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INGENIERÍA GENÉTICA I

• Primrose SB, Twyman RM y Old RW. (2001). “Principles of Gene

Manipulation”, 6th ed. Blackwell Science.

• Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. (2001). “Molecular Cloning: A

Laboratory Manual”, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

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1. ELECTROFORESIS

2. PCR

3. SECUENCIACIÓN

2

ELECTROFORESIS

• Agarosa

• Poliacrilamida

3

Finalidad de la electroforesis

• Separar

• Identificar

• Purificar

4

1

2

3 4

5

5

6

Migración

• Tamaño del ADN

• Concentración de agarosa

• Tipo de agarosa

• Conformación del ADN

• Voltaje

• Presencia de bromuro de etidio

• Tampón de electroforesis

7

Concentración de

agarosa

Tamaño de los

fragmentos

de ADN separados

0.3%

0.5%

0.7%

1.0%

1.2%

1.5%

2.0%

5-60 kpb

1-30 kpb

0’8-12 kpb

0’5-10 kpb

0’4-7 kpb

0’2-3 kpb

0’05-2 kpb

8

9

Tinción del ADN

• Bromuro de etidio

– absorbancia a 302 y 366 y emisión a 590 nm.

– Detecta hasta 10 ng de ADN.

• Sybr-Green

• Sybr-Gold (x1000)

10

PCR

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14

APLICACIONES DEL PCR

• Amplificación de genes utilizados como

cronómetros evolutivos (ARNr 16s y 18s,

ITS, etc.)

• Amplificación de genes característicos

• Clonación

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ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE

NUCLEÓTIDOS

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’5’-A-3’5’-AGA-3’5’-AGACCTGCA-3’5’-AGACCTGCATTTA-3’5’-AGACCTGCATTTATAA-3’5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’

4 reacciones: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

ddATP

5’-A-3’

5’-AGA-3’

5’-AGACCTGCA-3’

5’-AGACCTGCATTTA-3’

5’-AGACCTGCATTTATA-3’

5’-AGACCTGCATTTATAA-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’

ddATP

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’

5’-AG-3’

5’-AGACCTG-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAG-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCG-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCG-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAG-3’

ddGTP

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’

5’-AGACCT-3’

5’-AGACCTGCAT-3’

5’-AGACCTGCATT-3’

5’-AGACCTGCATTT-3’

5’-AGACCTGCATTTAT-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAGT-3’

ddTTP

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’

5’-AGAC-3’

5’-AGACC-3’

5’-AGACCTGC-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGC-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCC-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGC-3’

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCC-3’

ddCTP

5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGC-3’

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3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

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http://www.ebi.ac.uk/services/

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