IENCIAS OSGRADO EN P C ENÓMICAS G Dr. César López Camarillo Laboratorio de Oncogenómica y...

IENCIASOSGRADO ENP

CENÓMICASG

Dr. César López CamarilloLaboratorio de

Oncogenómica y Proteómica del Cáncer

genomicas@yahoo.com.mx

Identificación y análisis funcional de microRNAs desregulados en cáncer mama

a secuencia del genoma humano se conoce desde febrero de 2001

L

3,200 millones de bases (3200 Mb)

Predice unos 20,000 - 25,000 genes (1.5% genoma !)

70% está compuesto por ADN extra-génico no codificante (DNA basura - microRNAs)

James Watson

Craig Venter

Jim Watson Craig Ventor

Examples of People Who Have had Their Genomes Sequenced

From: www.genciencia.comsciencewithmoxie.blogspot.com.au/2010_11_01_archive.html

James Watson Craig Venter Ozzy Osbourne

El Dogma Central de la Biología Molecular y los “omas” ACGTTATGAGACGGATTAGGACAAACTATAA

AAATATTAGCCGATGATCACCCAGGATTTTT

Transcript-oma (mRNA)

Prote-oma (Proteínas)

Gen-oma (DNA)

MicroRN-oma (miRNAs)

microRNAs: nuevos reguladores de la expresión genética

RNAm quecodifican proteínas

RNAs no codificantes

tRNA, rRNA, snRNAsnoRNAs

RNAs de mantenimientoRNAs reguladores de la expresión génica

siRNAs, lncRNA,

microRNAs

Transcritos

MicroRNAs: RNA pequeños (21-25 nt) que regulan negativamente la expresión genética.

Descritos en 1993 por Victor Ambros en

C. elegans.

Un microRNA puede modular hasta mas de 100 transcritos y proteínas diferentes

Los microRNAs son reguladores negativos de la expresión génica

miMicroRNA

Existen mas de 1000 miRNAs codificados en el genoma humano.Se desconoce la función de mas del 80% de los miRNAs.

Degradación del RNAm

Los genes que codifican a los microRNAs (>1000) se localizan dispersos en el genoma.

Se unen a la región 3´UTR de los RNAm (transcritos) e inhiben su traducción e inducen su degradación

Silenciamiento de la expresion génica

Gen miRNA

OncomiRs: microRNAs que funcionan como oncogenes y supresores de tumor

Un microRNA funciona como oncogén cuando inhibe genes que suprimen la proliferación, crecimiento tumoral, metástasis, o que activan

apoptosis

miR-21

PDCD4

miR-21

PDCD4

Apoptosis Cáncer

Autosuficiencia de las señales de crecimiento

Insensibilidad a las señales de anti-crecimiento

Potencial replicativo ilimitado

Invasión de tejidos y metástasis

Angiogénesis

Evasión de la apoptosis

Los microRNAs modulan los hallmarks del cáncer

Los microRNAs representan nuevos blancos terapéuticos en cáncer

La expresión de los miRNAs se alterafrecuentemente y contribuye a la carcinogénesis

Crecimiento exacerbado de los tejidos de la mama debido al aumento en la proliferación migración e invasión celular, así como la inhibición de la apoptosis .

Es la neoplasia con mayor incidencia y mortalidad en las mujeres.

Una muerte por cáncer de mama cada 2 h.

(80%)

(10%)

Cáncer de mama

Tumour, serum

Diferentially expressed onco-proteins

ProtemicsProtein quantification (2DE)Protein identification (MS/MS)

normal

tumoral Concordant protein/mRNA/miRNAexpression (Regulatory networks)

normal

tumoral

Transcriptomics DNA microarrayRNA seq

Differentially expressed omcogenic mRNA/miRNA

microRNAs profilingmiRNAs microarraysqRT-PCR arrays (TLDA)

Biomarker candidates

Validate proteins, mRNAsMicroarray tissues (IEQ)

Validation in patients

Prognosticmarkers

Functional analysisTherapeutic targets

Genómica integrativa (omics) en el descubrimiento de biomarcadores en cáncer

Congelación en N2 almacenamiento a -

80°C

Inmunohistoquímica ER, PR, HER2Banco de tejidos FUCAM

Cirugía

Sueros Biopsias

Búsqueda de microRNAs desregulados en cáncer de mama

Megaplex Primers TaqMan Low Density Arrays (TLDA)

667 microRNAs cuantificados en un solo paso

20 miRNAs sobrexpresados (37%)

34 miRNAs reprimidos (63%)

54 miRNAs modulados (FC ≥2.0 p=0.05)

Huella de expresión de 54 miRNAS y validación de TLDAs

MicroRNAs seleccionados para análisis funcional

miRNA Reportes Función Procesos y rutas celulares Blancos predichos

miR-944↓ (9/9)

Sobre-expresado en cáncer de cérvix

Induce migración Vía de señalización WNTVía de señalización de TGF-bGlioma, Cáncer colorectal

APC, AMOT, DLL4, IGF1R, JAG1, MAPK1, NF1, NEXN, PTP4A1, TAC1 THBS1, VEGFA,

miR-204↓ (9/9)

En cancer de mama, cancer endmetrial, glioma

Reprime migración y metástasis

ARID5B, BTG1, CD2AP, POU3F2, POU4F1, SIX4,

miR-18b↑ (9/9)

Reprimido en cáncer de prostata..

