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IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN
n Identifizierung von Bakterien heißt, so
wenige Eigenschaften wie möglich und so
viele wie notwendig zu bestimmen, um
einer unbekannten Kultur ihren Platz im
Nomenklatur zuzuordnen und sie damit
auch benennen zu können.
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n Grundsätzlich können 3 Gruppen von Eigenschaften für die
Identifizierung herangezogen werden:
• Morphologische Merkmale: Gram-Verhalten, Form, Größe,
Kapsel
• Physiologische Merkmale: Nachweis verschiedener Enzyme
wie Katalase, Koagulase
• Chemische Merkmale: DNA-Struktur, Zellwand-Aufbau
n Unter Taxonomie (Systematik) versteht man
das Beschreiben und Ordnen der Lebewesen
in einem hierarchischen System.
n Dieses beginnt mit der umfassendsten
Einheit und endet mit der kleinsten Einheit.
3
n Reich (Procaryotae), Division, Klasse, Ordnung,
n Familie,
n Gattung (Genus)
n Art (Spezies, sp.)
n Unterarten (Subspezies, spp.)
n Bakterienstämme
Die Reihenfolge der einzelnen Kategorien (Taxa, Singular = Taxon) lautet:
n Jedes Taxon umfasst alle ihr nachgeordneten Taxa, d.h. z.B.
in eine Gattung werden alle diejenigen Arten, die
miteinander ähnliche Merkmale haben, eingeordnet.
n Einer Familie werden ähnliche Gattungen zugeordnet usw.
n Die Art als kleinste Einheit umfasst diejenigen
Bakterienstämme die in ihren Eigenschaften
übereinstimmen.
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Biochemische Tests
Plasmakoagulase
n Dieses von S. aureus gebildete Exo-Enzym führt zur Verklumpung von
Plasma. Die Mechanismen sind denen der physiologischen
Blutgerinnung ähnlich, aber nicht ident.
n Die pathogenetische Bedeutung der Koagulase liegt in der Bildung
eines Fibrinschutzwalles um die in das Gewebe eingedrungenen
Staphylokokken.
n Dieser Fibrinschutzwall kann später, nach entsprechender
Vermehrung, durch das von Staphylokokkenzellen gebildete
Fibrinolysin wieder aufgelöst werden.
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Plasmakoagulase
n Die durch ungestörte Vermehrung ihrer Zellzahl und damit
auch ihrer pathogenen Potenz verstärkten Staphylokokken
können sich dann in die Umgebung ausbreiten.
n Anwendung: Differenzierung von S. aureus und Koagulase-
negativen Staphylokokken
n S. aureus: Verklumpung, S. epidermidis: keine
Verklumpung
Katalase
n Die Eigenschaft eines Keimes, eine 3%ige
Wasserstoffperoxidlösung mittels Katalase in Wasser und
Sauerstoff (Gasbläschen) abzubauen, ist ein wichtiges
Differenzierungsmerkmal in der Bakteriendiagnostik.
n Die Katalaseaktivität einer Kultur läßt sich einfach prüfen,
indem man sie direkt oder nach Übertragung einer kleinen
Menge Koloniemasse auf einen Objektträger mit 3%iger
H2O2-Lösung übergießt.
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Katalase
n Aufsteigende Gasblasen (02) zeigen die Anwesenheit
des Enzyms an. Die Katalase ist ein
Atmungskettenenzym und wird in der
Routinediagnostik vorwiegend zur Differenzierung von
Staphylokokken und Streptokokken verwendet.
n Staphylokokken: Katalase-positiv (Schaumbildung)
n Streptokokken: Katalase-negativ
n Man erhält eine relativ scharf begrenzte Hämolysezone um die Kolonien, die Erythrozyten sind aufgelöst, und der Blutfarbstoff ist abgebaut, sodaß eine klare Zone im sonst undurchsichtigen Blutagar entsteht (ß-Hämolyse).
Hämolyse
7
n Um die Kolonien findet man grüne Höfe von
unterschiedlicher Farbintensität, in deren Bereich der
Blutfarbstoff aufgelöst ist, während die
Erythrozytenmembran weitgehend erhalten bleibt (α-
Hämolyse).
n γ-Hämolyse: Fehlende Veränderungen des Blutagars,
keine Hämolyse!
