamin lebih lambat sehingga risiko kanker terkait
nitrosamin pada populasi ini rendah.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian mengenai alel gen CYP2A6*4 pada ras lain dan
dikaitkan langsung dengan kejadian kanker.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
DAFTAR PUSTAKA
Akrodou, Y.M., 2015. CYP2A6 Polymorphisms May Strengthen Individualized
Treatment for Nicotine Dependence. Scientifica, 2015, 1–7.
Asy’ari, M., Noer, A.S., 2005. Optimasi Konsentrasi Mgcl2 Dan Suhu Annealing
Pada Proses Amplifikasi Multifragmens Mtdna Dengan Metoda PCR, J. Kim.
Sains & Apl. Vol. VIII. No.1.
B-Rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.
Human Heredity, 52(4), 191–200.
Beane, J., Sebastiani, P., Liu, G., Brody, J.S., Lenburg, M.E., Spira, A., 2007.
Reversible and permanent effects of tobacco smoke exposure on airway
epithelial gene expression. Genome Biology, 8(9), 1-17.
Bio-Rad, 2019. PCR Troubleshooting. https://www.bio-rad.com/en-
id/applications-technologies/pcr-troubleshooting?ID=LUSO3HC4S#helptop
diakses pada tanggal 9 Januari 2020.
Chiang, H. chih, Wang, C.Y., Lee, H.L., Tsou, T.C., 2011. Metabolic effects of
CYP2A6 and CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone
(NNK)-induced gene mutation-A mammalian cell-based mutagenesis
approach. Toxicology and Applied Pharmacology, 253(2), 145–152.
Tatsuki Fukami, T., Nakajima, M., Yamanaka, H., Fukushima, Y., Mcleod, H.L.,
Yokoi, T., 2007. A Novel Duplication Type of CYP2A6 Gene in African-
American Population. Drug Metabolism and Disposition, Vol. 35, No. 4.
He, X., Feng, S., 2015. Role of Metabolic Enzymes P450 (CYP) on Activating
Procarcinogen and their Polymorphisms on the Risk of Cancers. Current drug
metabolism, 16(10), 850–63.
Johansson, I., Ingelman-Sundberg, M., 2011. Genetic polymorphism and
toxicology-with emphasis on cytochrome P450. Toxicological Sciences,
120(1), 1–13.
Liu, T., David, S.P., Tyndale, R.F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., He, Y.-H., Yu,
X.-Q., Chen, W., Crump, C., Wen, X.-Z., Chen, W.-Q., 2011. Associations of
CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern China. National
Institutes of Health, 5(106), 985–994.
Liu, T., Xie, C.-B., Ma, W.-J., Chen, W.-Q., 2014. Association Between CYP2A6
Genetic Polymorphisms and Lung Cancer: A Meta-Analysis of Case-Control
Studies. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis, 51(1), 229–235.
López-Flores, L.A., Pérez-Rubio, G., Falfán-Valencia, R., 2017. Distribution of
polymorphic variants of CYP2A6 and their involvement in nicotine addiction.
EXCLI Journal, 16, 174–196.
McDonagh, E. M., Wassenaar, C., David, S.P., Tyndale, R.F., Altman, R.B., Whirl-
Carrillo, M., Klein, T.E., 2012. PharmGKB summary: very important
pharmacogene information for cytochrome P-450, family 2, subfamily A,
polypeptide 6. PharmGKB summary, 22(9), 695–708.
Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno,
H., Ishizaka, A., 2006. Limitation of cigarette consumption by CYP2A6*4, *7
and *9 polymorphisms. European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.
Mwenifumbo, J.C., Zhou, Q., Benowitz, N.L., Sellers, E.M., Tyndale, R.F., 2010.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
https://www.bio-rad.com/en-id/applications-technologies/pcr-troubleshooting?ID=LUSO3HC4S#helptophttps://www.bio-rad.com/en-id/applications-technologies/pcr-troubleshooting?ID=LUSO3HC4S#helptop
20
New CYP2A6 gene deletion and conversion variants in a population of Black
African descent. Pharmacogenomics, 11(2), 189–198.
Nakajima, M., Fukami, T., Yamanaka, H., Higashi, E., Sakai, H., Yoshida, R.,
Kwon, J.T., McLeod, H.L., Yokoi, T., 2006. Comprehensive evaluation of
variability in nicotine metabolism and CYP2A6 polymorphic alleles in four
ethnic populations. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 80(3), 282–297.
