Immunisierung, Antikörperproduktion (Fermentation...

ImmunisierungImmunisierung, , AntikAntiköörperproduktionrperproduktion ((FermentationFermentation), ), ReinigungReinigung, , MarkierungMarkierungHybridomHybridom--TechnikTechnik

UniversUniversititäätt PPéécscs,, MedizinischeMedizinische FaFakkululttäättInstitutInstitut ffüürr ImmunologImmunologieie uundnd BiotechnologBiotechnologieie

MonoklonaleMonoklonale AntikAntiköörper:rper: werden von einer auf einen werden von einer auf einen einzigen Beinzigen B--Lymphozyten zurLymphozyten zurüückgehenden Zelllinie (Zellklon) ckgehenden Zelllinie (Zellklon) produziert und richten sich gegen ein einzelnes produziert und richten sich gegen ein einzelnes EpitopEpitop..

PolyklonalePolyklonale AntikAntiköörper:rper: Es handelt sich um ein Gemisch Es handelt sich um ein Gemisch mehrerer verschiedener Antikmehrerer verschiedener Antiköörper unterschiedlicher rper unterschiedlicher SpezifitSpezifitäätt, die verschiedene , die verschiedene EpitopeEpitope eines bestimmten eines bestimmten Antigens erkennen und daran binden.Antigens erkennen und daran binden.

Antikörper erkennen einzelne Epitope(Antigendeterminante)

Das komplexe Antigen löst eine polyklonaleImmunantwort aus, die zur Bildungverschiedener Antikörper führt

ImmunisierungImmunisierung 1.1.

AuswahlAuswahl desdes geignetengeigneten TieresTieres::MonoklonalerMonoklonaler AntikAntiköörperrper –– MausMaus oderoder RatteRattePolyklonalerPolyklonaler AntikAntiköörperrper –– KaninchenKaninchen, , SchafSchaf, , ZiegeZiege

AntigenAntigen: : HaptenHapten (5(5--10 10 kDkD >) >) –– TrTräägergernativenative / / modifiziertemodifizierte MolekMoleküülele ((GabeGabe: : muskulmuskuläärr, , subkutansubkutan oderoder intrakutanintrakutan) ) oderoder ZellenZellen ((GabeGabe: : iviv. . oderoderipip..)

ImmunisierungImmunisierung

Das Antigen (der Carrier-Hapten-Komplex) induziert die Bildung von Antikörpern mit unterschiedlicher Spezifität

ANTIKÖRPER

Antigen(Träger + Hapten)

Träger + Hapten-spezifische AK

Träger-spezifische AK

Hapten-spezifische AK

ImmunisierungImmunisierung 2.2.

AdjuvantAdjuvant (Hilfsmittel):(Hilfsmittel): verlangsamen die Aufnahme des Antigens verlangsamen die Aufnahme des Antigens und verursachen die unspezifische Stimulierung des und verursachen die unspezifische Stimulierung des Immunsystems (Immunsystems (MakrophagenaktivierungMakrophagenaktivierung) )

Am hAm hääufigsten gebraucht:ufigsten gebraucht:inkompletter inkompletter AdjuvantAdjuvant,, auf Mineralauf Mineralööll--Basis, (z.B.: inkomplett: Basis, (z.B.: inkomplett: HegedHegedűűss, Freund), Freund)Kompletter Freund Kompletter Freund AdjuvantAdjuvant: abget: abgetöötetes tetes MycobacteriumMycobacteriumtuberculosistuberculosis in Mineralin Mineralööll--EmulsionEmulsionAluminiumAluminium--HydroxidHydroxid GelGelMuramilMuramil--DipeptideDipeptide ((MycobacteriumMycobacterium tuberculosistuberculosis ))Bakterielle Bakterielle ImpImpffstoffestoffe, die gleichzeitig gegeben werden, erh, die gleichzeitig gegeben werden, erhööhen die hen die AntikAntiköörperproduktion gegen das rperproduktion gegen das ImmunogenImmunogen z.B.: z.B.: BorBordatelladatellapertussispertussisLiposomenLiposomen

Kinetik der Antikörperproduktion

AntikAntiköörperreinigungrperreinigung 1.1.

