View
42
Download
6
Category
Preview:
DESCRIPTION
Izolace RNA z živočišné tkáně. MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU. Zdroj RNA. Čerstvá tkáň živočišného původu Slezina, játra, ledviny laboratorního potkana. Uchování a transport biol. materiálu. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Izolace RNA z živočišné tkáně
MUDr. Michal Jurajda
ÚPF LF MU
Zdroj RNA
• Čerstvá tkáň živočišného původu– Slezina, játra, ledviny laboratorního potkana
Uchování a transport biol. materiálu
• Ihned po odběru bude následovat izolace zahájená homogenizací a lýzou vzorku. Lyzační pufr blokuje RNA-ázy. Některé postupy doporučují uchovávat lyzáty pro pozdější izolaci.
Charakter zpracovávaných tkání
• Buněčnost – u jater, sleziny i ledvin vysoká – max. 25μg na jednu kolonku
• Přítomnost lipidů – nízká
• Charakter extracelulární matrix – snadno mechanicky rozrušitelná
Homogenizace tkání
• Použijeme rotor stator homogenizátor
Izolace nukleových kyselin
• Použijeme RNeasy kit fy QIAGEN
Kolonky Qiagen
buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění
Izolační kolonky
Izolace RNA
28S
18S
1,5% agaróza vTBE
Spektrofotometrické stanovení
• Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica)
• A260 – absorbance vlastní NA
• A230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA)
• A280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin)
• A320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.
Odstranění RNA-áz
• DEPC diethyl pyrocarbonate
• Karcinogen
• Deaktivovatelný při 100 st.Chttp://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html
Vlastní postup
• Před prvním použitím nachystat roztoky.– Přidat čistý 96-100% ethanol k RPE pufru– Přidat β-merkaptoethanol k RLT pufru v
poměru 10 μl na 1 ml pufru. Pozor po smíchání zůstává stabilní pouze 1 měsíc.
• Vložit vzorek tkáně (20-25 μg) do 1,5 nebo 2 ml eppendorfky a přidat 600 μl RLT pufru.
• Okamžitě homogenizovat pomocí rotor stator homogenizátoru.
• Centrifugovat 3 minuty při maximálních otáčkách a supernatant přenést do nové zkumavky.
• Přidat stejný objem 70% ethanolu a promíchat opakovaným nasátím pipetou.
• 700 μl vzorku přenést na kolonku vloženou do sběrací zkumavky. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. Možno nanést zbytek vzorku (max. 700 μl na jednu centrifugaci) a zopakovat postup
• Nanést na kolonku 700 μl pufru RW1 Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku.
• Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku.
• Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 2 min. při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a vyměnit sběrací zkumavku.
• Centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g s čistou sběrací zkumavkou-snaha odstranit veškerý ethanol.
• Kolonku vložit do 1,5 ml zkumavky. Nanést 50 μl RNase free water na střed membrány a centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g.
• Při očekávaném výtěžku vyšším než 30 μg možno eluci zopakovat.
• Část eluátu nanést na agarové ELFO, část změřit na spektrofotometru.
• RNA uskladnit při -80 °C.
Recommended