Využití peptigelu s nanovlákny k léčbě defektů kostní tkáně

359/ Acta Chir Orthop Traumatol Cech. 85, 2018, No. 5p. 359–365 PŮVODNÍ PRÁCE

ORIGINAL PAPER

Využití peptigelu s nanovlákny k léčbě defektů kostní tkáně

Use of the Peptigel with Nanofibres in the Bone Defects Healing

R. SRNEC1, R. DIVÍN2, M. ŠKORIČ3, R. SNÁŠIL1, M. KRBEC4, A. NEČAS1

1 Oddělení chirurgie a ortopedie, Klinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

2 Oddělení tkáňového inženýrství, Ústav experimentální medicíny Akademie věd ČR, Praha3 Ústav patologické morfologie a parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno4 Ortopedicko-traumatologická klinika, Fakultní nemocnice Královské Vinohrady a 3. lékařská fakulta UK, Praha

ABSTRACT

INTRODUCTIONTraumatic bone injuries or pathological processes may sometimes result in very extensive bone defects. Currently, the

standard procedure applied in clinical humane as well as veterinary medicine to fill a bone defect is the autogenous bonegraft which, however, necessitates a more invasive procedure for the patient and in the cases of extensive defects it fails toprovide adequate amount of graft. Synthetic bone replacements can be used with no further burden for the patient and cansimultaneously be used as the carriers for bioactive molecules or therapeutic drugs. For clinical use, an easy and simpleapplication is one of the requirements that have to be taken into consideration. These requirements are best satisfied bypreparations in the form of gel, which may be injected into the defects of various shapes even through minimal surgicalapproach.

MATERIAL AND METHODSSynthetic transparent PGD-AlphaProA hydro-peptide-gel was used as a basis to develop a composite hydrogel scaffold.

This gel was enriched by cryogenically ground poly- -caprolactone nanofibers (PCL) in a ratio of 1 ml of gel to 16 μg ofnanofibres. In experimental animals (laboratory rat Wistar, n=20), a single regular circular defect of 1.5 mm in diameter wasdrilled by a low speed drill machine across the whole width of distal femur diaphysis, identically in both the hind legs. In theright hindleg, this defect was filled by injection of 0.05 ml of the composite peptide gel with nanofibers (experimental defect).In the contralateral limb a similar defect was left untreated, without filling (control defect), for spontaneous healing. The groupof experimental animals was subsequently divided into four sub-groups (A, B, C, D) for the purpose of further follow-up. Oneweek after the surgical implantation, in the first group of experimental animals (Group A; n = 5) lege artis euthanasia wasperformed, a radiological examination of both the hind legs was carried out and a sample of the bone from both the controland experimental defect was collected for histologic examination. The other groups of experimental animals were evaluatedsimilarly at 2, 4 and 6 weeks after the surgical procedure (Group B, C, D; n = 5). These groups of experimental animals wereassessed using various histological techniques by two independent pathologists.

RESULTSA difference between the control and the experimental bone defect was observed only at the healing stage at two weeks

after the implantation, when a tendency for greater formation of new bone trabeculas was seen in the defect treated with thecomposite hydro-peptide-gel with PCL nanofibers. The results show a slightly higher angiogenesis and cellularity at the bonedefect site with an increase of newly formed bone tissue and faster colonisation of lamellar bone structures by bone marrowcells at early stages of the healing process (1-2 weeks old defect). In the experimental and control groups, at the later stageof healing (4-6 weeks old defect), the process of healing and bone modelling at the defect site shows no detectablemorphological differences.

CONCLUSIONSThe experimental use of hydro-peptide-gel with PCL nanofibers in vivo in laboratory rats shows very good applicability

into the defect site and, compared to the untreated defect within two weeks after the implantation, accelerates the bonehealing. This fact could be an advantage especially at the early stage of healing, and thus accelerate the healing of moreextensive defects.

Key words: peptide gel, polycaprolactone, PCL, replacement, bone, healing, scaffold, nanofibers, biomaterial.

Práce vznikla za podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (Výzkumný projekt IGA VFU Brnoč. 140/2016/FVL), Ministerstva zdravotnictví České republiky (Výzkumný projekt AZV č. 16-28637A) a finanční podporyinstitucionálního výzkumu FVL VFU Brno.

