KROMATOGRAFI PARTISI - Rara | My daily days · PDF filekomponen/solut antara fase diam cairan...

KROMATOGRAFI PARTISI

Definisi : Teknik kromatografi berdasarkan partisi

komponen/solut antara fase diam cairan pada

permukaan penyangga padat dengan fase gerak

Fase diam tidak saling campur dengan fase gerak

Komponen terpisah karena masing-masing memiliki

koefisien partisi yang berbeda

KROMATOGRAFI PARTISI

Fasa diam: Cairan yang melapisi partikel penyangga

Fasa gerak: Cairan yang tidak dapat campur dengan fasa diam

tidak dapat teradsorpsi pada penyangga fasa diam

Sampel: Berbeda kelarutannya dalam fasa diam

Komponen yang lebih besar kelarutannya dalam fasa diam

tertahan lebih lama

Koefisien partisi (Kd) = [X]A/[X]B

● Berubah bila suhu berubah

● Nisbah konsentrasi zat terlarut dalam dua pelarut yang

tidak saling campur, pada saat kesetimbangan

Penyangga:

kieselguhr, selulosa, silika gel , alumina

C8, C18

konsentrasi zat terlarut dalam fasa diam

koefisien partisi = ---------------------------------------------------

konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak

Bila suatu zat mempunyai Kd = 5 diperlukan fasa gerak

sebesar 5x volume kolom untuk mengelusi seluruh senyawa

keluar dari kolom

Volume kolom dibuat sekecil

mungkin sesuai dengan yang

benar-benar dibutuhkan untuk

pemisahan komponen

Semakin sedikit fase gerak yang diperlukan, semakin

sedikit pelarut yang harus diuapkan; proses pemekatan

semakin cepat

Analat mengandung A (Kd=1) dan B

(Kd=0,67), fasa mobil P

Jika masing-masing ada 1000 molekul, ada fase

gerak masing-masing terpartisi

Asumsi : Vd =Vg

A : 500 pada fasa diam, 500 pada fasagerak

B: 400 pada fasa diam, 600 pada fase gerak

Elusi lebih lanjut(tambahan fasa gerak segar)

Zat terpartisi lebih

lanjut A250-250 (fd-fg)

B: 160-240 dan 240-360 (fd-fg)

Seluruh zat A maupun B terelusi terpisah

P

A+ P

B+P

A P

P

P

B

P

Ilustrasi mekanisme partisi (pemisahan )

dalam kolom, Koefisien Partisi dan Teori Pelat

Fasa diam: hidrofilik

Fasa gerak : hidrofobik

Pasangan fasa diam dan fasa gerak: daya saling melarutkan

kecil

Kromatografi partisi fasa normal

Kromatografi partisi fasa terbalik

Fasa diam: hidrofobik

Fasa gerak : hidrofilik

Pemisahan ion-ion logam

1 2 3 4 5

I

II

A =1

A= 0,5

Soal : Berapa fraksi A pada saat fase gerak “mengisi “ pelat no 4 Berapa untuk solut B bila Kd B = 0.6

0.5 0.125

0.25 0.25

0.25 0.25 0.125 0.25 0.25

0.125 0.125

Solut A (nilai (Kd=1) terdistribusi dalam fase diam (kolom I) dan fase gerak (kolom II)

Perkembangan dalam kolom saat dua analit dipisahkan

Konsentrasi analit pada berbagai jarak dari titik injeksi

Kolom partisi • Fase diam dan fase gerak merupakan zat

cair

• Pada kolom partisi umumnya suatu pelarut

tidak campur air diadsorpsi pada suatu

padatan inert, sebagai cairan fasa diam

• Larutan analit ditempatkan pada bagian atas

kolom, kemudian dicuci dengan pelarut

kedua hingga analit keluar dari kolom

• Pelarut kedua= fase gerak = eluen =bisa

berupa campuran pelarut mungkin juga

yang mengandung bufer

MK KROMATOGRAFI I

D3 ANALISIS KIMIA

kuliah minggu ke 8

KROMATOGRAFI

ADSORPSI

KROMATOGRAFI ADSORPSI

♦ Jenis dan sifat adsorbent

♦ Jenis dan sifat eluen

♦ Kelakuan kromatografi zat

♦ Reaksi samping pada kromatografi

♦ Kromatografi adsorpsi berbagai zat

Adsorbent • Sifat :

