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Prof.Doutor José Cabeda Imunologia
Métodos Celulares
Prof.Doutor José Cabeda Imunologia
Células Sanguíneas
Prof. Doutor José Cabeda Imunologia
MacrofagosMonócitos
NeutrófilosPMN
Eosinófilos
Basófilos
Linfócitos
plaquetas
eritrócitos
Células do S.I.
Outras células do Sangue
T
B
NK
CD4
CD8
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Purificação de células do sistema Imunológico
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Cell Separation Technologies
CentrifugationCentrifugation : Density : Density FiltrationFiltration : Size : Size Flow Cytometry (FACS)Flow Cytometry (FACS)
SizeSize Granularity Granularity Fluorescence Fluorescence
Batch affinity systemsBatch affinity systems : antibody, avidin-biotin : antibody, avidin-biotin Batch magnetic systemsBatch magnetic systems
Paramagnetic differenceParamagnetic difference
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Separação em gradiente de densidade
Numa centrifugação sedimentam primeiro as Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentaras menos densas de sedimentar
Ficol: polisacarideo Ficol: polisacarideo Agrega eritrócitos tornando-os mais densosAgrega eritrócitos tornando-os mais densos
Metrizamida (composto denso contendo iodo)Metrizamida (composto denso contendo iodo) Densidade ajustável em função da concentraçãoDensidade ajustável em função da concentração
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Separação em Gradiente descontínuo de densidade
density
Ficoll-hypaque
PBMC
Soroplaquetas
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Separação em gradiente contínuo de densidade (II)
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Separação Imunomagnética
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Two-StepLabeling
One-StepLabeling
Immunomagnetic Labeling of Cells
Cell
Magnetic bead
Target antigen
FITC
Antibody (IgG)
Cell
PBL
HER-2/neu
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Paramagnetic particles Large sizeLarge size
1 to 5 um in diameter1 to 5 um in diameter
Magnetic susceptibility Magnetic susceptibility of a cell: High of a cell: High
Small number of beads Small number of beads per cellper cell 1- 10 beads/cell1- 10 beads/cell
Commercially availableCommercially available
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Paramagnetic colloidal beads
Colloidal sizeColloidal size 50 to 200 nm50 to 200 nm Spread in solution Spread in solution
(Brownian Motion)(Brownian Motion)
Magnetic susceptibility of a Magnetic susceptibility of a cell: Low cell: Low
Large number of beads per cellLarge number of beads per cell 100 - 100,000 beads/cell100 - 100,000 beads/cell
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Molecular Magnetic Labeling Erbium ion (ErErbium ion (Er3+3+))
Paramagnetic ionParamagnetic ion High atomic magnetic dipole momentHigh atomic magnetic dipole moment Ionic binding to the cell surfaceIonic binding to the cell surface
Ferritin Ferritin Paramagnetic proteinParamagnetic protein Hollow protein shell (13 nm)Hollow protein shell (13 nm) Deposition of FeDeposition of Fe22OO3 3 the cavity (7 nm)the cavity (7 nm)
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Magnetic Labeling
Paramagnetic
particle
Paramagnetic
colloidal beads
Molecular
magnetic labels
Size 1 – 5 µm 50-200 nm < 15 nm
Cell's magnetic
susceptibilityHigh Medium Low
Labeling
methodImmunological Immunological
Ionic
Immunological
Number per cell 1 - 10 100 - 100,000 > 100,000 ?
Commercially
availableYes Yes No
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Cell Separation Based on Antigen Expression Level
Antigen Expression LevelF
ract
ion
(-)
Antigen Expression Level
Fra
ctio
n (
-)
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MACS® Cell separation system
Magnet
magnetic cellnon-magnetic cell
Plunger
Remove the magnet
Unlabeled cells
Immunomagnetically labeled cells
Separationcolumn
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HG4100® Cell Separation system
ResuspensionAspirationIncubation
magnetic cellnon-magnetic cell
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Quadrupole Magnetic Flow Sorter (QMS)
Cell feed CarrierCarrier
QMS
ba
Waste
a’ b’
NS
a’b’
ab
v
Outlet flow splitter
Inlet flow splitter
Core rod
Ma
gn
et
Ma
gn
et
Unlabeled cellLabeled cell
Cell feed CarrierCarrier
QMS
ba
Waste
a’ b’
NS
a’b’
ab
v
Outlet flow splitter
Inlet flow splitter
Core rod
Ma
gn
et
Ma
gn
et
Unlabeled cellLabeled cell
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High Gradient Magnetic Separator (HGMS)
Separator MACS HG4100 QMS
OperationSemi-flow-
throughBatch Flow-through
Holding
material
Iron spheres
or wiresTest tube wall N/A
Cell
accumulationYes Yes No
Applicable
cell size
Narrow
(small cells)Middle Wide
Flow control No N/A Yes
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Cell Separation by the QMS
-
-
--
-
--
--
----
--
--
-
+
+ ----
--
++
++
--
-
+
+
----
--
+
+
+ +
+
+ +
+
Fm
a' b'
a bA
xial
Sym
met
ry
MA
GN
ETFm
a' b'
a bA
xial
Sym
met
ry
MA
GN
ET
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Lymphocyte cell separation by the QMS
6%
38%
96%
CD4+ cells
38%26%
6%12% 99%
CD8+ cells
a b a b
Feed Feed
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CD34 cell isolation by the QMS
0.67%
0.02%
88.5%
Feed
b
a
Total cell load = 2 x108 cells; CD34 cell recovery = 81%; Throughput = 1.75 x 105 cells/s
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Colony Formation from CD34+ Cells