359_365_srnec 11.10.18 16:08 Stránka 359

360/ Acta Chir Orthop Traumatol Cech. 85, 2018, No. 5 PŮVODNÍ PRÁCEORIGINAL PAPER

ÚVOD

V důsledku traumatických poranění kostí nebo ná-sledkem patologických procesů mohou vznikat i velmirozsáhlé defekty kostní tkáně. Pro úspěšnou léčbu těchtodefektů je vedle vhodné stabilní rigidní fixace postiženékosti nutné provést náhradu kostní hmoty k zachováníkontaktu kostních ploch (osteokondukce) a indukce pro-cesu hojení kostní tkáně (sekundární kostní hojení) (9).Taktéž může být poměrně rozsáhlý defekt v integritěkostní tkáně získán iatrogenně po vyjmutí implantátůpo zhojení fraktury nebo je součástí neoplastickýchprocesů (10, 18). Zlatým standardem současné dobyv klinické humánní i veterinární medicíně pro výplň de-fektu kostní tkáně je autogenní spongiózní nebo korti-ko-spongiózní kostní štěp. Autogenní kostní štěp mávšechny komponenty nezbytné pro regeneraci kostnítkáně: osteokonduktivitu, bioaktivní molekuly a buňky(4). To ovšem vyžaduje zvýšení invazivity zákroku nastraně pacienta a v případech rozsáhlých defektů ne-umožňuje dostatečné množství náhradní tkáně. Tutoproblematiku pak řeší synteticky vyráběné kostní náhrady,které mají často charakter prefabrikovaných tvarů vyro-bených z kalciumfosfátu. Komerčně dostupné kalcium-fosfátové biomateriály se odlišují v původu (přírodnínebo syntetické), složení (hydroxyapatit, beta-trikalci-umfosfát a dikalciumfosfáty), formě (partikule, bloky,cement, povlak metalických implantátů, kompozity s po-lymery) a také ve fyzikálně-chemických vlastnostech(pevnost, porozita, kationtové a aniontové složení) (14).Výhodou použití syntetických kostních náhrad je beze-sporu také možnost využít materiál jako nosiče bioak-tivních molekul nebo léčiv (4). Také naše předchozípráce poukazují na další možnosti biologické stimulacekostní tkáně k podpoře hojení např. v podobě mezen-chymálních kmenových buněk nebo dalších syntetickýchmateriálů (5, 16). Pro klinické praktické využití novýchmateriálů pro výplně defektů kostní tkáně je ovšem takénezanedbatelným požadavkem snadná a jednoduchá ap-likace. Takové požadavky nejvíce naplňují gelové formypreparátů, jež se i s minimálním přístupem dají injekčněaplikovat do defektů různorodých tvarů (7, 25). V našípředcházející studii jsme testovali podobný materiálz pohledu mechanické podpory kostní tkáně s velmidobrými výsledky (19, 20).

Cílem této studie bylo vytvořit vhodný materiál pronáhradu defektů kostní tkáně s dobrou aplikační formou,maximální podporou hojení a potenciálem využítí ma-teriálu jako nosiče dalších substancí. Práce směřujek cíli vytvořit materiál pro praktické klinické využitív humánní i veterinární medicíně.

MATERIÁL A METODIKA

Příprava peptigelu s nanovlákny: Pro vývoj kompo-zitního gelového skafoldu byl jako základ použit syntetickýtransparentní PGD-AlphaProA hydropeptigel (Pepti-GelDesign Technologies, X3052). Hydropeptigel využíváspecifické peptidy, které se vlivem změn prostředí samo -uspořádají z tekutých prekurzorů do propletené 3D

