Upload
truonglien
View
220
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 (CYP2A6) ALEL *9 PADA
SUBYEK UJI PEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA
SKRIPSI
Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan Oleh:
Dismas Adi Prabowo
NIM: 148114166
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 (CYP2A6) ALEL *9 PADA
SUBYEK UJI PEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Diajukan Oleh:
Dismas Adi Prabowo
NIM: 148114166
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
UJI HEPATOPROTEKTIF JANGKA PANJANG EKSTRAK METANOL
80% DAGING Hylocereus polyrhizus TERHADAP KADAR ALT DAN AST
PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR TERINDUKSI
KARBON TETRAKLORIDA
Oleh:
Monica Praditya Puji Astari
NIM : 148114047
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal: 05 Januari 2018
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
(Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D.)
Panitia Penguji: Tanda tangan
1.
drh. Sitarina Widyarini, M.P., Ph.D
……………...
2.
Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt.
……………...
3.
Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt.
……………...
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana
layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah
ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 23 November 2017
Penulis
Monica Pradiya Puji Astari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswi Universitas Sanata Dharma:
Nama : Monica Praditya Puji Astari
Nomor Mahasiswa : 148114047
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
Uji Hepatoprotektif Jangka Panjang Ekstrak Metanol 80% Daging
Hylocereus polyrhizus Terhadap Kadar ALT dan AST
pada Tikus Jantan Galur Wistar Terinduksi Karbon Tetraklorida
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam benruk pangkalan
data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya
maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencatumkan nama saya
sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 23 November 2017
Yang menyatakan
(Monica Praditya Puji Astari)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan yang Maha Esa atas
berkat, rahmat, dan penyertaan-Nya hingga penelitian dan penyusunan skripsi
dengan judul “Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) Alel *9 pada
Subyek Uji Perokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia” dapat penulis selesaikan.
Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.,
dengan judul “ Pengaruh Polimorfisme Enzim Sitokrom P450 alel *1 *4 dan *9
terhadap Kadar Gula Darah pada Subyek Uji Suku Thionghoa dan Papua
Indonesia “ berdasarkan SK: No.014b/LPPM USD/III/2017.
Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) program studi Farmasi Universitas Sanata
Dharma. Selama proses penyusunan skripsi ini penulis sadar bahwa pembuatan
skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena
itu, pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada:
1. Ibu Aris Widayanti, M.Sc., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin untuk
penggunaan segala fasilitas laboratorium selama penelitian.
4. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing atas
kesabaran, arahan, bimbingan, semangat, serta dukungannya selama proses
penelitian hingga penyusunan skripsi ini.
5. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Dosen Penguji yang telah
memberi kritik dan saran yang sangat membangun dalam penelitian ini.
6. Maywan Hariono Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberi
kritik dan saran yang sangat membangun dalam penelitian ini.
7. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik atas
bimbingannya selama ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
8. Pak Bima, Pak Kayat, Pak Bimo, Pak Heru, Pak Parlan, selaku laboran yang
telah membantu selama penelitian.
9. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
10. Keluarga tercinta Bapak Ignatius Riyanto dan Ibu Barbara Sriwahyuningsih
serta Kakak Yulius Wahyu Prabowo yang selalu memberikan semangat, doa,
dan dukungan pada penulis.
11. Rekan seperjuangan penelitian ini yakni Rabulas Tri Nugroho, Evan Julian,
Jasvidianto Chriza. Terima kasih atas semangat dan kerjasamanya selama ini.
12. Rekan satu bimbingan yakni Maria Clara, Yulius Denis, Maria Redita,
Chintya Halim, Petrus Febrian Widiantoro, dan Yohana Alpionita. Terima
kasih atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.
13. Agustina Deka Chrissanti, atas dukungan, doa, dan semangat selama kuliah
dan penelitian ini terutama sudah menemani suka dan duka selama menyusun
naskah skripsi.
14. Teman-teman FSM D 2014 dan Keluarga Besar farmasi 2014, terima kasih
atas kebahagiaan dan kebersamaan selama ini.
15. David Ginola dan burjo PH yang memberikan tempat nongkrong yang
nyaman tiada duanya.
16. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penulis yang tidak dapat
penulis tulis satu persatu.
Penulis menyadari dalam penulisan skripsi ini masih terdapat kelemahan
dan kekurangan. Oleh karena itu penulis mengharapkan adanya kritik dan saran
yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi
ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama dalam bidang ilmu Farmasi.
