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IENCIASOSGRADO ENP
CENÓMICASG
Dr. César López CamarilloLaboratorio de
Oncogenómica y Proteómica del Cáncer
Identificación y análisis funcional de microRNAs desregulados en cáncer mama
a secuencia del genoma humano se conoce desde febrero de 2001
L
3,200 millones de bases (3200 Mb)
Predice unos 20,000 - 25,000 genes (1.5% genoma !)
70% está compuesto por ADN extra-génico no codificante (DNA basura - microRNAs)
James Watson
Craig Venter
Jim Watson Craig Ventor
Examples of People Who Have had Their Genomes Sequenced
From: www.genciencia.comsciencewithmoxie.blogspot.com.au/2010_11_01_archive.html
James Watson Craig Venter Ozzy Osbourne
El Dogma Central de la Biología Molecular y los “omas” ACGTTATGAGACGGATTAGGACAAACTATAA
AAATATTAGCCGATGATCACCCAGGATTTTT
Transcript-oma (mRNA)
Prote-oma (Proteínas)
Gen-oma (DNA)
MicroRN-oma (miRNAs)
microRNAs: nuevos reguladores de la expresión genética
RNAm quecodifican proteínas
RNAs no codificantes
tRNA, rRNA, snRNAsnoRNAs
RNAs de mantenimientoRNAs reguladores de la expresión génica
siRNAs, lncRNA,
microRNAs
Transcritos
MicroRNAs: RNA pequeños (21-25 nt) que regulan negativamente la expresión genética.
Descritos en 1993 por Victor Ambros en
C. elegans.
Un microRNA puede modular hasta mas de 100 transcritos y proteínas diferentes
Los microRNAs son reguladores negativos de la expresión génica
miMicroRNA
Existen mas de 1000 miRNAs codificados en el genoma humano.Se desconoce la función de mas del 80% de los miRNAs.
Degradación del RNAm
Los genes que codifican a los microRNAs (>1000) se localizan dispersos en el genoma.
Se unen a la región 3´UTR de los RNAm (transcritos) e inhiben su traducción e inducen su degradación
Silenciamiento de la expresion génica
Gen miRNA
OncomiRs: microRNAs que funcionan como oncogenes y supresores de tumor
Un microRNA funciona como oncogén cuando inhibe genes que suprimen la proliferación, crecimiento tumoral, metástasis, o que activan
apoptosis
miR-21
PDCD4
miR-21
PDCD4
Apoptosis Cáncer
Autosuficiencia de las señales de crecimiento
Insensibilidad a las señales de anti-crecimiento
Potencial replicativo ilimitado
Invasión de tejidos y metástasis
Angiogénesis
Evasión de la apoptosis
Los microRNAs modulan los hallmarks del cáncer
Los microRNAs representan nuevos blancos terapéuticos en cáncer
La expresión de los miRNAs se alterafrecuentemente y contribuye a la carcinogénesis
Crecimiento exacerbado de los tejidos de la mama debido al aumento en la proliferación migración e invasión celular, así como la inhibición de la apoptosis .
Es la neoplasia con mayor incidencia y mortalidad en las mujeres.
Una muerte por cáncer de mama cada 2 h.
(80%)
(10%)
Cáncer de mama
Tumour, serum
Diferentially expressed onco-proteins
ProtemicsProtein quantification (2DE)Protein identification (MS/MS)
normal
tumoral Concordant protein/mRNA/miRNAexpression (Regulatory networks)
normal
tumoral
Transcriptomics DNA microarrayRNA seq
Differentially expressed omcogenic mRNA/miRNA
microRNAs profilingmiRNAs microarraysqRT-PCR arrays (TLDA)
Biomarker candidates
Validate proteins, mRNAsMicroarray tissues (IEQ)
Validation in patients
Prognosticmarkers
Functional analysisTherapeutic targets
Genómica integrativa (omics) en el descubrimiento de biomarcadores en cáncer
Congelación en N2 almacenamiento a -
80°C
Inmunohistoquímica ER, PR, HER2Banco de tejidos FUCAM
Cirugía
Sueros Biopsias
Búsqueda de microRNAs desregulados en cáncer de mama
Megaplex Primers TaqMan Low Density Arrays (TLDA)
667 microRNAs cuantificados en un solo paso
20 miRNAs sobrexpresados (37%)
34 miRNAs reprimidos (63%)
54 miRNAs modulados (FC ≥2.0 p=0.05)
Huella de expresión de 54 miRNAS y validación de TLDAs
MicroRNAs seleccionados para análisis funcional
miRNA Reportes Función Procesos y rutas celulares Blancos predichos
miR-944↓ (9/9)
Sobre-expresado en cáncer de cérvix
Induce migración Vía de señalización WNTVía de señalización de TGF-bGlioma, Cáncer colorectal
APC, AMOT, DLL4, IGF1R, JAG1, MAPK1, NF1, NEXN, PTP4A1, TAC1 THBS1, VEGFA,
miR-204↓ (9/9)
En cancer de mama, cancer endmetrial, glioma
Reprime migración y metástasis
ARID5B, BTG1, CD2AP, POU3F2, POU4F1, SIX4,
miR-18b↑ (9/9)
Reprimido en cáncer de prostata..
Regulación negativa del receptor HER2
MAPKBiosíntesis de glicanosUniones adherentesSeñalización Fc epsilon R1
HIF1A, IGF1, MAP3K1, PARD6B, KIT
Análisis funcional del miR-204 en cáncer de mama
M. en C. Ali Flores Pérez, UACM
La expresión del miR-204 se reprime en tumores y líneas celulares de cáncer de mama
Transfección del precursor miR-204 Supresión de los transcritos blanco de miR-204
Transcritos modulados por el miR-204
(DNA microarrays)
¿Genes regulados por el miR-204?
DNA microarrays Nimbelgen 12x135 (Roche)
135,000 probes3 probes per gene
45,032 genesOligos 60-mer
549 modulated genes by miR-204(FC≥2.0)
311 suppressed genes238 upregulated genes
miR-944 transfected
No transfected control
Procesos celulares en los que participan los genes modulados por el miR-204
Transfección del miR-204
¿ La restauración de la expresión del miR-204 modula los hallmarks del cáncer ?
Supresión de los transcritos blanco de miR-204
Análisis de fenotipos: migración, invasión,
proliferación, angiogénesis
El miR-204 inhibe migración de las células tumorales
Inserto
Membrana
Scratch/wound healing assays
Transwell assays
El miR-204 inhibe la proliferación celular
Clonogenic assays
El miR-204 reprime genes involucrados en angiogénesis
Agentes pro-angiogénicos
Agentes anti-angiogénicos
VEGFA Angiopoyetina 2
ANGPT1 Trombospondina
FGF (α y β) Interleucina 4, 12 y 18
TNF-α, interfereron α,β,γ
MMPs (2 y 9) Troponina-1
Angiogenina e Angiostatina
IL8
TGFβ/TGFBR
El miR-204 inhibe la angiogénesis in vitro
HUVECMDA-MB-231 HUVEC/VEGFA
HUVEC/MDA-MB-231miR-204HUVEC/MDA-MB-231-Sc
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are cells derived from the endothelium of veins from the umbilical cord.
They are used for the study of the function and pathology of endothelial cells and angiogenesis.
Co-culture angiogenesis assays HUVEC/MDA-MB-231
¿ El miR-204 inhibe la angiogénesis a través de la represión del mRNA de los genes pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2 ?
3´UTR of miR-204 target
miR-204 In abscence of miR-204
3´UTR LUC assay
3´UTR ANGPT1
miR-204
El miR-204 se une a la región 3´UTR y reprime la expresión de ANGPT1 y TGFBR2
CONCLUSIONES:
Identificamos nuevos microRNAs desregulados en cáncer de mama de pacientes mexicanas
El miR-204 inhibe proliferación y la migración de la célula tumoral.
El miR-204 inhibe angiogénesis a través de la unión directa y desregulación del mRNA de los factores pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2
La restauración del miR-204 en tumores de pacientes podría considerarse como una estrategia útil en la terapia del cáncer de mama
Colaboradores
Dr. Sergio Rodríguez CuevasDra. Verónica BautistaInstituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM
Dr. Alfredo Hidalgo MirandaInstituto Nacional de Medicina Genómica, INMEGEN
Dra. Elena Arechaga OcampoDr. José Díaz ChávezDra. Erika Ruiz GarciaInstituto Nacional de Cancerología, InCan
Dra. Laurence Annie MarchatPrograma en Biomedicina Molecular, ENMyH-IPN
Dra. Ángeles Carlos-ReyesInstituto Nacional de Enfermedades Respiratorias
Dr. Patricio GariglioCINVESTAV-IPN
Fonsec Salud 2009-2012Fonsec Salud 2014-2017Ciencia Básica 2014-2017
Financiamiento
Se aceptan estudiantes de Maestría y Doctorado en Ciencias Genómicas !!
Gracias por su atención
Biomarcadores tumorales en la clasificación y tratamiento del cáncer de mama
Marcadores tumorales(variables biológicas)
Receptor de estrógenos (ER)progesterona (PR) y HER2
Terapia hormonal Tamoxifeno (anti-ER)Ablación ováricaAnastrozol, LetrozolQuimioterapia
Terapia personalizadaTrastuzumab (anti-HER2)Tamoxifeno (anti-ER) Quimioterapia
Quimioterapia
Luminal A (50%)
Triple negativo (15-20%)
HER2(30%)
ER+, PR+, HER2+/- ER+, PR+, HER2+++ ER-, PR-, HER2-
ER
PR
HER2
Inmunohistoquímica
Variables clínicas pronósticas
Tamaño tumorNódulosMetástasis
microRNAs reprimidosmiR-139-5p miR-508-3p miR-10b* miR-944
miR-486-5p miR-100 miR-424* miR-125b-2*
miR-218 miR-541 miR-221* miR-337-3p
miR-369-3p miR-1 miR-26b* miR-95
miR-204 miR-216b miR-656 miR-488
miR-139-3p Let-7b miR-543 miR-335
miR-433 miR-489 miR-132* miR-195
miR-376c Let-7c miR-432
miR-132 miR-376a miR-10b
microRNAs sobreexpresadosmiR-155 miR-331-3p Let-7g* miR-188-5p
miR-708 miR-301a miR-454* miR-7
miR-130b miR-18b miR-183* miR-181a*
miR-21 miR-142-3p miR-592 miR-425*
miR-431 miR-142-5p miR-148b* miR-638
La expresión de 54 miRNAs se moduló significativamente en 9 tumores mamarios ductales
54 miRNAs se desregularon en los tumores mamarios
Los microRNAs regulan de manera negativa la expresión génica
López-Camarillo C., et al 2013