struktury hydratovaných nanovláken ve formě peptido -vých beta-helixů. Tento gel byl těsně před implantacív průběhu chirurgického zákroku smísen s mletýmipoly-ε-kaprolaktonovými nanovlákny (PCL). Pro potřebyexperimentu byl využit kompozit vzniklý smícháním1 ml peptigelu s 16 μg PCL nanovláken. PCL nanovláknabyla vyrobena metodou elektrostatického zvlákňováníz roztoku PCL na vysokonapěťovém zařízení ™ NS1S500U společnosti Elmarco, s.r.o. Roztok PCL bylpřipraven rozpuštěním 24 g granulovaného PCL (MW40 000, Sigma-Aldrich) ve 100 ml 90% roztoku chloro-formu s etanolem (PENTA, 90 ml chloroform a 10 mletanol). Připravenou matrici tvořila vlákna, jejichžprůměr byl v rozmezí několika nano- až mikrometrů(obr. 1). Nanovlákna byla následně namleta na mikro-částice metodou kryogenního mletí (FreezerMill, Spex,Certiprep, USA) (obr. 2). Jako chladicí médium bylpoužit kapalný dusík. Mletí bylo provedeno ve třiceticyklech, kde jeden cyklus se skládal z jedné minutymletí a jedné minuty ochlazování vzorku.

Experimentální implantace: Všechny experimenty napokusných zvířatech byly provedeny v souladu legisla-tivními pravidly, schváleny etickou komisí VFU Brnoa prováděny na základě schváleného Projektu pokusuč. PP 23/2016. Pokusná skupina byla složena pouze zesamců laboratorních potkanů Wistar v průměrném věku96 dní (min. 92 dní, max. 101 dní) s průměrnou váhou539 g (min. 474 g, max. 653 g). U modelových experi-mentálních zvířat (n = 20) byla navozena celkováanestezie intraperitoneálním podáním medetomidinu(Domitor, OrionPharma) v dávce 0,05 ml a ketaminu(10% Narketan, Vetoquinol) v dávce 0,15 ml pro toto.

Obr. 1. Poly-ε-kaprolaktonová nanovlákna (PCL) vyrobenámetodou elektrostatického zvlákňování – snímek SEM.

359_365_srnec 11.10.18 16:08 Stránka 360


Anestezie byla dále vedena inhalační maskou kombinacíIsofluranu (Aerrane Isoflurane USP, Baxter) a medici-nálního kyslíku. Před vlastním chirurgickým výkonembyl aplikován amoxicilin klavulanát v dávce 0,1 ml prototo i.m. (Synulox RTU, Pfizer) a meloxikam v dávce0,05 ml pro toto s.c. (Metacam, Boehringer Ingelheim).V rámci experimentu byl v celkové anestezii provedenotevřený přístup k distální diafýze femuru na obou pá-nevních končetinách. Pod vizuální kontrolou byl níz-kootáčkovou vrtačkou vyvrtán jeden pravidelný kruhovýdefekt vrtákem o průměru 1,5 mm v celé šířce distálnídiafýzy femuru totožně na obou pánevních končetináchpokusného zvířete. Na levé končetině byl defekt ponechánke spontánnímu vyhojení (kontrolní defekt) a na pravékončetině byl tento defekt vyplněn injektáží kompozitupeptigelu s nanovlákny (experimentální defekt). Do ex-

perimentálního defektu byl skafold injektován 1ml stří-kačkou přes flexibilní intravenózní kanylu o průměru1,3 mm (18G). Do každého defektu bylo injektováno0,05 ml kompozitu (obr. 3). Po implantaci byl provedenchirurgický uzávěr rány. Soubor experimentálních zvířatbyl pro další sledování rozdělen do čtyř skupin (A, B,C, D). Jeden týden po chirurgické implantaci byla prvnískupina pokusných zvířat (sk. A; n = 5) lege artisutracena, bylo provedeno rtg vyšetření obou pánevníchkončetin a odběr vzorku kosti z kontrolního i experi-mentálního defektu k histologickému hodnocení. Dalšískupiny pokusných zvířat byly obdobně vyhodnocenyv období 2, 4 a 6 týdnů po chirurgickém zákroku (sk. B,C, D; n = 5).

Histologické hodnocení: Získané histologické vzorkybyly rozděleny na dvě části a každá byla nezávisle po-souzena jedním histologem za využití rozdílných metodhodnocení.