Yogyakarta, 9 Desember 2017
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ v
PRAKATA ....................................................................................................... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... viii
DAFTAR ISI .................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ............................................................................................ x
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xii
ABSTRACT ..................................................................................................... xiii
ABSTRAK ....................................................................................................... xiv
PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ................................................................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 7
KESIMPULAN ................................................................................................ 14
SARAN ............................................................................................................ 14
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 15
LAMPIRAN ..................................................................................................... 17
BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 29
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR TABEL
Tabel I. Karakteristik subjek uji yang terlibat dalam penelitian .................... 8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik
elektroforesis .................................................................................... 10
Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*9.. 11
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9
(mutasi Single nucleotide polymorphism (SNP) ditunjukkan oleh
warna hijau dan kuning, primer ditunjukkan oleh warna merah)..... 12
Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat
DNA... .............................................................................................. 13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat keterangan kelaiakan etik (ethical clearence) .................... 18
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ...................... 19
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ....................... 20
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder& Markers ............................ 21
Lampiran 5. Product Datasheet of primer forward and reverse CYP2A6*9... 21
Lampiran 6. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Elektroforesis
..................................................................................................... 22
Lampiran 7. Hasil PCR .................................................................................... 23
Lampiran 8. Usage Information of FavorPrepTM ............................................ 25
Lampiran 9. Data Subjek Uji hasil kuisioner ................................................... 26
Lampiran 10. Hasil Kuisioner ............................................................................ 27
Lampiran 11. Perhitungan jumlah sampel ......................................................... 30
Lampiran 12. Biografi Penulis ........................................................................... 31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
ABSTRAK
Adanya polimorfisme gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) akan
mempengaruhi aktivitas enzim terhadap metabolisme nikotin di dalam tubuh, baik
menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim yang akan
mempengaruhi seseorang dalam melakukan aktivitas merokok. Salah satu
polimorfisme dari gen CYP2A6 tersebut adalah alel CYP2A6*9. Alel CYP2A6*9
mengalami polimorfisme satu nukleotida dalam kotak TATA di daerah promoter.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi ada tidaknya alel CYP2A6*9 pada
perokok pria ras kulit hitam Papua Indonesia.
Penelitian ini dilakukan secara deskriptif observasional. Sebanyak 30
subyek uji dengan kriteria inklusi dan eksklusi diminta mengisi kuisioner tentang
aktivitas merokok lalu diambil sampel darahnya. Pada sampel darah tersebut
dilakukan isolasi DNA dan isolatnya dianalisis secara kualitatif menggunakan
elektroforesis. Replikasi alel CYP2A6*9 dilakukan dengan amplifikasi
menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
Hasil penelitian menunjukkan tidak adanya alel CYP2A6*9 pada
perokok pria ras kulit hitam di Papua, Indonesia sehingga dapat dikatakan untuk
sementara bahwa jumlah batang rokok yang dikonsumsi perokok pria ras kulit
hitam Papua Indonesia tidak dipengaruhi oleh alel CYP2A6*9.
Kata kunci: CYP2A6*9, ras kulit hitam Papua, Polymerase Chain Reaction
(PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
ABSTRACT
The presence of cytochrome P450 2A6 gene (CYP2A6) polymorphism will
affect the activity of the enzyme towards nicotine metabolism in the body, either
decrease, eliminate or increase the activity of enzymes that will affect a person in
smoking. One of the polymorphisms of the CYP2A6 gene is the CYP2A6*9 allele.
The CYP2A6*9 allele undergoes one nucleotide polymorphism in the TATA box
located in the promoter region. This study aims to identify the presence of
CYP2A6*9 alleles in black male smokers in Papua, Indonesia.
This study was designed descriptively observational. A total of 30 subjects
with inclusion and exclusion criteria was instructed to fill out questionnaires
about smoking activity and then blood were collected for further. From those
samples, the DNA isolation was carried out and then followed by the qualitative
analyze using electrophoresis. The replication of the CYP2A6*9 allele was
amplified using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method.
The results showed that there is no CYP2A6*9 allele in black male
smoker in Papua, Indonesia. In conclusion up to now, there is no influence of
CYP2A6*9 existence toward the number of cigarette being consumed by black
male of Papua Indonesia.
Keywords: CYP2A6*9, black race Papua, Polymerase Chain Reaction (PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Merokok merupakan penyebab morbiditas dan mortalitas prematur paling
penting pada populasi dunia yang seharusnya bisa dicegah. Dalam asap rokok,
jumlah nikotin meningkat sampai 10%, diperkirakan hal ini terjadi oleh karena
proses pencampuran rasemik (racemization) selama pembakaran (Hukkanen et
al., 2005). Rata-rata dalam sebatang rokok mengandung 10-14 mg nikotin dan
sekitar 1 mg nikotin diabsorbsi ke dalam peredaran darah sistemik selama
merokok (Hukkanen et al., 2005). Nikotin terdistribusi secara luas dalam jaringan
tubuh dengan volume distribusi rata-rata 2,6 liter/kg berat badan (Hukkanen et al.,
2005).
Enzim sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) adalah enzim yang bertanggung
jawab terhadap 70-90% metabolisme nikotin dalam darah menjadi kotinin
(Gullstén 2000; Rao et al., 2000; Hukkanen et al., 2005). Enzim sitokrom P450
2A6 ini merupakan enzim utama yang berperan dalam proses metabolisme
xenobiotika fase 1. Di antara banyak gen kandidat yang berperan atau diduga
berperan dalam ketergantungan fisik terhadap nikotin terdapat gen CYP2A6, yaitu
gen yang mengkode enzim CYP2A6 (Gullstén 2000; Rao et al., 2000; Hukkanen
et al., 2005).
Proses metabolisme nikotin dilakukan oleh CYP2A6 melalui proses C-
oksidasi menjadi kotinin (COT), yang selanjutnya dimetabolisme lagi oleh
CYP2A6 menjadi trans-3'-hidroksikotinin (3HC) (Benowitz et al., 2006). Nikotin
diubah menjadi kotinin rata-rata sekitar 70% sampai 80%, dimana kotinin
merupakan metabolit proksimat utama (Jarvis et al., 1984). Penelitian Haiman et
al., (2006) menyimpulkan bahwa metabolisme kotinin lebih lambat pada orang
kulit hitam dibandingkan dengan orang kulit putih karena lambatnya proses
metabolisme oksidatif dari nikotin menjadi kotinin. Orang kulit hitam memiliki
risiko lebih tinggi untuk kanker paru-paru dibandingkan dengan kulit putih
(Haiman et al., 2006). Adanya polimorfisme gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6)
akan mempengaruhi aktivitas enzim terhadap metabolisme nikotin di dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
tubuh, baik menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim
(Raunio dan Rahnasto-Rilla, 2012).