Regulación negativa del receptor HER2

MAPKBiosíntesis de glicanosUniones adherentesSeñalización Fc epsilon R1

HIF1A, IGF1, MAP3K1, PARD6B, KIT

Análisis funcional del miR-204 en cáncer de mama

M. en C. Ali Flores Pérez, UACM

La expresión del miR-204 se reprime en tumores y líneas celulares de cáncer de mama

Transfección del precursor miR-204 Supresión de los transcritos blanco de miR-204

Transcritos modulados por el miR-204

(DNA microarrays)

¿Genes regulados por el miR-204?

DNA microarrays Nimbelgen 12x135 (Roche)

135,000 probes3 probes per gene

45,032 genesOligos 60-mer

549 modulated genes by miR-204(FC≥2.0)

311 suppressed genes238 upregulated genes

miR-944 transfected

No transfected control

Procesos celulares en los que participan los genes modulados por el miR-204

Transfección del miR-204

¿ La restauración de la expresión del miR-204 modula los hallmarks del cáncer ?

Supresión de los transcritos blanco de miR-204

Análisis de fenotipos: migración, invasión,

proliferación, angiogénesis

El miR-204 inhibe migración de las células tumorales

Inserto

Membrana

Scratch/wound healing assays

Transwell assays

El miR-204 inhibe la proliferación celular

Clonogenic assays

El miR-204 reprime genes involucrados en angiogénesis

Agentes pro-angiogénicos

Agentes anti-angiogénicos

VEGFA Angiopoyetina 2

ANGPT1 Trombospondina

FGF (α y β) Interleucina 4, 12 y 18

TNF-α, interfereron α,β,γ

MMPs (2 y 9) Troponina-1

Angiogenina e Angiostatina

IL8

TGFβ/TGFBR

El miR-204 inhibe la angiogénesis in vitro

HUVECMDA-MB-231 HUVEC/VEGFA

HUVEC/MDA-MB-231miR-204HUVEC/MDA-MB-231-Sc

Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are cells derived from the endothelium of veins from the umbilical cord.

They are used for the study of the function and pathology of endothelial cells and angiogenesis.

Co-culture angiogenesis assays HUVEC/MDA-MB-231

¿ El miR-204 inhibe la angiogénesis a través de la represión del mRNA de los genes pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2 ?

3´UTR of miR-204 target

miR-204 In abscence of miR-204

3´UTR LUC assay

3´UTR ANGPT1

miR-204

El miR-204 se une a la región 3´UTR y reprime la expresión de ANGPT1 y TGFBR2

CONCLUSIONES:

Identificamos nuevos microRNAs desregulados en cáncer de mama de pacientes mexicanas

El miR-204 inhibe proliferación y la migración de la célula tumoral.

El miR-204 inhibe angiogénesis a través de la unión directa y desregulación del mRNA de los factores pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2

La restauración del miR-204 en tumores de pacientes podría considerarse como una estrategia útil en la terapia del cáncer de mama

Colaboradores

Dr. Sergio Rodríguez CuevasDra. Verónica BautistaInstituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM

Dr. Alfredo Hidalgo MirandaInstituto Nacional de Medicina Genómica, INMEGEN

Dra. Elena Arechaga OcampoDr. José Díaz ChávezDra. Erika Ruiz GarciaInstituto Nacional de Cancerología, InCan

Dra. Laurence Annie MarchatPrograma en Biomedicina Molecular, ENMyH-IPN

Dra. Ángeles Carlos-ReyesInstituto Nacional de Enfermedades Respiratorias

Dr. Patricio GariglioCINVESTAV-IPN

Fonsec Salud 2009-2012Fonsec Salud 2014-2017Ciencia Básica 2014-2017

Financiamiento

Se aceptan estudiantes de Maestría y Doctorado en Ciencias Genómicas !!

genomicas@yahoo.com.mx

Gracias por su atención

Biomarcadores tumorales en la clasificación y tratamiento del cáncer de mama

Marcadores tumorales(variables biológicas)

Receptor de estrógenos (ER)progesterona (PR) y HER2

Terapia hormonal Tamoxifeno (anti-ER)Ablación ováricaAnastrozol, LetrozolQuimioterapia

Terapia personalizadaTrastuzumab (anti-HER2)Tamoxifeno (anti-ER) Quimioterapia

Quimioterapia

Luminal A (50%)

Triple negativo (15-20%)

HER2(30%)

ER+, PR+, HER2+/- ER+, PR+, HER2+++ ER-, PR-, HER2-

ER

PR

HER2

Inmunohistoquímica

Variables clínicas pronósticas

Tamaño tumorNódulosMetástasis

microRNAs reprimidosmiR-139-5p miR-508-3p miR-10b* miR-944

miR-486-5p miR-100 miR-424* miR-125b-2*

miR-218 miR-541 miR-221* miR-337-3p

miR-369-3p miR-1 miR-26b* miR-95

miR-204 miR-216b miR-656 miR-488

miR-139-3p Let-7b miR-543 miR-335

miR-433 miR-489 miR-132* miR-195

miR-376c Let-7c miR-432

miR-132 miR-376a miR-10b

microRNAs sobreexpresadosmiR-155 miR-331-3p Let-7g* miR-188-5p

miR-708 miR-301a miR-454* miR-7

miR-130b miR-18b miR-183* miR-181a*

miR-21 miR-142-3p miR-592 miR-425*

miR-431 miR-142-5p miR-148b* miR-638

La expresión de 54 miRNAs se moduló significativamente en 9 tumores mamarios ductales

54 miRNAs se desregularon en los tumores mamarios

Los microRNAs regulan de manera negativa la expresión génica

López-Camarillo C., et al 2013