První část histologických vzorků byla získána ze dvouexperimentálních a jednoho kontrolního defektu z každéskupiny (A, B, C, D), tj. celkem 4 kontrolní a 8 experi-mentálních defektů. Jeden kontrolní defekt z každé sku-piny, tj. 4 kontrolní vzorky byly znehodnoceny technickouchybou při zpracování a vzorky nebyly dále posuzovány.Všechny posuzované vzorky byly po dobu osmi týdnůdekalcifikovány ve 12,5% roztoku kyseliny etylenedia-minotetraoctové (EDTA, Komplexon III p.a., Penta,Prague, Czech Republic) neutralizované na pH = 7 při-dáním 1,25% (w/w) NaOH. Po osmi týdnech byl zevzorku roztok EDTA 24 hodin vymýván fyziologickýmroztokem. Tkáňové bloky byly získány rozříznutím kaž-dého vzorku v centrální části defektu na dvě stejnéčásti, které byly následně samostatně zpracovány. Z kaž-dého fixovaného parafinového tkáňového bloku bylyvytvořeny histologické řezy o síle 5 μm. Histologickéřezy byly získány z centrální části hojení kostníhodefektu a následně barveny s využitím tří odlišných his-tologických metod: hematoxylin–eosin, Verhoeffovo he-matoxylinové barvení se zeleným trichromem (13) a bar-vení pikrosaturnovou červení (obr. 4). Pikrosaturnováčerveň (Direct Red 80, Sigma Aldrich, Munich, Germany)rozpuštěná v nasyceném roztoku kyseliny pikrové bylapoužita k vizualizaci kolagenu typu I (17). Z každéhotkáňového bloku byly pořízeny čtyři mikrofotografie

Obr. 2. Poly-ε-kaprolaktonová nanovlákna (PCL) po kryogen-ním mletí – snímek SEM.

Obr. 3. Vytvoření kostního defektu 1,5 mm v distální části diafýzy femuru u laboratorního potkana a implantace kompozitníhoskafoldu hydropeptigel/PCL.

359_365_srnec 11.10.18 16:08 Stránka 361


s 4násobným zvětšením objektivu. Kvantifikace objemukostní tkáně respektive objemu kolagenu typu I ve sle-dovaném defektu byla provedena s využitím softwaruEllipse (ViDiTo, Košice, Slovak Republic) s bodovoumřížkou (15). V této části hodnocení nebyla využitastatistická analýza pro srovnání kontrolních a experi-mentálních vzorků (pro malý počet vzorků v každé tes-tované skupině).

Druhá část histologických vzorků byla získána ze tříexperimentálních a tří kontrolních defektů z každéskupiny (A, B, C, D), tj. celkem 12 kontrolních a 12 ex-perimentálních defektů. V histologických řezech kon-trolního a experimentálního defektu kostní tkáně bylasledována celularita/osteoblastická aktivita v novotvořenékostní tkáni v místě defektu (měřeno v zorném poli přivelkém zvětšení 400x) jako průměrný počet buněk v cel-kem deseti zorných polích. Vzorky byly v tomto hodnoceníporovnány v rámci skupiny vždy samostatně u jednohopokusného zvířete párovým způsobem (kontrolní versusexperimentální defekt) a statisticky porovnána parame-trickým t-testem pro párová data (KyPlot version 2.0beta 15–32 bit).

VÝSLEDKY

Délka anestezie zvířat v průběhu experimentu bylaprůměrně 79 minut (min. 60 minut, max. 115 minut)a ve všech případech bylo probuzení z anestezie bezkomplikací. Délka vlastního chirurgického zákroku bylaprůměrně 32 minut (min. 20 minut, max. 45 minut)s bezproblémovým průběhem. Ve sledovaném obdobíbyla velmi dobrá klinická odezva u všech pokusnýchzvířat (kompletní zhojení operační rány, chůze bez kul-hání).

V případě prvního histologického hodnocení nebylzjištěn rozdíl mezi kontrolním a experimentálnímdefektem u skupiny A po 1 týdnu hojení. Nově vytvořenékostní trabekuly byly distribuovány stejnoměrně v místěhojení kosti. Vzorek kostního defektu z experimentálnískupiny B vyplněný kompozitem hydropeptigelu/PCLpo dvou týdnech hojení obsahoval více kostních trabekuluvnitř defektu v porovnání s kontrolním defektem(obr. 5). Po 4 a 6 týdnech hojení (skupina C a D) nebyldále zaznamenán rozdíl mezi vzorky kontrolnímí a ex-perimentálními. V tomto intervalu hojení bylo navíc

Obr. 4. Metodika A – Experimentální defekt v distální části diafýzy femuru u laboratorního potkana, vzorek k histologickéanalýze před zpracováním; B – histologický řez kostním defektem v barvení hematoxylin-eosin; C – histologický řez kostním de-fektem v barvení Verhoeffovým hematoxylinem se zeleným trichromem; D – histologický řez kostním defektem v barvení pikro-saturnovou červení pozorován v polarizovaném světle.