Polimorfisme pada gen CYP2A6 terdapat sekitar 37 alel varian (Hukkanen
et al., 2005). Adanya polimorfisme gen CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas
enzim terhadap metabolisme nikotin di dalam tubuh, baik menurunkan,
menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim (Raunio dan Rahnasto-Rilla,
2012). Salah satu polimorfisme dari gen CYP2A6 tersebut adalah alel
CYP2A6*9. Alel CYP2A6*9 mengalami polimorfisme satu nukleotida dalam
kotak TATA di daerah promoter sehingga menurunkan proses transkripsi dan
aktivitas metabolik in vivo dari CYP2A6, yang terdeteksi 16-22% dari populasi
orang Asia (Minematsu et al., 2006). Polimorfisme gen CYP2A6 dengan alel non
aktif yang tinggi banyak ditemukan pada orang-orang Asia (Peamkrasatam et al.,
2006; Yusof dan Gan, 2009). Sebagaimana diuji oleh Pitarque et al.,(2005)
menjelaskan bahwa mutasi yang terjadi pada alel CYP2A6*9 menurunkan proses
transkripsi hingga 50% sehingga membuat CYP2A6*9 menjadi salah satu alel
CYP2A6 yang bertanggung jawab terjadinya status metabolisme yang rendah
(Pitarque et al., 2005).
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik yang dapat
mendeteksi adanya polimorfisme pada CYP2A6. PCR adalah suatu teknik yang
melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi
duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified
DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga
mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel
(anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA
digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya
deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) dan buffer yang sesuai (Newton and
Graham, 1994). PCR mampu mengamplifikasi suatu fragmen gen pada templat
DNA berdasarkan primer tertentu sehingga dapat diidentifikasi suatu alel dalam
sampel DNA (Rahman et al., 2013). Penelitian identifikasi gen sitokrom P450
2A6 alel *9 ini perlu dilakukan pada perokok pria ras kulit hitam Papua di
Indonesia karena pada perokok yang memiliki kulit gelap memiliki kemampuan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
metabolisme nikotin yang lebih rendah sehingga ketergantungan terhadap rokok
juga lebih rendah.
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Pada
penelitian ini dilakukan penggambaran hasil polimorfisme gen CYP2A6 pada
satu populasi. Pada penelitian ini terdapat variabel tercoba, variabel teramati, dan
variabel pengacau terkendali. Variabel tercoba dalam penelitian ini adalah sampel
DNA dari berbagai individu. Variabel teramati dalam penelitian ini adalah produk
PCR yang dideteksi dengan elektroforesis. Variabel pengacau terkendali dalam
penelitian ini adalah kemurnian isolat DNA total. Hal tersebut diatasi dengan
melakukan penyimpanan pada suhu -20ºC sebelum melakukan analisis dengan
PCR.
Bahan penelitian
Sampel darah perokok pria ras kulit hitam Papua, Primer forward: (5’-
GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse: (5’-
GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’), Promega Go Taq Green Master Mix
(berisi taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer), FavorPrep TM
Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell), 10X Tris-Borate-EDTA (TBE)
Buffer pH 8,3 Ultra Pure Grade (Vivantis), agarose (Vivantis), GelRed TM
Nucleic Acid Gel Stain (Biotium), VC 100bp Plus DNA marker (Vivantis),, DNA
loading dye (Vivantis), etanol 96% (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua
bidestilata steril (Ikapharmindo).
Alat penelitian
Alat-alat gelas, DNA isolasi kit (Favorgen), Thermal cycler Perkin Elmer
2400, satu set Elektroforesis horizontal (Sigma Aldrich), UV Transilluminator
(fisher scientific), dispossable gloves, receivertubes (1,5 mL), hot plate (thermo
scientific), mikropipet, waterbath, blue tip, yellow tip, white tip, sentrifuge (fisher
scientific), kamera DSLR, spuit injeksi 3 mL (Terumo), timbangan analitik
dengan ketelitian 0,0001 g (Metler Toledo), vacutainer K2 yang mengandung
EDTA 5,4 mg, PCR ® Tubes (Axygen).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Kriteria Subyek Uji
Pada penelitian ini menggunakan subjek uji yang yang diwawancara lalu
diminta mengisi kuisioner dengan kriteria yaitu perokok berjenis kelamin laki-laki
berjumlah 30, keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal sampai third degree
relativies (Kakek dan nenek orang Papua asli) dan berumur 20-40 tahun yang
tinggal di Yogyakarta. Perokok aktif minimal 5 tahun yang mengkonsumsi baik
rokok kretek dan rokok putih. Mengeliminasi pasien yang sedang mengonsumsi
obat rutin atau sedang menjalani pengobatan untuk berhenti merokok dalam
sebulan terakhir, pasien dengan penyakit yang mengharuskan beristirahat total
selama ≥ 10 hari dalam sebulan terakhir, seperti heart diseases, renal failure,
pulmonary diseases, pasien dengan penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis hati,
dan hepatoma. Subjek uji dengan sadar bersedia menandatangani inform consent.