Hämolyse
Cytochromoxidase-Test
n Oxidase test dient zur Abgrenzung der
Enterobakterien von anderen Gram-negativen Keimen
wie z.B. Pseudomonaden oder Aeromonaden.
n Der Nachweis von Cytochromoxidase erfolgt durch Auftropfen von
Oxidasereagenz (1%iges α-Naphthol und N,N,Dimethyl-p-
phenylendiammoniumdichlorid) auf die verdächtigen Kolonien.
n Oxidase-positive Kolonien färben sich etwa nach 30 Sekunden
dunkelblau (Indophenol-Blau), Oxidase-negative Kolonien bleiben
unverändert.
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Cytochromoxidase-Test
n Mit dem Cytochrom-Oxidase-Test werden Bakterien erfaßt,
die Cytochrom c als Respirationsenzym enthalten.
n Der Farbstoff N, N-Dimethyl-p-phenylen-
diammoniumchlorid fungiert dabei als künstlicher
Elektronenakzeptor.
n In der reduzierten Form ist er farblos, bei Vorhandensein
von Cytochromoxidase und Luftsauerstoff, wird er oxidiert,
wobei sich ein blauer Indophenolkomplex bildet.
Cytochromoxidase-Test
N
CH3 H3C
N H2
+
N
CH 3 H3C
OH
N
O
Dimethyl-p- pheny lenediamin
e
a lpha-N aphtol
------------->
Indophenol blue
+ 4H + 4e
n Bei Zusatz einer wäßrigen Lösung von oben genannten
Farbstoff und einer 1 %-igen alkoholischen Lösung von
α- -Naphtol zum Zellmaterial spielt sich folgende
Reaktion ab:
9
Cytochromoxidase-Test
positive Reaktion
negative Reaktion
Oxidations/Fermentations-Test
n O/F-Test wird z.B. zur Differenzierung von Mikrokokken
(Oxidation) und Staphylokokken (Fermentation)
verwendet.
n Für den Fermentationstest wird das beimpfte
Agarröhrchen mit sterilem Paraffinöl überschichtet.
n Eine positive Reaktion manifestiert sich im Umschlag des
Indikators im Zuckernährboden.
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MUG TEST
n Das fluorogene Substrat MUG wird durch das Enzym
ß-D-Glucuronidase gespalten. Methylumbelliferon
ist als Spaltprodukt fluoreszenzoptisch nachweisbar.
n Eine blaue Fluoreszenz des Nährbodens weist auf die
Anwesenheit von Methylumbelliferon hin.
n Der E. coli-Nachweis ist erbracht, wenn Fluoreszenz
nachweisbar ist und der Indoltest positiv ausfällt.
n ß-Galactosidase (Lactase) ist ein intrazelluläres Enzym, das
Lactose zu Galactose und Glucose abspaltet.
n Lactose wird durch Lactose-Permease in die Zelle transportiert
und durch ß-Galactosidase gespalten.
n o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG)
n ß-Galactosidase setzt Nitrophenol aus ONPG frei
n Innerhalb der Enterobakterien ist diese Reaktion das wichtigste
Unterscheidungsmerkmal von coliformen Bakterien.
ONPG
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Äsculinhydrolyse
n Enterokokken (D-Streptokokken) hydrolysieren das
Glucosid Äsculin (ß-Glucose-6,7-dihydroxycumarin) zu
Glucose und Äsculetin (6,7-dihydroxycumarin), welches mit
Eisen(III)-Ionen einen olivgrünen bis schwarzen Komplex
bildet.
n ß-D-GLUCOSIDASE
n Äsculin ist unter UV-Bestrahlung bei 365 nm fluoreszierend,
das Endprodukt Äsculetin aber nicht.
IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN
API 10 ist ein miniaturisiertes System zur
Identifizierung von Enterobakterien und
anderen Gram-negativen Stäbchen mit Hilfe
von standardisierten biochemischen
Reaktionen.
Do
Ü6
12
§ Der API 10 Streifen besteht aus 10 Mikroröhrchen, in denen sich
verschiedene Substrate in dehydratisierter Form befinden.
§ Die Röhrchen werden mit der zu untersuchenden Bakteriensuspension
beimpft, welche die Substrate löst.
§ Die biochemischen Reaktionen können anhand von Farbumschlägen
abgelesen werden, die entweder spontan während der Inkubation oder
nach Zugabe von Reagenzien entstehen.
BUNTE REIHE
Vorbereitung des Streifens:
n Eine Inkubationswanne mit Deckel bereitstellen und zur Herstellung einer feuchten Kammer 3 ml Wasser in die Wanne geben.