359_365_srnec 11.10.18 16:08 Stránka 362


menší množství formované kosti uvnitř pozorovanéhodefektu než u vzorků (kontrolních i experimentálních)po 1 a 2 týdnech hojení (skupina A a B). Po dvoutýdnech hojení byly v histologickém řezu také četně za-

stoupeny kost resorbující osteoklasty. Objem kostní tká -ně uvnitř defektu vykazoval významnou pozitivní kore -laci s objemem kolagenu typu I (Spearman R = 0,97;P < 0,05) (tab. 1).

V případě druhého histologického hodnocení bylau skupiny A (1 týden po operaci) a B (2 týdny po ope -raci) plocha novotvořené kostní tkáně u experimentálníhodefektu hustěji osídlena osteoblasty (průměrný početbuněk v zorném poli při zvětšení 400x u sk. A = 212,resp. u sk. B = 300) ve srovnání s kontrolním defektem(průměrný počet buněk v zorném poli při zvětšení 400xu sk. A = 132, resp. u sk. B = 176; P ≤ 0,01) (obr. 6). Zá-roveň byla pozorována proliferace perivaskulárních a en-doteliálních buněk cévních anastomóz s depozicí lamelárníkosti a tvorbou osteonů. U skupin C a D (4 a 6 týdnů pooperaci) nebyly morfologicky pozorovány rozdíly vestavbě kostní tkáně a kostní dřeně v místě defektu meziexperimentálním a kontrolním defektem. V místě defektuv lokalizaci periostu byla u skupin C a D (kontrolníi experimentální kostní defekt) pozorována depozicetrámečků vláknité kosti aktivovanými periostálními os-teoblasty (obecná reakce/proces hojení v místě narušeníperiostu).

Obr. 5. Srovnání formace nových kostních trabekul (tmavě modrá) u experimentálního a kontrolního defektu kosti za 1 a 2 týdnyprocesu hojení (skupina A a B).

Tab. 1. Individuální hodnoty objemu kostní tkáně a kolegenutypu I (mm3) v průběhu hojení u kontrolních i experimentálníchkostních defektů

Skupina Vzorek Výplň kontrolní/ Týdny Objem kosti Objemexperimentální hojení uvnitř defektu kolagenu I

(mm3) (mm3) uvnitř defektuA 1 experimentální 1 0,031 0,028

2 experimentální 1 0,032 0,032

1 kontrolní 1 0,034 0,033

B 6 experimentální 2 0,016 0,022


6 kontrolní 2 0,008 0,006

C 11 experimentální 4 0,004 0,002


11 kontrolní 4 0,000 0,000

D 16 experimentální 6 0,008 0,003


16 kontrolní 6 0,000 0,000

359_365_srnec 11.10.18 16:09 Stránka 363


Obr. 6. Histologický preparát z místa defektu na distálním femuru, sk. B – 2 týdny po vytvoření defektu, barvení hematoxy-lin-eosin, zvětšení 200x: I – kontrolní defekt bez výplně; II – experimentální defekt výplněný kompozitem hydropeptigel/PCL.