Penelitian yang dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Biokimia
Universitas Sanata Dharma ini telah memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh
Komisi Etik Fakultas Kedokteran Kristen Duta Wacana.
Pengambilan Sampel Darah Pada Subyek Uji
Sampel darah diambil oleh petugas profesional perawat. Sampel darah
diambil dari pembuluh vena subjek uji dan ditampung dalam dan ditampung
dalam vacutainer K2 yang mengandung EDTA 5,4 mg. Darah segar yang
diperoleh disimpan pada suhu ± 4°C, sebelum dianalisis. Darah ini kemudian
digunakan untuk identifikasi alel CYP2A6*9.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan dengan menggunakan reagen
FavorPrepTM Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell). Sampel darah yang
digunakan sebanyak 300 μL. Disiapkan sampel darah subjek uji dan dipindahkan
300 μL sampel darah tersebut ke tabung mikrosentrifuge 1,5mL. Ditambahkan
900 μL RBC lisis buffer, dilakukan pencampuran dengan digojog dan diinkubasi
pada suhu ruangan selama 10 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
3000 x g selama 5 menit. Supernatan dihilangkan dari tube, ditambahkan 100 μL
RBS lisis buffer pada pellet yang ada pada tube. Selanjutnya ditambahkan 200 μL
FABG buffer dan dihomogenkan dengan vorteks. Diinkubasi selama 10 menit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
pada suhu ruangan dan dibolak-balikan setiap 3 menit. Elution buffer dipanaskan
dengan waterbath dengan suhu 70 ºC. Selanjutnya ditambahkan 200 μL etanol
96% ke dalam tube dan divorteks selama 10 detik. Kolom FABG dipasangkan
dengan 2 ml collection tube dan sampel dipindahkan ke dalam kolom FABG
tesebut. Sentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan maksimal (14.000 rpm atau
10.000 x g) dan dipindahkan kolom FABG pada collection tube baru. Kemudian,
kolom FABG dicuci dengan 400 μL W1 buffer dan dan disentrifuge pada
kecepatan maksimal. Cairan yang ada pada collection tube dibuang. Kolom
FABG dipindahkan pada 2 ml collection tube dan ditambahkan 600 μL wash
buffer yang sudah ditambahkan etanol. Kemudian disentrifugasi selama 30 detik
pada kecepatan maksimal dan cairan yang ada pada collection tube dibuang.
Kolom FABG diletakkan kembali pada collection tube dan disentifugasi dengan
kecepatan maksimal untuk mengeringkan kolom. Kolom FABG yang sudah
kering dipasangkan ke 1,5 ml mikrosentrifuge tube, dan ditambahkan 100 μL
elution buffer yang telah dipanaskan ke tengah membran kolom FABG. Kolom
FABG didiamkan dengan posisi tegak selama 3-5 menit sehingga elusi buffer
dapat terserap membran kolom FABG. Kemudian disentifugasi pada kecepatan
maksimal selama 30 detik untuk mengelusi DNA. DNA hasil isolasi disimpan
pada suhu -20ºC.
Analisis kemurnian isolat DNA
Elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,0 % dilakukan dengan cara 1,0
g agarosa dilarutkan dalam larutan 1x TBE sebanyak 100 mL lalu dipanaskan
pada hot plate hingga mendidih sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer
hingga larut, kemudian ditambahkan 1 μL larutan gel red dan diaduk hingga
homogen. Larutan dituang ke dalam cetakan gel sebanyak 25 ml yang telah diberi
sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel
mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur dan ditempatkan ke dalam gel tray
elektroforesis yang sudah berisi larutan bufer 1x TBE. Isolat DNA sebanyak 4,0
μL ditambahkan aquabidest sebanyak 1,0 μL, kemudian dicampur dengan loading
dye sebanyak 1,0 μL, kemudian campuran tersebut diambil sejumlah 6,0 μL dan
dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 4,0 μL sebagai marker dan dilakukan
elektroforesis dengan tegangan 125 volt selama 30 menit. Molekul DNA pada gel
tray akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Hasil
elektroforesis berupa gel agarosa dideteksi di bawah UV transilluminator dan
didokumentasikan menggunakan kamera DSLR 7D. Panjang pita DNA dapat
diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA
dengan posisi pita DNA ladder.