NCBI, 2019. CYP2A6 cytochrome P450 family 2 subfamily A member 6 [Homo
sapiens (human)]. NCBI (Online), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1548
diakses pada tanggal 12 Maret 2019.
Novitasari, D. A., Elvyra, R., Roslim, D.I., 2014. Teknik Isolasi dan Elektroforesis
DNA Total pada Kryptopterus Apogon (Bleeker 1851) dari Sungai Kampar
Kiri dan Tapung Hilir Kabupaten Kampar Provinsi Riau. JOM FMIPA, 260.
Öberg, M., Jaakkola, M.S., Woodward, A., Peruga, A., Prüss-Ustün, A., 2011.
Worldwide burden of disease from exposure to second-hand smoke: A
retrospective analysis of data from 192 countries. The Lancet, 377(9760), 139–
146.
Park, S.L., Tiirikainen, M.I., Patel, Y.M., Wilkens, L.R., Stram, D.O., Marchand,
L. Le, Murphy, S.E., 2015. Genetic determinants of CYP2A6 activity across
racial/ ethnic groups with different risks of lung cancer and effect on their
smoking intensity. Carcinogenesis, 37(3), 269–279.
Patramurti, C., Candaya, E.J., Kiatarto, S.F., Karut, A.K., 2019. Polimorfi Gen
Sitokrom P450 2A6 Alel *1, *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Perokok Suku
Tionghoa Indonesia. Jurnal Farmasi Indonesia, 11(1), 347-445.
Patramurti, C., Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel CYP2A6*4
dan CYP2A6*9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa Indonesia. Jurnal Ilmu
Kefarmasian Indonesia, 15(1), 50-56.
Raunio, H., Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, structure, regulation,
and function. Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73–88.
Siswanto, J.E., Berlian, T., Putricahya, E., Panggalo, L.V., Yuniani, L., 2016.
Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi Penderita
ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks Kemurnian. Sari Pediatri,
Vol. 18, No. 4.
Somma, M., Querci, M., 2006, The Analysis of Food Samples for the Presence of
Genetically Modified Organisms Session 6 The Polymerase Chain Reaction
(PCR), JRC European Comission, 229.
Southeast Asia Tobacco Control Alliance, 2016. The Tobacco Control Atlas:
ASEAN Region.
Tan, L., Yu, J.T., Sun, Y.P., Ou, J.R., Song, J.H., Yu, Y., 2010. The influence of
cytochrome oxidase CYP2A6, CYP2B6, and CYP2C9 polymorphisms on the
plasma concentrations of valproic acid in epileptic patients. Clinical
Neurology and Neurosurgery, 112(4), 320–323.
Tanner, J.A., Tyndale, R.F., 2017. Variation in CYP2A6 activity and personalized
medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(4), 1–29.
Tsukino, H., Kuroda, Y., Qiu, D., Nakao, H., Imai, H., Katoh, T., 2002. Effects of
cytochrome P450 (CYP) 2A6 gene deletion and CYP2E1 genotypes on gastric
adenocarcinoma. International Journal of Cancer, 100(4), 425–428.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1548
21
Verkuil, E., Belkum, A., and Hays, J., 2008. Principle and Techinal Aspects of PCR
Amplification.
Wang, L., Zang, W., Liu, J., Xie, D., Ji, W., Pan, Y., Li, Z., Shen, J., Shi, Y., 2013.
Association of CYP2A6*4 with Susceptibility of Lung Cancer: A Meta-
Analysis. PLoS ONE, 8(4), 4–8.
Wassenaar, C.A., Ye, Y., Cai, Q., Aldrich, M.C., Knight, J., Spitz, M.R., Wu, X.,
Blot, W.J., Tyndale, R.F., 2015. CYP2A6 reduced activity gene variants
confer reduction in lung cancer risk in African American smokers--findings
from two independent populations. Carcinogenesis, 36(1), 99–103.
WHO, 2014. Agents Classified by the IARC Monographs , Volumes 1 – 109. World
Health Organization - International Agency for Research on Cancer,
(026148), 34.
Xue, J., Yang, S., Seng, S., 2014. Mechanisms of cancer induction by tobacco-
specific NNK and NNN. Cancers, 6(2), 1138–1156.