DISKUSE

Výzkum materiálů v oblasti tkáňového inženýrstvíkostních struktur je progresivně rostoucí obor úzcespojený s rozvojem materiálových technologií. Vývojv tomto odvětví se odehrává paralelně v rámci acelulárnícha celulárních systémů (3). Experimentálně se mohouvyužít k výplni defektů kostí materiály přírodního cha-rakteru (24), ale nejrozšířenějšími materiály pro výrobuskafoldů jsou biodegradabilní syntetické polymerya jejich kompozity (2, 12). Z hlediska designu skafoldůpro kostní náhrady jsou velmi důležitými vlastnostmibiofunkcionalita, biokompatibilita, bioresorbovatelnost,biodegradabilita, mechanické vlastnosti a porozita. Z dal-ších vlastností je zohledňována úloha skafoldu jakonosiče léčiv, radiolucence, tvarovatelnost, sterilizovatelnosta stabilita při skladování (23). Velmi aktuálními trendyv chirurgických oborech posledních let jsou obecně mi-niinvazivní techniky. V našem případě byl vytvořenýdefekt v distální části diafýzy femuru relativně malé ve-likosti se zachováním mechanické pevnosti stehenníkosti. Proto nebylo nutné posílení mechanické pevnostikosti fixací v průběhu experimentu. Tato situace de-monstruje defekty kosti po vyjmutí implantátů, kdy ne-dokončená remodelace kosti a defekty po vyjmutýchimplantátech mohou za určitých podmínek přispět kekomplikacím fe formě refraktur. Pro analýzy kostníhohojení u rozsáhlejších defektů (imitace kominutivníchfraktur a ostektomií) je ovšem mechanická podporakosti nezbytná (přemosťující osteosyntéza interními me-todami fixace, externí fixace). V případě léčby zlomeninminiinvazivními technikami jsou upřednostňovány stabilníploténkové systémy s minimalizovaným přístupem k liniilomu (8). Možnosti aplikace syntetických pevnýchnáhrad kostní tkáně v těchto případech jsou velmi ome-zené. Do popředí se tak dostávají skafoldy s možnostíinjekční aplikace do místa defektu (7, 11, 25). Vývojtěchto materiálů je proto stále velmi aktuální. U některýchvyvíjených materiálů se v průběhu testování zjistí jejichhorší biologická snášenlivost, jako v případě syntetickéhopoly(caprolactone-trifumarate), kde výsledky ukazujístřední cytotoxicitu (1). Nejčastěji využívaným nosným

médiem jsou popisovány hydrogely s velmi dobrýmivýsledky. Hydrogely vykazují dobrou snášenlivost a me-chanickými i strukturálními vlastnostmi se podobajíextracelulární matrix. Zlepšení bioaktivity mechanickéodolnosti je pak dosaženo tvorbou kompozitů přidánímpevných nanočástic (6, 22). Obdobnou koncepci kom-pozitu jsme zvolili při designování našeho skafoldu,kdy nosným médiem byl peptigel podpořen přidánímnanočástic PCL. Materiál vykazoval velmi dobrou apli-kovatelnost. Je však nutné kontrolovat perioperačníkrvácení, kdy v případech většího krvácení se mátendenci kompozit z místa aplikace vyplavovat. To bymohl být větší problém zejména v případech rozsáhlýchdefektů. Částečně by tento jev mohl být omezen změnoupoměru peptigelu a PCL. Tato pilotní studie sledovalapouze vliv kompozitního skafoldu jako celku na průběhhojení defektu. Velmi důležitou informací by ovšemtaké bylo srovnání hojení defektu s využitím pouze sa-motného peptigelu (druhá kontrola) a různého poměruPCL nanovláken (experimentální defekty). Takto bybylo možné nejenom zhodnotit míru vlivu samotnýchPCL nanovláken na proces hojení, ale také strukturálnízměny kompozitního skafoldu, které mají vliv na apli-kovatelnost skafoldu do místa defektu. Každopádně vlivPCL nanovláken v hydropeptigelu je taktéž ve schopnostinést další navázané látky. Menší mechanická podporadefektu injektovatelnými skafoldy je vyvážena vlastnostmidobré aplikovatelnosti a možnostmi adice dalších bio -aktivních látek a léčiv (21). Výsledky hojení kostníhodefektu po aplikaci peptigel/PCL kompozitu vykazujíakceleraci v počáteční fázi procesu hojení nezávislev obou histologických hodnoceních. V hodnocení bylau skupiny A (1 týden po operaci) a B (2 týdny pooperaci) plocha novotvořené kostní tkáně u experimen-tálního defektu hustěji osídlena osteoblasty, což je prav-děpodobně pozitivní efekt kompozitního skafoldu, kdyje podpořena migrace, diferenciace a růst osteoblastů.Po jednom týdnu hojení však ještě nebyl pozorovánrozdíl v objemu kostní hmoty u vzorků bez ošetření –kontrolní defekt a u vzorků ošetřených implantací kom-pozitem hydropeptigel/PCL – experimentální defekt.Nově formované kostní trabekuly byly rovnoměrně