Amplifikasi Isolat DNA Dengan Metode PCR
Untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9 dilakukan
amplifikasi dengan menggunakan primer yang diadopsi Yoshida et al. (2003),
yaitu primer forward: 5'-GATTCCTC TCCCCTGGAAC-3', primer reverse: 5'-
GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3'. Amplifikasi DNA dengan PCR dilakukan
menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix. Volume akhir campuran 25
μL, yang terdiri dari Promega Go Taq Green Master Mix 12,5 μL, primer forward
1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, Aquabides 5 μL. Penentuan
rentang suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi berdasarkan pada hasil
optimasi yang dilakukan oleh Cindy (2017). Amplifikasi dilakukan dengan mesin
PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR digunakan adalah sebagai
berikut: initial denaturasi pada suhu 94ºC (3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada
suhu 94ºC (30”); annealing pada suhu 60ºC (30”) dan ekstensi pada suhu 70ºC
(25”). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 30 kali dan selanjutnya
diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72ºC (5’)
Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis
Untuk melihat hasil produk PCR dilakukan elektroforesis dengan fase
diam agarosa 1,5% yang telah ditambahkan dengan gel red dan dilihat hasilnya
dengan menggunakan lampu UV Transilluminator. Produk PCR yang ditunjukkan
dengan adanya pita didokumentasi dengan kamera DSLR Canon 7D. Produk PCR
yang terbentuk pada penelitian ini berada pada pita 368-bp (Yoshida et al., 2003).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian polimorfisme CYP2A6 dilakukan empat tahapan utama,
yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA dari sampel darah, analisis kualitatif isolat
DNA, dan analisis produk PCR dengan teknik elektroforesis. Penelitian ini
menggunakan PCR sebagai metode untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme
pada suatu genetik dalam suatu populasi. Alel CYP2A6*9 merupakan alel yang
akan diidentifikasi pada penelitian ini dengan metode PCR. Pemilihan alel
CYP2A6*9 dikarenakan tingginya frekuensi alel non aktif seperti CYP2A6*9
pada populasi di Asia serta dapat memberikan manfaat edukasi dalam
menurunkan ketergantungan mengkonsumsi rokok karena proses metabolisme
yang lambat.
Pemilihan subjek uji
Pada penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 subjek yang
berasal dari perokok berjenis kelamin laki-laki keturuan ras kulit hitam Papua
minimal tiga generasi yang berumur 20-28 tahun dengan rata-rata umur yaitu 23
tahun. Menurut B-Rao (2001), ukuran sampel minimum dalam studi polimorfisme
genetik dengan dua alel yang terdeteksi adalah 30 sampel yang dapat dilihat di
lampiran. Dalam ukuran sampel ini, kedua alel akan terdeteksi dalam probabilitas
tinggi (B-Rao, 2001). Salah satu kelemahan dari penelitian ini adalah sulitnya
mencari subjek uji perokok pria ras kulit hitam yang berdomisili di Yogyakarta.
Hal ini menyebabkan jumlah subjek uji yang didapatkannya memiliki rentang usia
subjek uji yang tidak diinginkan yaitu 20-40 tahun. Hal ini berdampak pada
kurangnya sampel uji yang mencerminkan aktivitas merokok pada populasi
perokok pria ras kulit hitam Papua.
Keseluruhan subjek uji rata-rata menghisap 10 batang rokok per hari
dengan rentang 3-24 batang perhari dan subjek uji rata-rata melakukan aktivitas
merokok selama 8 tahun dengan rentang 5-18 tahun. Hasil karakteristik subjek uji
yang terlibat dapat dilihat di tabel I.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Tabel I. Karakteristik subjek uji yang terlibat dalam penelitian
Karakteristik Nilai
Jumlah subjek uji 30 perokok
Umur (Tahun) Range 20-28
Mean ± SD 23,33 ± 2,53
Jumlah batang rokok
yang dihisap perhari
Range 3-24
Mean ± SD 10,30 ± 6,22
Lama merokok
(Tahun)
Range 5-18
Mean ± SD 8,03 ± 3,2
Keterangan :
SD = Standar deviasi
Hal ini menunjukkan aktivitas merokok seseorang dipengaruhi oleh
polimorfisme pada gen CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas enzim CYP2A6
yang pada akhirnya turut berpengaruh terhadap kadar nikotin dalam darah. Bentuk
aktif enzim CYP2A6 adalah alel CYP2A6*1 yang berpengaruh terhadap aktivitas
enzim CYP2A6 dengan metabolisme yang normal. Apabila seseorang mengalami
polimorfisme gen menjadi alel CYP2A6*9 hal tersebut akan menurunkan proses
transkripsi hingga 50% sehingga membuat CYP2A6*9 menjadi salah satu alel
CYP2A6 yang bertanggung jawab terjadinya status metabolisme yang rendah
(Pitarque et al., 2005). Faktor ketergantungan aktivitas merokok seseorang
dipengaruhi oleh kadar nikotin dalam tubuh yang ditentukan oleh jumlah
konsumsi nikotin karena merokok dan kecepatan metabolisme oleh hati, dimana
kadar nikotin akan lebih rendah pada perokok dengan alel CYP2A6*9 oleh karena
rendahnya metabolisme nikotin dibandingkan dengan alel CYP2A6*1 (Raunio
dan Rahnasto-Rilla, 2012).
Isolasi DNA dari sampel darah
Isolasi DNA menggunakan Genomic DNA Mini Kit (FavorPrepTM).
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain
seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA dengan
favoergen yaitu penghancuran (lisis) sel darah merah dengan cara menambahkan
RBC lysis, penghancuran sel karena DNA terdapat pada nukleus (Elrod, 2007)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
dengan menambahkan FABG buffer. Penambahan buffer lisis berguna untuk
mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Lalu penambahan etanol 96-100%
dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah itu
dilakukan proses pencucian dengan W1 buffer dan wash buffer untuk
menghilangkan residu etanol dari DNA lalu dilakukan pengeringan pellet DNA.