CFU-GMBFU-E
CFU-Mix
CD34+ cells
(immature)
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PANNING
Aderência celular a uma superfície sólidaAderência celular a uma superfície sólida Monócitos e macrófagos são naturalmente Monócitos e macrófagos são naturalmente
aderentesaderentes Outras células podem aderir se a superfície Outras células podem aderir se a superfície
estiver conjugada com anticorpos estiver conjugada com anticorpos apropriadosapropriadosPanning directoPanning directoPanning indirectoPanning indirecto
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Purificação positiva e negativa
Purificação PositivaPurificação Positiva PanningPanning Imuno-separação magnéticaImuno-separação magnética Centrifugação gradiente densidadeCentrifugação gradiente densidade Centrifugal elutriationCentrifugal elutriation Formação de rosetasFormação de rosetas Citometria de FluxoCitometria de Fluxo
Purificação NegativaPurificação Negativa Todos os anterioresTodos os anteriores Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complementoCitotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento
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Rosetas
Nos anos 70Nos anos 70 Linfócitos T formam rosetas com SRBCLinfócitos T formam rosetas com SRBC
Melhor rendimento se:Melhor rendimento se:• SRBC tratados c/ neuraminidaseSRBC tratados c/ neuraminidase• SRBC tratados c/ AET SRBC tratados c/ AET
(2-aminoethylisothiouronium bromide)(2-aminoethylisothiouronium bromide) Método barato mas pouco prático e de baixo Método barato mas pouco prático e de baixo
rendimentorendimento
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Método de lise mediada pelo complemento
Selecção negativa de célulasSelecção negativa de células Passos:Passos:
Marcação das células a eliminar c/ anticorposMarcação das células a eliminar c/ anticorpos Indução da lise celular c/ complemento de Indução da lise celular c/ complemento de
coelhocoelho
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Selecção negativa c/ L-LME
L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado nos lisosomas originando um metabolito tóxiconos lisosomas originando um metabolito tóxico
Colocando as células em contacto c/ L-LME, os Colocando as células em contacto c/ L-LME, os monócitos e NK são destruídosmonócitos e NK são destruídos
Separar as células mortas com lymphoprepSeparar as células mortas com lymphoprep
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Isolamento de linfócitos de orgãos linfóides secundários As células estão fracamente agregadasAs células estão fracamente agregadas São separáveis por acção mecânicaSão separáveis por acção mecânica
Forçar o tecido a passar repetidamente Forçar o tecido a passar repetidamente por uma malha de aço finopor uma malha de aço fino
Utilizar a suspensão celular obtida, Utilizar a suspensão celular obtida, depois de purificada por lymphoprepdepois de purificada por lymphoprep
Descartar os restos de tecido Descartar os restos de tecido
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Análise de Células
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Estudo de populações celulares por Citometria de fluxo
Utilização de CD14/CD45 para definir a Utilização de CD14/CD45 para definir a população de linfócitospopulação de linfócitos
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Efeito de um “gating” correcto
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Estudo de activação linfocitária (I) Método de ActivaçãoMétodo de Activação
Antigénio especifico Antigénio especifico pouco útil para culturas de linfócitos humanospouco útil para culturas de linfócitos humanos Requer activação in vitro para enriquecimento prévioRequer activação in vitro para enriquecimento prévio
MitogénioMitogénio Concanavalina A (ConA)Concanavalina A (ConA) Phytohemaglutinina (PHA)Phytohemaglutinina (PHA) Proteina A de staphylococcusProteina A de staphylococcus Pokweed mitogenPokweed mitogen
Anticorpos / InterleuquinasAnticorpos / InterleuquinasCélulas T• CD3• CD2• CD28• TCR
Células B• IgM• CD20
T+B•Ionoforo A23187•Ionomicina•Ester de forbol•IL-2•IL-4
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Estudo de activação linfocitária (II)
RadioactividadeRadioactividade 33H-dTTP (H-dTTP (Incorpora-se no DNA em cada divisão)Incorpora-se no DNA em cada divisão)
Bromo desoxi-uridina (BrdU)Bromo desoxi-uridina (BrdU) Incorpora-se no DNA em cada divisãoIncorpora-se no DNA em cada divisão É Fluorescente É Fluorescente Detectável por Citometria de fluxo Detectável por Citometria de fluxo
Medida da [CaMedida da [Ca2+2+] intracelular] intracelular O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da
activação celularactivação celular
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Medida da actividade citotoxica Incubação das células alvo (linhas tumorais) com Incubação das células alvo (linhas tumorais) com
5151CrCr Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell
mediated citotoxicity) as células alvo devem estar mediated citotoxicity) as células alvo devem estar sensitizadas com anticorposensitizadas com anticorpo
Incubação das células alvo com as NK/LAKIncubação das células alvo com as NK/LAK Medida da radioactividade libertada no Medida da radioactividade libertada no
sobrenadante da culturasobrenadante da cultura
%100% xbc
balise
a=lise experimental cpm (efector + alvo)b=lise espontânea cpm (meio+alvo)c=lise máxima (SDS+alvo)
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