359_365_srnec 11.10.18 16:09 Stránka 364


distribuovány uvnitř hojeného defektu. Četný výskytosteoklastů po dvou týdnech hojení pravděpodobně zna-mená počátek absorbce nově vzniklých kostních trabekulv další fázi hojení kosti. Resorbce nově tvořenýchkostních trabekul byla pravděpodobně rychlejší u kon-trolního defektu než u defektu s peptigelem/PCL v delšímčasovém úseku hojení, protože objem kostní tkáně bylu defektů s implantovaným materiálem po dvou týdnechhojení větší. Resorbce byla pozorována zejména v oblastidřeňové dutiny, kde za fyziologických podmínek je jenmalé množství kostních trabekul. I přes limitovanou ve-likost posuzovaného souboru experimentálních zvířatjsou závěry podpořeny faktem dvou nezávislých histo-logických posouzení. Přesto by další rozsáhlejší studiebyla přínosem. Testování kompozitu v rozsáhlejšíchkostních defektech může přinést další cenné informace.V těchto případech by ovšem bylo nezbytné využitívhodné fixace a přemostění kostního defektu mechanickoupodporou. Tato pilotní studie ukazuje pozitivní vlivkompozitního skafoldu hydropeptigel/PCL, avšak k do-konalému komplexnímu posouzení míry podpory procesuhojení skafoldem jsou nezbytné další navazující studie.

ZÁVĚR

Rozdíl mezi kontrolním a experimentálním kostnímdefektem byl pozorován jen ve fázi hojení dva týdny poimplantaci. Zde byla sledována tendence tvorby většíhomnožství nových kostních trabekul u defektu ošetřenéhokompozitem hydropeptigelu s PCL nanovlákny v porov -nání s neošetřeným kontrolním defektem. Výsledkyukazují mírně vyšší angiogenezi a celularitu v místě ko-stního defektu s nárůstem novotvořené kostní tkáněa rychlejší osídlování lamelárních kostních struktur buň-kami kostní dřeně, a to převážně v časných fázíchprocesu hojení (stáří defektu 1–2 týdny). U experimen-tálních i kontrolních skupin v pozdější fázi hojení (stářídefektu 4–6 týdnů) je morfologicky vzhled dalšíhoprocesu hojení a modelace kosti v místě defektu obdobný,tj. bez detekovatelných morfologických rozdílů.

Tato intenzivnější aktivita osídlování osteoblasty, pro-jevující se v časné fázi hojení kostních defektů vyplněnýchkompozitem peptigelu s nanovlákny, by za příznivýchpodmínek mohla mít výrazný vliv na rychlost zhojenízejména u rozsáhlejších kostních defektů.

Literatura

1. Al-Namnam NM, Kim KH, Chai WL, Ha KO, Siar CH, NgeowWC. A biokompatibility study of injectable poly(caprolactone-tri-fumarate) for use as a bone substitute material. Front Life Sci.2015;8:215–222.

2. Bose S, Roy M, Bandyopadhyay A. Recent advances in bone tissueengineering scaffolds. Trends Biotechnol. 2012;30:546–554.

3. Burg KJL, Porter S, Kellam JF. Biomaterial developments for bonetissue engineering. Biomaterials. 2000;21:2347–2359.

4. Carson JS, Bostrom MPG. Synthestic bone scaffolds and fracturerepair. Injury. 2007;38(S1):S33–S37.

5. Crha M, Nečas A, Srnec R, Janovec J, Stehlík L, Raušer P,Urbanová L, Plánka L, Jančář J, Amler E. Mesenchymal stem cellsin bone tissue regeneration and application to bone healing. ActaVet. Brno. 2009;78:635–642.

6. Dhivya S, Saravanan S, Sastry TP, Selvamurugan N. Nanohydro-xyapatite-reinforced chitosan composite hydrogel for bone tissuerepair in vitro and in vivo. Nanobiotechnol. 2015;13:40.

7. Fang J, Yang Z, Tan S, Tayag C, Nimni ME, Urata M, Han B. In-jectable gel graft for bone defekt repair. Reg Med. 2013;9:41–51.