Tahapan terakhir yaitu penambahan TE atau elution buffer untuk melarutkan
DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak rusak (Asris, 2010) kemudian
disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20oC agar tidak rusak dan
terkontaminasi. Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA
tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA (Surzycki, 2000). Hasil
kemurnian isolasi DNA dapat dilihat secara kualitatif dengan menggunakan
teknik elektroforesis.
Analisis kualitatif isolat DNA
Isolat DNA yang digunakan pada penelitian ini berasal dari proses isolasi
yang sudah dilakukan sebelumnya menggunakan sampel darah dari populasi ras
kulit hitam Papua. Analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik
elektroforesis (Yusof and Gan., 2009). Isolat DNA yang digunakan dalam
penelitian adalah pita dengan ukuran lebih dari 3000 bp dan seharusnya
menghasilkan pita yang tunggal dan tebal dimana hal ini menunjukkan bahwa
isolat DNA yang diggunakan tidak tercemar protein dan tidak terdegradasi.
Namun apabila terjadi variasi dalam terbentuknya pita ganda dan tipis hal ini
dapat menunjukkan bahwa isolat yang digunakan sudah tercemar ataupun
terdegradasi (Patramurti et al., 2014). Hasil elektroforesis isolat DNA dapat
dilihat dari terbentuknya pita yang dilihat dengan menggunakan lampu UV
transilluminator. Hasil elektroforesis menunjukkan terbentuknya variasi pita baik
pita tunggal dan tipis atau pita tunggal dan tipis dengan ukuran lebih dari 3000 bp
(Gambar 1). Hal ini menunjukkan bahwa isolat DNA yang dihasilkan murni dan
terbebas dari kontaminan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
M 1 2 3 4 5 6 7
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik
elektroforesis
Keterangan :
M : 100 bp DNA ladder sebagai marker
1-5 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal
6-7 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tipis
Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1%; fase gerak larutan TBE 0,5%;
kecepatan 100 V/cm; volume injeksi 6µL
Analisis produk PCR dengan teknik elektroforesis
Identifikasi alel CYP2A6*9 pada penelitian ini menggunakan teknik PCR
(Yoshida et al., 2003). Kondisi tiap-tiap tahap PCR yaitu initial 94oC selama 3
menit, denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 60oC selama 30 detik, ekstensi
70oC selama 25 detik, final ekstensi 72oC selama 5 menit, dan jumlah siklus
sebanyak 30 siklus yang telah dioptimasi Cindy (2017) dengan tujuan agar pada
optimasi suhu dan jumlah siklus tersebut telah mampu mengamplifikasi CYP2A6
yang diinginkan, menghasilkan satu produk PCR yang spesifik dengan pita DNA
tunggal dan tebal, serta mencegah terjadinya mispriming karena primer yang tidak
menempel yang disebabkan oleh faktor suhu (Stephenson and Abilock, 2012).
Kondisi PCR yang diggunakan tersebut sangat penting untuk proses
annealing yang merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer
Isolat DNA
3000 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
(Gambar 2) merupakan tahap yang penting dalam PCR karena jika terdapat
sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan menyebabkan primer tidak
menempel dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan (Ahluwalia, 2009).
Elongasi terjadi setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA
polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari
gabungan antara primer, DNA cetakan, dan nukleotida. Jika dilakukan
pengulangan terhadap ketiga tahapan tersebut, maka untai DNA yang baru
dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan, dan
pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru (Handoyo dan Ari, 2001).
Alel CYP2A6*9
Primer forward
5' 3'
GATTCCTCTCCCCTGGAAC TAAAGGCAAACCACCCCAGCC
CTAAGGAGAGGGGACCTTG ATTTCCGTTTGGTGGGGTCGG
3’ 5’
Primer reverse
Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*9
Keterangan:
: arah penempelan primer forward
: arah penempelan primer reverse
Keberhasilan PCR juga ditentukan oleh spesifisitas primer dalam
menempel pada isolat DNA (McPherson and Moller, 2006). Pada identifikasi alel
CYP2A6*9 ini digunakan primer yang untuk mengamplifikasi CYP2A6*1 yang
diambil dari penelitian Yoshida et al., (2003) yaitu primer forward: (5’-
GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse: (5’-
GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’). Primer foward akan mengamplifikasi
ekson 395 sampai 376 dan primer reverse mengamplifikasi ekson 48 sampai 28
(Yoshida et al., 2003). Amplifikasi alel CYP2A6*9 ini menggunakan primer yang
digunakan untuk mengamplifikasi alel CYP2A6*1 karena kedua alel ini hanya
memiliki perbedaan 1 basa (Gambar 3). Perbedaan 1 basa ini dapat dilihat dengan
mencocokkan potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank dengan
urutan basa CYP2A6*9 menurut teori Yoshida et al., (2003) (Cindy, 2017). Pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
alel CYP2A6*9 dapat dilihat terjadi polimorfisme satu nukleotida (SNP) dalam
kotak TATA di daerah promoter sehingga amplifikasi alel CYP2A6*9 dapat
menggunakan primer dari alel CYP2A6*1.
