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Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit
Hauptseminar im WS 2003/2004
Martina Leins
Gliederung
• Allgemeines• Motivation für die genaue Erforschung
des Bewegungsablaufes• Aufgaben der Kinesin- und Myosin V-
Moleküle• Kinesin• Myosin V• Vergleich und Zusammenfassung
Allgemeines
• Wandeln chemische in mechanische Energie um
• Viel filigraner als herkömmliche Schrittmotoren
• Messen nur wenige Nanometer• Kann das Tausendfache seines
Gewichtes transportieren
Motivation
• Anwendungen im Nanobereich• Goldman: "What concerned me was
how this little myosin motor can move along the track without letting go and floating off into the cytoplasm of the cell"
Aufgaben in der Zelle
Kinesin:Transport vonMakromolkülen undkleiner Oranellen inder Zelle
Myosin V:Transportiert verschie-dene Substanzeninnerhalb von Nerven-zellen
Struktur von Kinesin
• Kopf: Motor• Stiel: Doppelwendel• Schwanz: kann Last
binden
Kinesin
Bewegt sich entlangeiner Mikrotubuli
Bewegungsmechanismus bei Kinesin
• Aufnahme von ATP• ATP-Hydralisation• Pi-Abgabe• ADP-Abgabe• Erneute ATP-
Aufnahme
Struktur von Myosin V
• Kopf: Motorbereich• Genick: Lichtkette• Schwanz: kann Last binden
Myosin V
Bewegt sichentlang einesActinfilaments
Schrittweite des Myosin V
• Genaue Bestimmung der Schrittweite:• Früher: Bestimmungen mit festem
Actinfilament• Jetzt: Rotationsfreiheit des
Actinfilaments
Versuchsaufbau
• Actinfilament auf zwei Kügelchen
• Aufsetzen der Doppelkugel mit dem Myosin V-Molekül mit optischer Pinzette
• Ausschalten der Laserfalle
Mögliche Bewegungsformen
• Schrittweite ca. 36nm: Rechts- oder linkshändige Spirale um Actinfilament mit großer Ganghöhe
• Kleine Schrittweite: starke rechtshändige Rotation (wie RNA um DNA)
• Entlanggleiten an den Strängen
Bewegung bei maximaler Geschwindigkeit
• Linkshändige Spirale• 2 Umdrehungen über 4.4m• ATP- konzentrationsunabhängig• Nicht alle Moleküle zeigten Rotation: Gründe:
• Zurück gelegter Weg zu kurz ( < 2m)• Zu kurzes Actinfilament• Rotation durch 'Schutt' verhindert
Diagramm
Schrittweite
• Linkshändige Rotation: Schrittweite etwas kleiner als 36nm
• Rechtshändige Rotation: Schrittweite kleiner als 18nm
Schrittweite zwischen 18nm und 36 nm
Berechnung der Schrittweite
• Mittlere Schrittweite: 34,8nm 36nm*(2.200nm-72nm)/(2.200nm) =
34,8nm
• Mittlerer Drehwinkel pro Schritt: 6°
Schrittweite ist konstant
• Unabhängig von ATP-Konzentration• Last unabhängig Realisation: 104 Myosin V Moleküle an einem Doppelkügelchen
Zwei mögliche Bewegungsformen
Hand-over-hand: Beide Köpfe sindabwechselnd führend
Inchworm:Ein Kopf ist immervorn der andereimmer hinten
Hand-over-hand – Inchworm
Voraussagen der beiden Modelle
Hand-over-hand:Abwechselnd Schritte der Weite (37 2x)nm
Inchworm:Immer gleich großeSchritte der Schritt-weite 37nm
Auflösungsvermögen
• Lokalisation: 6nm bei einer Zeitauflösung von 20s
(scanning confocal microscopy)• Ortsauflösung: 2nm bei Objekten der Größe 30 –
150nm bei einer Zeitauflösung von 30ms
Einzel-Molekül-Fluoreszenz
• Lokalisation von 1.5nm in 2d• Zeitauflösung von 0.5s• Photostabilität von bis zu einigen
Minuten
Fluorescence imaging with one- nanometer accuracy: FIONA
FIONA
• Lokalisation: Gaußfit in 2d
• Photostabilität: Sauerstoffreinigungssystem
Test: FIONA
• Probe an ruhender DNA• Bewegung des Spots in definierten
Schritten und definierter Verweilzeit
• Ergebnis: Genauigkeit der Ortsbestimmung: 1.3nm
FIONA mit Mysion V
Mysion V mit Rohdamin versehen:• 50 000 bis 100 000 Photonen pro Spot• Lokalisation: 3nm, helle Spots sogar
1.5nm• 49 verschiedene Moleküle • 552 ganze Schritte
Beobachtete Schrittweiten
• gleichgroße Schritte mit einer Schrittweite von 74nm
• Alternierend zwei verschieden große Schrittweiten:
52nm und 23nm 42nm und 33nm
52-23nm und 42-33nm Schritte
74nm Schritte
1084398S1.mov
74-0nm Schritte
• Zwischen zwei 74nm-Schritten ein 0nm-Schritt versteckt
• Kinetische Überlegungen: bei gleicher ATP-Konzentration halb so große
Schrittrate wie bei 52-23- oder 42-33-Schritten: Experiment: Schrittrate (52-23/42-33): 0.35 s-1
Schrittrate (74-0): 0.17s-1
Ergebnis
• Myosin V bewegt sich nach dem Hand-over-hand Modell
• Mittlere Schrittweite: (74 + 0, 52 + 23, 42 + 33)/2 nm = 37nm
Vergleich und Zusammenfassung
Myosin V:• Actinfilament• Hand-over-hand• Schrittweite von
34.8nm
Kinesin:• Microtubuli• 8nm Schrittweite
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