8. Hudson CC, Pozzi A, Lewis DD. Minimally invasive plate osteo-synthesis: Applications and techniques in dogs and cats. Vet CompOrthop Traumatol. 2009;22:175–182.

9. Hulse D, Hyman B. Fracture biology and biomechanics In: SlatterD. Textbook of small animal Sumery. Saunders, Philadelphia,1993, pp 1785-1792.

10. Chanoit G, Mathon DH, Autefage A. Principles of bone healing.Application to segmental bone defects. Rev Med Vet. 1999;150:851–866.

11. Chen Z, Zhang X, Kang L, Xu F, Wang Z, Cui F, Guo Z. Recentprogress in injectable bone repair materials research. Front MaterSci. 2015;9:332–345.

12. Liu X, Holzwarth JM, Ma PX. Functionalized synthetic biodegradacepolymer scaffolds for tissue engineering. Macromol Biosci.2012;12:911–919.

13. Kočová J. Overall staining of connective tissue and the muscularlayer of vessels. Folia Morphol. 1970;18:293–295.

14. Legeros RZ. Properties of osteoconductive biomaterials: Calciumphosphates. Clin Orthop. Relat Res. 2002;395:81–98.

15. Mouton PR. Principles and practices of unbiased stereology. Anintroduction for bioscientists. Johns Hopkins University Press,Baltimore, MD, USA, 2002.

16. Nečas A, Plánka L, Srnec R, Raušer P, Urbanová L, Lorenzová J,Crha M, Jančář J, Gál P. Biomaterials and stem cells in thetreatment of articular cartilage, meniscal, physeal, bone, ligamentousand tendineous defects. Acta Vet Brno. 2008;77:277–284.

17. Rich L, Whittaker P. Collagen and picrosirius red staining:a polarized light assessment of fibrillar hue and spatial distribution.Braz J Morphol Sci. 2005;22:97–104.

18. Rosson J, Egan J, Shearer J, Monro P. Bone weakness after the re-moval of plates and screws – cortical atrophy or screw holes. J Bone Joint Surg Br. 1991;73:283–286.

19. Srnec R, Fedorová P, Pěnčík J, Vojtová L, Sedlinská M, NečasA. Ex vivo testování mechanických vlastností metakarpálních/me-tatarzálních kostí psů po simulovaném vyjmutí implantátů. ActaChir Orthop Traumatol Cech. 2016;83:111–116.

20. Srnec R, Urbanová L, Kořínek M, Bareš F, Harazinová K, NečasA. Využití nového biomateriálu s nanovlákny k léčbě defektůkostní tkáně. Sborník konference Interní grantové agentury VFUBrno. 2016:54–56.

21. Tommasi G, Perni S, Prokopovich P. An injectable hydrogel asbone graft material with addend antimicrobial properties. TissueEng Part A. 2016;22:862–872.

22. Van TD, Tran NQ, Nguyen DH, Nguyen CK, Tran DL, NguyenPT. Injectable hydrogel composite based gelatin-PEG and biphasiccalcium phosphate nanoparticles for bone regeneration. MinerMet Mater Soc. 2016;45:2415–2422.

23. Velasco MA, Narváez-Tovar CA, Garzón-Alvarado DA. Design,materials, and mechanobiology of biodegradace scaffolds for bonetissue engineering. BioMed Res Int. 2015;2015:729076.

24. Vuola J, Böhling T, Kinnunen J, Hirvensalo E, Asko-SeljavaaraS. Natural coral as bone-defect-filling material. J Biomed MaterRes. 2000;51:117–122.

25. Yasmeen S, Lo MK, Bajracharya S, Roldo M. Injectable scaffoldsfor bone regeneration. Langmuir. 2014;30:12977–12985.

Korespondující autor:MVDr. Robert Srnec, Ph.D.Oddělení chirurgie a ortopedieKlinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařstvíVeterinární a farmaceutická univerzita BrnoPalackého tř. 1946/1612 42 BrnoE-mail: [email protected]

359_365_srnec 11.10.18 16:09 Stránka 365

Documents

Využití peptigelu s nanovlákny k léčbě defektů kostní tkáně