Yalcin, E., de la Monte, S., 2016. Tobacco nitrosamines as culprits in disease:
mechanisms reviewed. Journal of Physiology and Biochemistry, 72(1), 107–
120.
Yusof, W., Gan, S.H., 2009. High prevalence of CYP2A6*4 and CYP2A6*9 alleles
detected among a Malaysian population. Clinica Chimica Acta, 403(1–2),
105–109.
Yusuf, Z., 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek, 5(6), 1–5.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 3. Informasi Pemakasian Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 4. Lembar Informasi Produk DNA Ladder & Markers
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 5. Hasil PCR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 6. Hasil Penelitian
No subjek CYP2A6
*1 *4
1P - √
2P - √
3P - √
4P - √
5P √ -
6P √ -
7P - √
8P √ -
9P √ -
10P √ -
11P √ -
12P √ -
13P - √
14P - √
15P √ -
16P √ -
17P √ -
18P √ -
19P √ -
20P √ -
21P √ -
22P √ -
23P - √
24P √ -
25P √ -
26P √ -
27P √ -
28P - √
29P √ -
30P - √
Total 20 10
ANALISIS HASIL:
1. Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗1
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙𝑢𝑟𝑢ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙(30) × 100%
= 20
30 × 100%
= 66,67%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
2. Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗4
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙𝑢𝑟𝑢ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙(30) × 100%
= 10
30 × 100%
= 33,33%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Lampiran 7. Informasi Pemakaian FavorPrepTM
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Lampiran 8. Hasil kuisioner
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Lampiran 9. Lembar Informasi untuk Responden
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Lampiran 10. Lembar Pernyataan Persetujuan Responden
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sampel
Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal
pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah:
Nmin ≥ log (1 – π )/2log (1 – fmin)
Keterangan:
Nmin : jumlah sampel minimal
π : probabilitas alel utama
fmin : frekuensi alel minor
Pada penelitian ini jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu:
CYP2A6*1 (alel utama) dan CYP2A6*4 (alel minor). Maka menurut B-Rao
(2001), nilai π dan fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah: π =
0,95 dan fmin = 0,05.
Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah:
Nmin = log (1 – π )/2log (1 – fmin)
= log (1-0,95/2log (1-0,05)
= 28,89
= 29 orang
Jumlah sampel yang digunakan pada penelitan ini adalah 30 orang, oleh karena itu
jumlah ini sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian genetik
polimorfisme.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Lampiran 12. Primer PCR alel CYP2A6*4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
BIOGRAFI PENULIS
Skripsi dengan judul “Identifikasi Alel Gen CYP2A6*4
pada Subjek Uji Nonperokok Ras Kulit Hitam Papua
Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction”
ditulis oleh Dewa Ayu Sri Handani, lahir di Bali, 24
November 1997 meruakan anak ketiga dari 3 bersaudara.
Anak dari pasangan Dewa Nyoman Bawana dan Gusti
Ayu Putu Suartini. Penulis menempuh pendidikan di SD
Negeri 3 Bakbakan 2004-2010, SMP Negeri 1 Gianyar
2010-2013, SMA Negeri 1 Gianyar 2013-2016, dan pada
tahun 2016 meneruskan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi USD penulis
pernah aktif dalam beberapa kegiatan kemahasiswaan dan kepanitiaan seperti
menjadi koordinator divisi Acara pada kepanitiaan Desa Mitra 1 2017 dan
Pelepasan Wisuda 1 2018, Ketua Panitia Desa Mitra 2 2017. Penulis juga pernah
berpartisipasi dalam Lomba ONMIPA Tingkat Wilayah V (Yogyakarta) dalam
bidang Kimia. Selain aktif dalam kepanitiaan, penulis juga aktif dalam Unit
Kegiatan Fakultas (UKF) yaitu UKF Patient Conseling Club (PCC) tahun 2016-
2017 dan UKF Keluarga Mahasiswa Hindu Dharma (KMHD) Universitas Sanata
Dharma tahun 2016-2019. Penulis pernah menjadi asisten dosen praktikum Kimia
Dasar 2017 dan 2018, Kimia Organik 2018, dan Biokimia 2019. Dengan motivasi
dan ketekunan untuk belajar serta pengalaman yang dimiliki, penulis dapat
menyelesaikan tugas akhir ini dan semoga penulis skripsi ini dapat menambah
pengetahuan bagi pembaca.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Recommended