A. CYP2A6*1 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
C. CYP2A6*9 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
A. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
C. CYP2A6*9 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
A. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
C. CYP2A6*9 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
A. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
C. CYP2A6*9 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
A. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
C. CYP2A6*9 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
A. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
C. CYP2A6*9 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
A. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT
C. CYP2A6*9 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAAGGAGGTAATTATGTAAT
A. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC
C. CYP2A6*9 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC
A. CYP2A6*1 ACCCCAGCCG
C. CYP2A6*9 ACCCCAGCC
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9
(mutasi Single nucleotide polymorphism (SNP) ditunjukkan oleh warna hijau dan
kuning)
Keterangan :
A : Potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank
C : Urutan basa CYP2A6*9 menurut teori Yoshida et al., (2003)
Amplifikasi gen CYP2A6 menggunakan primer tersebut menghasilkan
produk PCR yang berukuran 368-bp yang merupakan produk dari alel
CYP2A6*1. Hasil analisis produk PCR dari 30 sampel yang dilakukan dengan
teknik elektroforesis menghasilkan produk PCR dengan ukuran 368 bp (Gambar
4) dengan pita tunggal dan tebal. Hal ini menunjukkan produk PCR yang
dihasilkan merupakan produk dari alel aktif CYP2A6*1 dan dari 30 sampel yang
diidentifikasi, tidak ada subjek uji yang memiliki alel CYP2A6*9. Hasil tersebut
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
dapat diartikan bahwa sebanyak 30 sampel yang tidak memiliki alel CYP2A6*9
akan memiliki metabolisme yang lebih cepat dibandingkan dengan orang yang
memiliki alel CYP2A6*9 sehingga memiliki kemungkinan akan merokok lebih
banyak.
M 7 6 5 4 3 2 1
Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat
DNA
Keterangan :
M : 100 bp DNA ladder sebagai marker
1-7 : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda
Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,5%; fase gerak larutan TBE 0,5%;
kecepatan 100 V/cm; volume injeksi 6µL
Produk PCR
368 bp
3000 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
KESIMPULAN
Hasil identifikasi gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) alel *9 pada perokok
pria ras kulit hitam Papua yaitu tidak adanya alel CYP2A6*9 dengan frekuensi
0% sehingga dapat dikatakan untuk sementara bahwa jumlah batang rokok yang
dikonsumsi perokok pria ras kulit hitam Papua tidak dipengaruhi oleh alel
CYP2A6*9.
SARAN
Untuk penelitian selanjutnya, peneliti menyarankan melakukan identifikasi
polimorfisme gen CYP2A6 pada alel non aktif yang berbeda seperti alel
CYP2A6*4, CYP2A6*7, CYP2A6*11, dll yang diduga memiliki peran terhadap
proses metabolisme nikotin di dalam tubuh pada populasi perokok pria ras kulit
hitam Papua.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
DAFTAR PUSTAKA
Ahluwalia, K. B. 2009. Genetics. Ed ke-2. New Age International Publisher, New
Delhi: p.451.
Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi
DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 5 Desember
2017, pada pukul 23.00 WIB.
Benowitz NL, Lessov-Schlaggar CN, Swan GE, Jacob P III. Female sex and oral
contraceptive use accelerate nicotine metabolism. Clin Pharmacol Ther
2006;79:480–8
B-Rao C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.
Human Heredity, 52, 191–200.
Cindy., 2017, Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada
identifikasi CYP2A6*9, Skripsi, Fakultas farmasi Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.
Gullstén, H. 2000. Significance of Polymorphism in CYP2A6 Gene. Disertation.
Oulu: Department of Pharmacology and Toxicology University of Oulu.
Haiman, C. A., Stram, D. O., Wilkens, L. R., Pike, M. C., Kolonel, L. N.,
Henderson, B. E., et al,. (2006). Ethnic and racial differences in the
smoking-related risk of lung cancer. New England Journal of Medicine,
354, 333–342.
Hukkanen, J., Jacob III, P. & Benowitz, N.L. 2005. Metabolism and Disposition
Kinetics of Nicotine. The American Society for Pharmacology and
Experimental Therapeutics. Vol. 57, No. 1.
Jarvis M, Tunstall-Pedoe H, Feyerabend C, et al. Biochemical markers of smoke
absorption and self-reported exposure to passive smoking. J Epidemiol
Community Health 1984;38: 335-9.
Kruman, I. I., 2011, Cell Cycle and DNA Damage Response in Postmitotic
Neurons, DNA Repair, InTech, Texas.
Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateo,
H., et al., 2006, Limitation of Cigarette Consumption by CYP2A6*4, *7
and *9 Polymorphisms, European Respiratory Journal, 27(2), 289-292.
McPherson, M.J., and Moller, S.G., 2006, PCR, 2 edition, New York: Taylor &
Francis, 305.
Newton, C.R. and A. Graham, 1994. PCR. BIOS Scientific Publishers
Limited,Oxford.
Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014, Polymorphism
of Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese
Indonesian Smoker and Non Smoker, Indonesian Journal of Pharmacy,
26(1), 11-19.
Peamkrasatam. S., Sriwatanakul, K., Kiyotani, K., Fujieda, M., Yamazaki, H.,
Kamataki, T., et al., 2006, In Vivo Evaluation of Coumarin and Nicotine
as Probe Drugs to Predict the Metabolic Capacity of CYP2A6 Due To
Genetic Polymorphism in Thains, Drugs Metabolism and
Pharmacokinetics, 21(6), 475-484.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Pitarque, M., Richter, O., Oke, B., Berkkan, H., Oscarson, M., and Ingelman-
Sundberg, M., 2001, Identification of a Single Nucleotide Polymorphism
in the TATA Box of the CYP2A6 Gene: Impairment of Its Promoter
Activity, Biochemical astepnd Biophysical Research Communications,
284, 455-460.