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Vorbereitung des Streifens:
n Die Nummer der Untersuchungsprobe auf dem dafür vorgesehenen Teil der Inkubationswanne notieren.
n Den Streifen aus der Verpackung nehmen und in die Inkubationswanne legen.
Keimsuspension
Ein Röhrchen mit 3 ml sterilem Aqua dest.
Die Bakterien im Suspensionsmedium sorgfältig homogenisieren.
Trübung: milchig
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Beimpfung des Streifens:
n Diese Suspension mit der Pasteur Pipette in die Mikroröhrchen pipettieren.
Becherchen
Röhrchen
Becherchen und Röhrchen füllen
Röhrchen füllen
Beimpfen des API-Streifens
Paraffin
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Beimpfung des Streifens:
n Bei CIT Becherchen und Röhrchen füllen.
n Für die anderen Reaktionen nur Röhrchen füllen.
n Die unterstrichenen Reaktionen LDC, ODC, H2S
und URE hoch mit Paraffinöl überschichten.
n Die Inkubationswanne schließen und bei 37°C/ 24
Stunden inkubieren.
a) 1 Tropfen Oxidasereagenz auf die Bakterienkolonie geben. b) Bei positiver Reaktion tritt innerhalb von 1-2 Minuten eine dunkle blau-violette Färbung auf. C) Die Oxidasereaktion auf dem Ergebnisblatt als 11. Test notieren.
•negative Reaktionpositive Reaktion
Die Oxidasereaktion nach folgender Methode prüfen:
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Auswertung
Reagenzien eintropfen
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API 10 S
Auswertung der Übungsstämme
Aeromonas hydrophila
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Citrobacter freundii
Escherichia coli
19
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
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n ONPG: ß-Galactosidase spaltet o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG)
und weist daher auf die Lactoseverwertungsfähigkeit hin. Es wird
gelbes o-Nitrophenol aus farblosem ONPG freigesetzt. Die
Gelbverfärbung weist auf die positive Reaktion hin.
n GLUCOSE und ARABINOSE: Der Verbrauch von Kohlenhydrat führt zur
Säurebildung und einem anschließenden pH-Rückgang. Der Indikator
Bromthymolblau schlägt von blau nach gelb um. Die Fermentation der
Kohlenhydrate setzt in dem am stärksten anaeroben Teil (Boden) des
Röhrchens ein. Diese Reaktionen werden deshalb im Röhrchen von
unten nach oben abgelesen.
n LDC: Lysindecarboxylase baut Lysin zu Cadaverin ab. Dieses Amin
bewirkt einen pH-Anstieg in dem säuregepufferten System und ein
Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach orange.
n ODC: Ornithindecarboxylase wandelt Ornithin in Putrescin (ein
basisches Amin) um. Dies bewirkt einen pH-Anstieg und ein
Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach rot.
n CIT: Der Citratverbrauch bewirkt einen pH-Anstieg und ein
Umschlagen des Indikators Bromthymolblau von grün nach blau. Die
Citratverwertung weist auf einen positiven Ablauf der Reaktion hin.
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n H2S: Hier werden Bakterien nachgewiesen, die Schwefelwasserstoff aus
Thiosulfat bilden können. Schwefelwasserstoff reagiert mit Eisensalzen unter
Bildung eines schwarzen Präzipitates, die Lösung im Mikroröhrchen wird
schwarz.
n URE: Nachweis von Bakterien, die mit Hilfe der Urease Harnstoff in Kohlendioxid
und Ammoniak spalten können. Ammoniak bewirkt einen pH-Anstieg und ein
Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach rot. Jegliche Orange- oder
Rotfärbung weist auf den positiven Verlauf der Reaktion hin.
n TDA (Tryptophandesaminase) bildet aus Tryptophan Indolbrenztraubensäure, die
in Anwesenheit von Eisen-III-Chlorid einen bräunlich-roten Farbkomplex bildet.
Dies weist auf den positiven Reaktionsverlauf hin.
n IND: Der Abbau von Tryptophan führt zur Bildung von Indol. Indol und
Kovacs-Reagenz bilden einen gefärbten Komplex. Eine Rot- oder
Rosafärbung weist auf den positiven Verlauf der Reaktion hin. Die
Reaktion sollte innerhalb von 2 Minuten nach Zugabe des Reagenzes
abgelesen werden.
n NIT: Nitrite bilden mit Sulfanilsäure und N,N-Dimethyl-1-Naphthylamin
einen roten Komplex. Nach dem Ablesen der Glucose-Reaktion und
Kontrolle der Blasenbildung infolge der Nitratreduktion werden die
oben genannten Reagenzien zugesetzt. Bei positiver Reaktion tritt
Rotfärbung ein.
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BETRIEBS- UND PERSONALHYGIENE
n Eine mikrobiologische Kontrolle aller Oberflächen, mit denen
Lebensmittel bei der Ver- und Bearbeitung, Verpackung und dem
Transport in Berührung kommen, ist unbedingt notwendig.
Maschinen, Geräte, Finger, Hände, Türklinken usw. sollen einer
Stufenkontrolle unterzogen werden.
n Die auf sämtlichen Oberflächen befindlichen Keime können durch
Abklatsch-, Abstrich- oder Abschwemmverfahren erfasst werden.
Abklatschverfahren
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n Beim Abklatschverfahren (Rodac-Platten, Replicate Organism Detection
and Counting oder Folien) wird eine Agarnährbodenfläche auf die zu
untersuchende Oberfläche gedrückt.
n Zu starkes Andrücken muß wegen möglicher Rißbildung im Agar
vermieden werden.
n Die Keime der Untersuchungsfläche bleiben weitgehend auf dem
Nährboden haften.
n Der Nährboden wird dann bebrütet. Die abgeklatschten
Mikroorganismen entwickeln sich zu Kolonien, die gezählt und
ausgewertet werden.
Abklatschverfahren
n Die Rodacplatte ist so konstruiert, daß eine überstehende, konvexe
Nährbodenfläche zur Verfügung steht, die mit der zu untersuchenden
Fläche in Berührung gebracht wird.
n Der Deckel der Schale drückt nicht auf die Agarschicht und läßt einen
genügenden Luftraum über.
Abklatschverfahren
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Methoden zur Resistenzbestimmung
n Bestimmung des Hemmhofdurchmessers – Agardiffusionstest
n Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK, MIC) – Dilutionstest– E-Test
ANTIBIOGRAMM
n Die Resistenzprüfung von Erregern in vitro, auch
Empfindlichkeitsbestimmung genannt, ist deshalb
notwendig, weil die Empfindlichkeit vieler Bakterienarten
von Stamm zu Stamm wechselt und das Resistenzverhalten
nicht im voraus zu erkennen ist.
n Daraus ergibt sich die zwingende Notwendigkeit der
Resistenztestung zur vollständigen Befunderstellung.
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ANTIBIOGRAMM
n Durch die Testung erfolgt der Ausschluss jener Substanzen,
die schon in vitro nicht wirksam sind und damit für die
klinische Anwendung nicht in Frage kommen.
n Bezüglich der wirksamen Substanzen entscheiden dann
andere Parameter (Bioverfügbarkeit, Applikation, klin.
Aspekte, etc.) über deren Einsatz beim Patienten.
ANTIBIOGRAMM
n Eine Keimsuspension wird mittels eines Glasspatels
flächendeckend auf einem Nährboden aufgetragen.
n Mit einem Dispenser, der die Antibiotika-Testblättchen
enthält, werden diese Testblättchen auf den Agar
gedrückt.
n Die Probe wird nun 24 Stunden bei 37°C bebrütet und
dann ausgewertet.
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Agardiffusionstest
n Die Antibiotika diffundieren von dem aufgelegten imprägnierten
Filterpapierplättchen in das Agar und bewirken je nach Wirksamkeit
eine Hemmung des Bakterienwachstums um das Testplättchen
(Hemmhof).
n Bei Unwirksamkeit der Testsubstanz kommt es zu einem ungehinderten
Bakterienwachstum.
n Abhängig von der Größe des Hemmhofes und der
Wirkstoffkonzentration werden die Ergebnisse in "sensibel" (oder
empfindlich), "mäßig sensibel" und "resistent" (oder unempfindlich)
unterteilt.
Antibiotikaplättchen
n OXACILLIN OX
n CEFAZOLIN CZ
n TEICOPLAMIN TEC
n NORFLOXAIN NOR
n AMPICILLIN AM
n CEFLAZIDIM CAZ
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E. coli
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Kl. pneumoniae
Dilutionstest
Beim Reihenverdünnungstest wird eine geometrische Verdünnungsreihe des Antibiotikums hergestellt. In die einzelnen Röhrchen der Verdünnungsreihe werden gleiche Mengen der zu prüfenden Bakteriensuspension gegeben. Nach der Bebrütung wird festgestellt, bei welcher minimalen Antibiotikum-Konzentration kein makroskopisch sichtbares Bakterienwachstum mehr stattgefunden hat (MHK).
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Epsilometer-Test
BESTIMMUNG DER KEIMZAHL VON OBERFLÄCHEN UND LUFT
n Ü7: BESTIMMUNG DER KEIMZAHL VON OBERFLÄCHEN
(GRUPPENBEISPIEL)
n Ü8: BESTIMMUNG DER LUFTKEIMZAHL
(GRUPPENBEISPIEL)
n Ü 9: ANLEGEN EINES ANTIBIOGRAMMS
(GRUPPENBEISPIEL)
DO
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Ü7: OBERFLÄCHE
n Verschiedene Oberflächen (Arbeitsplatz,
Sterilbank, etc.) werden mittels Rodac
Platten abgeklatscht.
n Inkubation: 37°C, 1d; Auszählen der KBE
n Ergebnis:.................................
DO
Ü8: LUFT
n Impaktion-Verfahren
n Die zu untersuchende Luft wird mittels eines Zentrifugalsammlers angesaugt und durch einen Spalt auf einen im Inneren des Gerätes befindlichen Nährbodenstreifen aufgeschleudert.
n Verwendetes Gerät: Biotest-Luftkeimsammler (Abscheidevolumen 40 l/min)
n Nährbodenstreifen in den Zentrifugalsammler einlegenn ↓n Zentrifugalsammler 1 min betreibenn ↓n Nährbodenstreifen entnehmen und inkubieren: 37°C, 1dn ↓n Auszählen der KBEn Ergebnis: KBE/m3 = KBE x 1000:40 =...........................
DO
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Ü9: ANLEGEN EINES ANTIBIOGRAMMS0,1 ml einer Keimsuspension auf einer Agarplatte gleichmäßig mit einem Glasspatel verteilen und trocknen lassen.
↓
Mittels eines Dispensers werden die Antibiotikablättchen auf die Agaroberfläche aufgebracht.
↓
Inkubation: 37°C, 1 d
↓
Auswertung:
Antibiotikaresistenz →ungehindertes Bakterienwachstum
Hemmung des Bakterienwachstums →HemmhofbildungErgebnis: Hofbildung
Antibiotikum: +/-1...................................... ....................2...................................... ....................3...................................... ....................4...................................... ....................5...................................... ....................6...................................... ....................
DO
NICHT-KULTURELLE UND INDIREKTE KULTURELLE METHODEN
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Gaschromatographie (GC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
n Die Erstellung chemotaxonomischer Profile (Aminosäuren,
Fettsäuren, Kohlenhydrate) bietet neue, genaue und schnelle
Identifizierungsmöglichkeiten von Mikroorganismen.
n Fermentierende Bakterien, insbesondere Anaerobier, bilden
als Endprodukte ihres Kohlenstoff- und Energiestoffwechsels
verschiedene organische Verbindungen, die sich in
Nährmedien wie aber auch in Eiter und Exsudaten anreichern
und mittels HPLC oder GC nachweisen lassen.
n Die Art und Menge dieser Endprodukte sind gruppen- und
speziesspezifisch und somit von großer diagnostischer
Bedeutung.
Gaschromatographie (GC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
n Die Identifizierung von Bakterien mittels GC wird schon seit
langem zu diagnostischen und taxonomischen Studien
verwendet.
n Es handelt sich hierbei um den Nachweis eines
bakterienspezifischen Fettsäuremusters.
n Verschiedene Gattungen weisen unter standardisierten
Bedingungen ein gleichbleibendes, typisches Fettsäureprofil
auf.
n Die Art und Verteilung sowie die quantitativen Abweichungen
der vorliegenden Fettsäuren erlauben eine genaue
Charakterisierung der zu untersuchenden Mikroorganismen.
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Elektrophorese in der Diagnostik
Die elektrophoretische Differenzierung - in allen ihren
Variationen - und vor allem die Verwendung
elektrophoretischer Muster intrazellulärer löslicher Proteine,
deren Gehalt genetisch determiniert ist, führte in der
bakteriologischen Diagnostik zu einem zusätzlichen
Hilfsmittel in der Taxonomie der Mikroorganismen.
Elektrophorese in der Diagnostik
n Die gelelektrophoretische Auftrennung basiert auf der Abspaltung
eines Proteingemisches in seine Komponenten im elektrischen Feld
durch die unterschiedlichen Eigenladungen und Molekulargewichte
der einzelnen Fraktionen.
n Die Elektrophorese wird in verschiedenen Bereichen wie in der
medizinischen Diagnostik, der Lebensmittelanalyse, der Genetik
und der Mikrobiologie eingesetzt.
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PCR
n Bei dieser 1985 zum ersten Mal publizierten Methode ist es
möglich, Nukleinsäuremoleküle millionenfach identisch zu
vervielfachen, dadurch können kleine Mengen von
Nukleinsäuren und sogar einzelne Moleküle spezifisch
nachgewiesen werden.
n Diese Technik basiert auf einem 3-Schritt-Zyklus, gestartet
durch eine Hitzedenaturierung der zu untersuchenden DNS
und deren Umwandlung von einem Doppelstrang in einen
Einzelstrang.
PCR
n Im zweiten Schritt der Reaktion werden spezifische kurze Oligonukleotide (primer) in einer bestimmten Region an beide Stränge der Startnukleinsäure hybridisiert.
n Die hybridisierten Oligonukleotide werden nun von einer DNS-Polymerase durch Aneinanderfügen von Nukleotiden zu einem neuen DNS-Strang verlängert, der komplementär zur Ausgangssequenz ist.
n Durch Wiederholung dieser Vorgangsweise kann eine millionenfache Kopie eines DNS-Moleküls erreicht werden.
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Impedanzmessung
n Bei der Impedanzmessung, ein indirekt kulturelles Verfahren, werden
mikrobiell bedingte Widerstands- oder Leitfähigkeitsänderungen gemessen,
die bei der Vermehrung von Mikroorganismen durch entstehende
Stoffwechselprodukte in einem Wachstumsmedium auftritt.
n Wachsende Mikroorganismen produzieren Stoffwechselprodukte, welche bei
einer Anreicherung in einem flüssigen Medium zur Änderung des elektrischen
Widerstandes führen.
n Die Leitfähigkeit nimmt zu bzw. der Widerstand ab.
n Diese Änderungen werden allerdings erst registriert, wenn sich vermehrende
Mikroorganismen eine Zellzahl von etwa 106- 107/ml erreicht haben.
Direkte Epifluoreszent-Filter-Technik (DEFT)
n Die DEFT stellt eine verbesserte mikroskopische Gesamtkeim- bzw. Gesamtzellzahlbestimmung dar, wobei allerdings keine Unterscheidungen zwischen toten und vermehrungsfähigen bzw. stoffwechselaktiven Zellen möglich ist.
n Mikroskopische Zählung der in einem Nahrungsmittel vorhandenen Mikroorganismen nach Filtration durch Vorbehandlung filtrierbar gemachter Lebensmittelhomogenisate.
n Anschließend werden die auf dem Filter abgeschiedenen Mikroorganismen mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und im Fluoreszenzmikroskop ausgezählt. Die Methode wird zur raschen Keimzahlbestimmung innerhalb 30-45 min, insbesondere zur mikroskopischen Rohstoff- und Verarbeitungskontrolle, eingesetzt.
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Limulus polyphemus
Das Aktives Zentrum des Hämocyanins von Limulus polyphemus, dem Pfeilschwanzkrebs.
Limulus-Test (LAL)
n Der Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (LAL) ist eine sehr rasche,
hochempfindliche Methode zum quantitativen und qualitativen
Nachweis von Lipopolysacchariden gramnegativer Bakterien
(Endotoxinen) in flüssigen und festen Lebensmitteln.
n Das Blut des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus) gerinnt bei
einer Infektion mit gramnegativen Bakterien.
n Dabei kommt es zu einer Gelbildung zwischen Zellwandbestandteilen
(Lipopolysacchariden) dieser Bakterien und den Amöbozyten, den
einzigen Blutkörperchen des Limulus-Blutes.
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Limulus-Test (LAL)
n Die Amöbozyten enthalten Proenzyme und Agglutinationsenzyme.
n Bei Anwesenheit von Lipopolysacchariden werden die Proenzyme
aktiviert. Diese reagieren weiter mit den Agglutinationsenzymen unter
Gelbildung.
n Der Nachweis von Endotoxinen erfolgt aufgrund dieser Gelbildung.
n Der Nachweis von Endotoxinen erfolgt aufgrund dieser Gelbildung.
n Da zwischen der Endotoxinkonzentration und dem Keimgehalt eine
lineare Korrelation besteht, kann aufgrund des ermittelten
Endotoxingehaltes der Grad der Verunreinigung mit gramnegativen
Bakterien bestimmt werden
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