AntikAntiköörper werden als Serum rper werden als Serum ausaus TierenTieren gewonnen.gewonnen.KlKläärungrung: :

IgMIgM::•• GewinnungGewinnung derder IgIg--FraktionFraktion mit mit chemischenchemischen

MethodenMethoden: : aufauf MolekMoleküülgewicht und lgewicht und LLööslichkeitslichkeitbasierendbasierend

•• GewinnungGewinnung beibei niedrigerniedriger IonkonzentrationIonkonzentration((„„euglobulineuglobulin precipitationprecipitation””) )

•• Wir kWir köönnen nnen reireinnereere AusflockungAusflockung erhalten, wenn wir erhalten, wenn wir BorsBorsääuredyalisisuredyalisis anwendenanwenden

•• Weitere Reinigung mit Weitere Reinigung mit GelchromatographieGelchromatographie•• KonzentrationsgradientKonzentrationsgradientenen--zentrifugierungzentrifugierung

AntikAntiköörperreinigungrperreinigung 2.2.

IgGIgG::•• beibei pH 6.4 pH 6.4 wirdwird sichsich nachnach derder ZugabeZugabe vonvon 1.39 M 1.39 M

(NH(NH44))22SOSO4 4 niederschlagenniederschlagen•• Nach Nach demdem NiederschlagNiederschlag mit mit RivanolRivanol bleibt das bleibt das IgGIgG

und das und das TransferrinTransferrin in gelin gelööster Form, der andere ster Form, der andere Proteinbestandteil Proteinbestandteil scheidetscheidet sichsich ausaus

•• IonaustauschchromatographieIonaustauschchromatographie•• AffinitAffinitäätschromatographietschromatographie ((StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus

Protein A, Protein A, StreptococcusStreptococcus Protein G)Protein G)

AntikAntiköörperreinigungrperreinigung 3.3.

IgAIgA, D, E:, D, E: MethodenMethoden inin mehrerenmehreren SchrittenSchrittenIgAIgA:: nachnach AusflockungAusflockung mit mit ZnZn; ; IonaustauschchromatographieIonaustauschchromatographie und und GelfiltrationGelfiltrationIgEIgE:: AffinitAffinitäätschromatographietschromatographie mit mit ConAConA

ImmunosorbenteImmunosorbente MethodenMethoden:: spezifische spezifische AntigenAntigenisolierungisolierung auf der Oberflauf der Oberflääche deche dessSepharoseSepharose--, Zellulose, Zellulose-- oder oder PPolyacrylamidolyacrylamideegelgelss

AntikAntiköörperrper--TestungTestung

Die PrDie Prüüfung des fung des TitersTiters und der und der SpezifizitSpezifizitäätt sollte im gleichen Systemsollte im gleichen Systemdurchgefdurchgefüührt werden, in dem der Antikhrt werden, in dem der Antiköörper aufgetragen rper aufgetragen wirdwird..

z.Bz.B.: ELISA.: ELISADurchflusszytometrieDurchflusszytometrieImmunohistochemieImmunohistochemie

HybridomtechnikHybridomtechnik

Georges Koehler

Cesar Milstein

1981985:5:NobelNobel--PrPreiseis

HybridomtechnikHybridomtechnik, , ProduzierungProduzierung desdesmonoklonalenmonoklonalen AntikAntiköörpersrpers

DefDef.:.: Mit der Mit der HybridomtechnikHybridomtechnik kköönnen spezifische nnen spezifische aktivierte Immunzellen mit begrenzter aktivierte Immunzellen mit begrenzter Lebenserwartung zur AntikLebenserwartung zur Antiköörperproduktion rperproduktion ausgewausgewäählthlt werdenwerden, , in in vitrovitro ffüür unbeschrr unbeschräänkte nkte ZeitdauerZeitdauer am Leben gehalten und zur am Leben gehalten und zur ProliferationProliferationffäähig gemacht werden hig gemacht werden

Die Grundlage der Technik ist, dass wir Die Grundlage der Technik ist, dass wir in in vitrovitro eine eine aktivierte Immunzelle mit einer Tumorzelle fusionieren aktivierte Immunzelle mit einer Tumorzelle fusionieren (vereinigen) lassen.(vereinigen) lassen.

PlasmazelleMyelome

Hybridome

AntikörperproduktionUnsterblichkeit

unsterbliche, Antikörperproduzierende Zellen

HybridomproduktionHybridomproduktion 1.1.

1.1. Zellfusionierung:Zellfusionierung: Milzzelle (von immunisiertem Tier) + Milzzelle (von immunisiertem Tier) + unsezernierteunsezernierte MausmyelomzelleMausmyelomzelle (Sp(Sp--2/02/0--Ag14) + PEGAg14) + PEG

2.2. Selektion:Selektion: Selektion des gewSelektion des gewüünschten Hybridnschten Hybridee (Milzzelle (Milzzelle ––MyelomaMyeloma) )

HGPRTHGPRT-- und und TKTK--EnzymeEnzyme (Synthesis von (Synthesis von PurinPurin und und PyrimidinPyrimidin) fehlen in den Sp) fehlen in den Sp--2 Zellen, aber die Milzzellen 2 Zellen, aber die Milzzellen verfverfüügen gen üüber sie, so kber sie, so köönnen wir durch den Gebrauch von nnen wir durch den Gebrauch von einem einem selektiven Nselektiven Näährmedium (HAT)hrmedium (HAT) die Milzzelle die Milzzelle -- Sp2 Sp2 Hybriden auswHybriden auswäählen.hlen.

HGPRT: HGPRT: „„HypoxanthineHypoxanthine--guanineguanine phosphorybosilphosphorybosil transferasetransferase””TK: TK: „„ThymidineThymidine KinaseKinase””HAT: HAT: HypoxanthinHypoxanthin--AminopterinAminopterin--ThymidineThymidine

HybridomproduktionHybridomproduktion 2.2.

3.3. AuswAuswäählenhlen derder HybridkulturenHybridkulturen, , diedie AntikAntiköörperrperproduzierenproduzieren

4.4. DieDie AntikAntiköörperproduktionrperproduktion kannkann mit ELISA mit ELISA getestetgetestetwerdenwerden

5.5. KlonenKlonen:: VerdVerdüünnungnnung derder AntikAntiköörperrper produzierendenproduzierendenZellenZellen auf einer 96 auf einer 96 wellwell--PlattePlatte soso, , dassdass inin einein WellWell nurnureineeine einzigeeinzige ZelleZelle kommtkommt. .

6.6. WiederholtesWiederholtes Testen Testen derder AntikAntiköörperproduktionrperproduktion derderMonoklonenMonoklonen, , derder AntikAntiköörperrper, , diedie durch einen einzelnen durch einen einzelnen Klon der Zellen produziertKlon der Zellen produziert werdenwerden ((monoklonalemonoklonaleAntikAntiköörperrper).).

7.7. AntikAntiköörperproduktionrperproduktion inin grogroßßerer MengeMenge: (1) : (1) ProduktionProduktiondesdes HybridomsupernatantesHybridomsupernatantes inin vitrovitro; ; (2) (2) GabeGabe derderHybridomzellenHybridomzellen ipip. . inin MausMaus; (3) ; (3) FermentorFermentor..

SchritteSchritte derderHybridomHybridom--produktionproduktion

AnwendungAnwendung derder monoklonalenmonoklonalenAntikAntiköörperrper

ModerneModerne RoutinemethodenRoutinemethoden derder LabordiagnostikLabordiagnostikImmunhistochemisheImmunhistochemishe MethodenMethoden: : MarkierungMarkierung (CD) (CD) und und Lokalisierung der Lokalisierung der LymphozyteLymphozytennuntergruppenuntergruppen ((BlutBlut, , GewebeGewebe),), TumordiagnostischeTumordiagnostische ZweckeZweckeDurchflusszytometrieDurchflusszytometrie (FACS)(FACS)ProteinreinigungProteinreinigungInIn vivovivo TumorTumor-- und und ImmuntherapieImmuntherapie

HumanisierteHumanisierte AntikAntiköörperrper 1.1.

TherapeutischeTherapeutische monoklonalemonoklonale AntikAntiköörperrper

DieDie verwendetenverwendeten AntikAntiköörperrper derder MausMaus ((murinemurine AntikAntiköörperrper, , EndungEndung: : --omabomab) ) wirkenwirken imim menschlichenmenschlichen OrganismusOrganismus selbstselbstalsals AntigenAntigen und und kköönnennnen eineeine gegengegen siesie gerichtetegerichteteImmunantwortImmunantwort auslauslöösensen (HAMA= (HAMA= HumanHuman AntimausAntimaus--AntikAntiköörperrper).).ModifizierteModifizierte AntikAntiköörperrper ffüürr diedie therapeutischetherapeutische AnwendungAnwendungEsEs istist inin denden letztenletzten JahrenJahren gelungengelungen, , modifiziertemodifizierte, , dendenmenschlichenmenschlichen AntikAntiköörpernrpern besserbesser angepassteangepasste monoklonalemonoklonaleAntikAntiköörperrper zuzu entwickelnentwickeln.

HumanisierteHumanisierte AntikAntiköörperrper

Fab

Fc

CDR

CDR= Hypervariable Region (Abschnitt)

Therapeutische Anwendungen von humanisierten Antikörpern

Immunsuppression bei Organtransplantation –Entfernung von aktivierten T-Zellen (a-CD3, a-CD25)

Lymphomatherapie – a-CD20

Immunsuppression bei Autoimmunkrankheiten –a-TNFα