Rahman, M.T., Uddin, M.S., Sultana, R., Moue, A., & Setu, M. 2013. Polymerase
Chain Reaction (PCR): A Short Review. Anwer Khan Modern Medical
College Journal. 4 (1): 30-36.
Rao, Y., Hoffmann, E., Zia, M., Bodin, L., Zeman, M., Sellers, E.M. & Tyndale,
R.F. 2000. Duplications and Defects in The CYP2A6 Gene:
Identification, Genotyping, and In Vivo Effects on Smoking. The
American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics. Vol.
58, No. 4.
Raunion, H. and Rahnasto-Rilla, M., 2012, CYP2A6: Genetics, Structure,
Regulation, and Function, Drug Metabolism and Drug Interaction, 27(2),
73-88.
Stephenson, F.H. and Abilock, M.C., 2014, PCR Optimization.
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, New York.
Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J-T., and
Yokoi, T., 2003, Effects of Polymorphism in Promoter Region of Human
CYP2A6 gene (CYP2A6*9) on Expression Level of Messenger
Ribonucleic Acid and Enzymatic Activity In Vivo and In Vitro, Clinical
Pharmacology and Therapeutics, 74(1), 69-76.
Yusof, W. and Gan, S.H., 2009, High Prevalence og CYP2A6*4 and CYP2A6*9
Alleles Detected Among a Malaysian Population, Clinical Chemical
Acta: International Jornal of Clinical Chemistry, 403(1-2), 105-9.
Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Lampiran 1. Surat keterangan kelaiakan etik (ethical clearence)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder& Markers
Lampiran 5. Product Datasheet of primer forward and reverse CYP2A6*9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Lampiran 6. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Elektroforesis
16p 15p 14p 13p 12p 11p 1p
24p 25p 26p 27p 28p 29p 30p
17p 18p 19p 20p 21p 22p 23p
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Lampiran 7. Hasil PCR
18p 19p 20p 13p 12p 17p 8p 1p 2p 3p 4p 5p 6p 7p
8p 9p 10p 11p 12p 13p 14p
14
15p 16p 17p 18p 19p 20p 21p
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
22p 23p 24p 25p 26p 27p 28
p
29p 30p 31p 32p 33p 1p 2p
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 8. Usage Information of FavorPrepTM
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 9. Data Subjek Uji hasil kuisioner
Subjek Umur Skor Jumlah batang
rokok
Lama
merokok
1p 22 3 15 8
2p 25 3 8 10
3p 24 3 21 5
4p 23 1 3 11
5p 28 6 20 11
6p 26 3 10 12
8p 25 3 8 5
9p 20 1 9 5
10p 27 4 11 9
11p 22 2 7 5
12p 21 3 5 9
13p 28 3 12 8
14p 20 3 3 6
15p 20 1 5 6
16p 20 2 3 5
17p 25 6 23 18
18p 22 4 10 6
19p 23 5 13 9
20p 21 3 10 5
21p 20 3 5 5
23p 22 4 16 6
24p 22 3 3 8
26p 21 2 4 5
27p 27 5 10 15
28p 22 1 7 7
29p 24 5 5 7
30p 25 5 18 5
31p 24 4 6 10
32p 24 3 15 8
33p 27 6 24 12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 10. Hasil Kuisioner
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Lampiran 11. Perhitungan jumlah sampel
Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal pada
penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah:
Nmin ≥ log (1 – π )/2log (1 – fmin)
Dimana:
Nmin : jumlah sampel minimal
π : probabilitas alel utama
fmin : frekuensi alel minor
Pada penelitian ini jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu:
CYP2A6*1 (alel utama) dan CYP2A6*9 (alel minor). Maka menurut B-Rao
(2001), nilai π dan fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah: π =
0,95 dan fmin = 0,05.
Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah:
Nmin = log (1 – π )/2log (1 – fmin)
= log (1-0,95/2log (1-0,05)
= 28,89
= 29 orang
Jumlah sampel yang digunakan pada penelitan ini adalah 30 orang, oleh karena itu
jumlah ini sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian genetik
polimorfisme.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama lengkap Dismas Adi Prabowo, lahir di
Palembang pada tanggal 19 Desember 1996 dan
merupakan anak kedua dari pasangan Bapak Ignatius
Riyanto dan Ibu Barbara Sriwahyunigsih. Pendidikan
formal yang telah ditempuh penulis yaitu TK Xaverius
5 Palembang (2000 - 2001), tingkat Sekolah Dasar di
SD Xaverius 5 Palembang (2002 - 2008), tingkat
Sekolah Menengah Pertama di SMP Xaverius Maria
Palembang (2009 – 2011), dan tingkat Sekolah
Menengah Atas di SMA Xaverius 2 Palembang (2012 – 2014). Pada tahun 2014,
penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan, penulis aktif dalam
beberapa kepanitiaan seperti Desa Mitra tahun 2015 sebagai perlengkapan, titrasi
2015 sebagai anggota divisi Dana dan Usaha, titrasi 2016 sebagai perlengkapan,
PPRtos 2016 sebagai divisi keamanan, dan 2017 sebagai ketua panitia Kunjungan
Industri dan Rumah Sakit. Penulis juga berpartisipasi sebagai asisten dosen kimia
dasar tahun 2017.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI