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2015
Ms. Romeu Moreira dos Santos
2016
unespunesp
IMUNOVIRIMUNOVIR
unespunesp
IMUNOVIRIMUNOVIR
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LOGOINTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar umadoença:
• Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ouidentificar um Ag de interesse.
• Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possível determinarse um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso.
• A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico édenominada sorologia.
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LOGOINTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandescategorias:
• Testes de ligação primária
• Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac
• Testes de ligação secundária
• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.
• Testes terciários
• Compreende os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em umanimal.
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LOGOREAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Soro
• Antiglobulinas
• Anticorpos monoclonais
• Anticorpos específicos
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LOGOTESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Teste que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse.
• Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunesformados são, então, mensurados.
• Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estarquimicamente marcado
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LOGOTESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Radioimunoensaios
• Ensaios de imunofluorescência
• Ensaios imunoenzimáticos
• Dispositivos descartáveis para imunoensaios
• Citometria de fluxo
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LOGOHISTÓRICO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos - 1954: Teste deImunofluorescência (Weller & Coons); 1959: Radioimunoensaio(Yallow & Berson).
• Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Avrameas &Uriel; Nakane & Pierce, 1966).
• Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de anticorposmonoclonais (Kohler & Milstein, 1975) - desenvolvimento de novostestes (kits comerciais).
• Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes,quimioluminescentes, etc.
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LOGORADIOIMUNOENSAIOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• São ensaios que utilizam como marcadores radioisótopos
• (Trício H3, carbono 14 ou iodo 125)
• Possuem vantagem de serem altamente sensíveis
• Desvantagens: alto custo, manipulação do isótopo
• Aplicabilidade: quantificação de hormônios, drogas, marcadores tumorais,alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos.
• Radioimunoensaios para anticorpos
• Radioimunoensaios para antígenos
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LOGORADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTICORPOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Teste radioalergossorbente (RAST) – mensura IgE no soro de animais alérgicos.
Discos de celulose+ antígeno
Soro teste
Lavagem
Discos de celulose+ antígeno +anticorpos
Sol.Antiglobulina
marcadaAnti-IgE
Anti-IgE se ligaa IgE + Ag
Presença deradioatividade
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LOGORADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Imunoensaios de competição são baseados no princípio de que o Ag nãomarcado irá deslocar o Ag radiomarcado dos imunocomplexos.
Ac específicos
Radioatividade nosobrenadante
Precipitadoproteico
• Quantidade de reagente marcado (Ag ouAc) quantifica o Ag ou Ac não-marcado naamostra - competição
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LOGORADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) auma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV,emite luz no espectro visível.
A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em ummicroscópio com luz UV (microscópio de fluorescência)
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos:direta, indireta ou sanduíche.
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LOGOENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos)
Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos
Referência para sorodiagnóstico de várias doenças.
• Vírus, bactérias e protozoários
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LOGOENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste direto - pesquisa de antígenos
• Ex. – Raiva, Vírus da leucemia felina (FELV)
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LOGO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos
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LOGOENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;determinação de classes e subclasses de anticorpos
Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescênciasob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.
Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor
Fluoresceína 495 525 Verde
Rodamina 552 570 Vermelho
Vermelho Texas 596 620 Vermelho
Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja
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LOGOENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;determinação de classes e subclasses de anticorpos
Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescênciasob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.
Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor
Fluoresceína 495 525 Verde
Rodamina 552 570 Vermelho
Vermelho Texas 596 620 Vermelho
Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja
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LOGOENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina veterinária Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags.
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LOGOENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS - ETAPAS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
–Revista a superfície das cavidades de uma microplaca apropiada com Ags do agenteinfeccioso que você está interessado em detectar Acs específicos.
–Adicione as amostras de soro de indivíduos a serem testados, se houver anticorposna amostra, eles vão se ligar aos Ags adsorvidos à superfície plástica
–Lave as cavidades da microplaca a fim de remover todos os anticorpos que nãoforem específicos para o Ag em questão
–Adicione um outro tipo de Ac anti-Ig da espécie que você está pesquisando se asamostras de soro têm ou não que deve ter sido previamente marcado com umaenzima
–Adicione o substrato específico para a enzima e deixe a reação de degradaçãoenzimática prosseguir e conferir cor às cavidades da microplaca
–A intensidade da cor (DO) deve ser mensurada em leitor-fotômetro, sendo que asleituras são proporcionais aos níveis dos Acs presentes nas amostras originais desoro contra o Ag em questão.
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LOGOENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Método direto – Ags
Método indireto – Acs
Sandwich e Competitivo – Ags e Acs
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LOGOELISA INDIRETOELISA INDIRETO
LavagensLavagens
Antígeno
Fonte de proteínasestranhas ao sistema
LavagensLavagensLavagensLavagens
Soro anti
Conjugado anti
LavagensLavagens
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
•Sandwich-ELISA (S-ELISA) / Duplo Ac-ELISA–As amostras são adicionadas às cavidades de uma microplaca previamenterevestidas com Acs de captura específicos para Ag que se deseja detector
–As cavidades da microplaca são lavadas p/ remover o excesso de substânciasou Ags que não se ligaram especificamente aos Acs de captura
–Uma preparação de Ac secundário conjugado com uma enzima apropriada éadicionada
–O substrato enzimático é então adicionada e haverá, no caso de presença de Agna amostra uma mudança de cor, que pode ser mensurada em leitor-fotômetroapropriado. A intensidade de DO é proporcional à quantidade de Ag presente naamostra.
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LOGOELISA DIRETO COM ANTICORPO DECAPTURAELISA DIRETO COM ANTICORPO DECAPTURA
LavagensLavagens
Antígeno
Fonte de proteínasestranhas ao sistema
LavagensLavagensLavagensLavagensLavagensLavagens
Conjugadoanti
Soro anti
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOELISA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOELISA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
Transferência de proteínas separadas por eletroforese do gel depoliacrilamida para membranas ELISA
Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura de proteínas +especificidade de anticorpos usados como sondas para a detecção de Ags
Suportes: membrans de nitrocelulose (interações hidrofóbicas); nylon,polyvinyldifluoide (PVDF) alta capacidade de ligação a proteínas
Quantificação de bandas por densitometria.
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA
Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais.
Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolorem produto colorido (deposição pode ser observada diretamente aomicroscópio óptico).
Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidasee Glicose Oxidase.
Método direto Acs primários conjugados (antígenos). Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos).
Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamentoinadequado dos conjugados.
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana denitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar avisualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana naforma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado comproteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOCitometria de Fluxo
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz efluorescência sob feixe de laser
• Estudo de populações de leucócitos - luz dispersa - tamanho e forma da célula
• Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B
• FACS (fluorescence-activated cell sorter) - separação de uma única célula
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LOGOCitometria de Fluxo
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOCitometria de Fluxo
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOObrigado!
REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE
romeumdsantos@hotmail.com
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