1. Polaritas relatif : Kekuatan untuk mengadsorpsi spesies tertentu.

2. Kapasitas adsorpsi : jumlah gr solut yang dapat diadsorpsi per gr adsorbent

1.Polaritas adsorbent polar tertentu (untuk mengadsorpsi gugus polar) -COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > =C=O >

-COOR > -OCH3 > -CH=CH-

Untuk Arang (charcoal)?

Diuji dengan pewarna → jenuh

Arang aktif > silika gel > alumina asam >

alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO

Penggolongan adsorben ~ Kapasitas adsorpsi Lemah Medium Kuat

Sukrosa CaCO3 Mg Silikat aktif

Pati Ca3(PO4)2 Alumina aktif

Inulin Mg3(PO4)2 Arang aktif

Talc Mg Oksida aktif

Na2CO3

2. Kapasitas adsorpsi

me

nin

gk

at

Hesse:

Charcoal > silika gel > floridin > alumina asam > alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO

Adsorbent Anorganik • Alumina Al2O3

Δ Na aluminat

Na+ dapat ditukar dengan kation Alumina basa

- Biasa tercampur dgn Na karbonat & Nabikarbonat

- Kehalusan partikel ±7µ

- Dicuci dgn asam HCl

Cl- dapat ditukar dengan anion Alumina asam

Bauksit Al2(OH)4 Pemisahan hidrolisit chitin gula

• Magnesia MgO Pengganti alumina

Magnesium silikat Gula, steroid

Kalsium hidroksida karotenoid

Kalsium karbonat Xantophyl, pigmen lain

Dikalsium fosfat karoten

Trikalsium fosfat enzim

Kalsium oksalat antraquinon

Zinc karbonat karotenoid

Silika gel Sterol, asam lemak, gliserida, karbohidrat, asam amino

Adsorbent Organik

●Selulosa & turunannya:

●Pati

● Sukrosa

● Manitol

● Dekstran

Digunakan untuk pemisahan zat hidrofilik (asam

amino, asam nukleat, gula

Senyawa aromatik , pemanis, asam ketokarboksilat, antrakuinon

Adsorbent Spesifik

• Silika gel dengan lubang pori spesifik

Silika gel + zat (misal : metil orange)

• Kolom urea

• Kolom histon

• Kolom selulosa + azofenols

Asam lemak rantai lurus → adsorpsi

Asam lemak bercabang → lewat

DNA teradsorpsi, RNA tidak

enzim

ELUEN

Daya elusi ≈ adsorben

Adsorben polar

asam/basa > asam organik > piridin > air > metanol > etanol > propanol > aseton > dikloroetana > etil asetat > kloroform; dietil eter > diklorometana > benzena; toluena > karbon tetraklorida > sikloheksana > heksana > petroleum eter

Kemurnian eluen

Pengotor dalam eluen Elusi terganggu

●Pelarut organik : Kering; redestilasi

●Pelarut yang mengandung peroksida:

Pada kolom alumina, peroksida tertahan

●Pelarut berhalogen : Bila ada Na2CO3 /K2CO3

terbentuk HCl bebas

Fungsi fasa diam terganggu

Kelakuan kromatografi zat

Proses kromatografi:

Interaksi fasa diam-zat-fasa gerak

Sifat adsorben (fasa diam), sifat zat, dan sifat eluen berpengaruh

Posisi pita zat (pada kromatografi kolom)/spot (pada KLT) bervariasi

Sifat Adsorbent dan Struktur Kimia Zat yang diadsorpsi

Strain(1948): karotenoid

Posisi karotenoid pada kolom sukrosa, celite, magnesia

sukrosa celite magnesia

Zeaksantin Zeaksantin Rhodoksantin

Lutein Lutein Lycopene

Cryptoksantin Cryptoksantin Zeaksantin

Rhodoksantin Rhodoksantin Lutein

Lycopene Lycopen Cryptoksantin

β-carotene β-carotene β-carotene

α-carotene α-carotene α-carotene

….

……..

β-karotena α -karotena

Likopena

OH

OH

Zeaksantin

OH

OH Lutein

OH

OH Rubiksantin

Sukrosa: afinitas terhadap OH- > ikt ganda berkonjugasi

Kriptoksantin (1 OH) teradsorpsi lebih kuat daripada lycopene (+ 2 ikatan ganda) dan rodhoksantin ( + 2 CO + 1 ikatan ganda)

Magnesia: afinitas terhadap OH- < ikt ganda berkonjugasi

α dan β-carotene (Δ posisi 1=)

Zeaksantin dan lutein (Δ posisi 1=) terpisah

Lycopene(13=) teradsorpsi lebih kuat daripada zeaksantin (11= , 2OH)

celite sukrosa magnesia

Susunan Kimia dan Kromatografi

Kromatografi dengan media anorganik ~ adsorpsi

Daya untuk diadsorpsi : ~ ikatan ganda gugus OH

∑ Ikatan ganda ↑

∑ OH ↑ Adsorptivitas ↑

aldehid dan keton < alkohol

hidrokarbon < ester < keton/aldehid

asam dan basa > alkohol, tiol > aldehid, keton > zat berhalogen, ester > hidrokarbon tak jenuh > hidrokarbon jenuh

Gugus fungsi

R-COOH

R-CONH2

R-OH

R-NH2

R-NH-Ac

R-O-Ac

R-COOCH3

R-N(CH3)2R-O-B2

R-NO2

R-O-CH3

R-H

adsorb

abilitas ↑

Subtituen:

Halogen < nitro < arilamino < alkilamino < amino <asilamina < OH rantai samping < OH inti

Ikatan hidrogen menurunkan adsorbabilitas

CH3

O

O

O O

H

O

CH3

O O

H

CH3

O O

H O O

H

O

CH3

O O

H

O O

H

CH3

CH3

CH3 O

O

H3C HO

hidroksimetilantraquinon

Zat manakah yang lebih kuat teradsorbsi pada silika:

2-nitroresorsinol dan m/p-nitrofenol

2-hidroksiantraquinon dan 1,4,5,8-tetrakudroksiantraquinon

1 2

4

3

5 6

Kekuatan adsorpsi 1<2; 3<4; 5<6

Posisi Relatif Zona pada Kolom

• ~ adsorpsi ~ struktur kimia

sifat adsorbent

sifat eluen/solvent

1 2 3 4

• Efek solven → jenis

celite

sukrosa

petroleum/benzena

p/b + 25% aseton

klorofil b, neoksantin

neoksantin, klorofil b

1,2-dikloroetana

petroleum + 0,5% metanol

fukoksantin, violaksantin

violaksantin, fukoksantin

• Efek impuritis

sukrosa petroleum

petroleum + 0,5% amil alkohol

klorofil a, fukoksantin

fukoksantin, klorofil a

Sedikit alkohol dalam solvent

• Efek pH → senyawa polar

selulosa amonia

asam/netral

fluorosein, bromofenol biru

bromofenol biru, fluoroseein

• Efek konsentrasi

konsentrasi ↑ kecepatan gerak ↑

• Efek suhu

sukrosa 95O C

20O C

klorofil a, lutein

lutein, klorofil a

Posisi zona pada kolom

Reaksi Sekunder karena Adsorbent

• Alumina

Yang berisi alkali bebas reaksi sekunder

Saponifikasi gliserida Auto oksidasi asam lemak Deasetilasi gula Destruksi vitamin A,K Dekomposisi insektisida rotenon Hidrasi porifin Transformasi monosiklik keton bisiklik keton Isomerasi 10-nitroantron → 10-nitroantanol

• Silika

Isomerasi terpen hidrokarbon monogliserida sterol

• Charcoal

Aminolisis asam amino

Oksidasi

Dekomposisi

asam amino

Reaksi Sekunder

►SARINGAN MOLEKUL DAN JENISNYA

►ELUEN DAN SISTEM ELUSI

► APLIKASI KROMATOGRAFI EKSLUSI

► PENGERTIAN

PENGERTIAN

Kromatografi ekslusi/filtrasi/permeasi

Pemisahan molekul pada Kromatografi cairan berdasarkan perbedaan ukuran , bentuk molekul

Sampel

Molekul besar

Molekul kecilr

Bila terlalu besar, tidak masuk

ke pori eksklusi

awal elusi

Ekslusi

Ditolaknya partikel karena ukurannya lebih

besar dari pori sehingga tidak masuk pori

Limit ekslusi

Batas ukuran molekul terbesar yang

dapat dipisahkan pori gel filtrasi,

(ukuran yang lebih besar serentak ke

luar kolom)

Limit inkslusi

Batas ukuran molekul terkecil yang

dapat dipisahkan pori gel filtrasi,

(ukuran yang lebih kecil dielusi

serentak ke kuar kolom)

♦ Sephadex lipofilik

○ Sephadex LH-20 dan LE-60

○ Bila diperlukan pelarut organik

○ Fasa gerak: digunakan untuk sistem buffer aq, pelarut organik polar, campuran pelarut aq.

○ Fraksinasi lipid, steroid, asam lemak, hormon, vitamin

MEDIA GEL FILTRASI/SARINGAN MOLEKUL

● Sephadex ♦ Cross linking (CL) dextran-epiklorohidrin

CL Nomor G Swelling

♦ Swelling (penggembungan) dipengaruhi oleh:

Derajat CL, Kekuatan ion,

pH, Jumlah bahan organik modifier

♦ Aplikasi: protein, peptida, asam nukleat, polisakarida

♦ Kestabilan pada pH tertentu

G-10 sp G-25 stabil pada pH 2-13 G-50 sp G-200 satabil pada pH 2-10

♦ Fasa gerak: larutan garam aq

dekstran

Ephichlorohydrin

1kloro,2,3 ephoxypropana

● Sephacryl

♦ Dextran alil dan N,N'-metilena-bis-akrilamida

♦ Tersedia dalam bentuk pre-swollen

♦ Fasa gerak: mengandung pelarut organik, surfaktan mis 1%SDS, urea 8M, guanidin hidroklorida 6M

♦ sepachryl S-400 dan S-500: pemisahan polisakarida

dan makromolekul lain

♦ Sepachryl S-1000: pemisahan fragmen restriksi DNA,

polisakarida sangat besar,

proteoglikan

● Superdex

● Biogel

♦ agarosa dan dextran

♦ Fraksinasi protein dengan laju alir tinggi

♦ Biogel A: CL agarosa

♦ Biogel B: CL poliakrilamida

Kisaran

Bobot molekul

Kisaran

Bobot molekul

Sephadex globular linier globular linier

G-10 <700 <700 Sepharosa

G-15 <1500 <1500 6B/CL-6B 104 – 4x106 104 – 1x106

G-25 Coarse 1000-5000 100-5000 4B/Cl-4B 6x104 – 2x107 3x104 – 5x106

Medium 2B/CL-2B 7x104 - 4x107 10x104 -

2x107

Fine

Superfine Sephacryl

G-50 Coarse 1500-30000 500-10000 S-200 Spfn 5000– 25x104 1000-8x104

Medium S-300 Spfn 10000-1.5x106 2000-4x105

Fine S-400 Spfn 20000-8x106 10000-2x106

Superfine S-500 Spfn 40000-2x107

G-75 3000-80000 1000-50000 S-1000 Spfn 5x105->108

Superfine 3000-70000

G-100 4000-150000 1000-100000

Superfine 4000-100000

G-150 5000-300000 1000-150000

Superfine 5000-150000

G-200 5000-600000 1000-200000

Superfine 5000-250000

Soal era create

• Gel dengan kemampuan memisahkan pada

kisaran BM lebih rendah akan memiliki nomor G

lebih kecil untuk sephadex sementara untuk

sephacryl akan memiliki nomor S lebih tinggi

(benar atau salah)

• Kisaran BM pemisahan molekul untuk suatu tipe

gel tertentu lebih besar untuk molekul globular

dibandingkan molekul linier (benar atau salah)

Sephadex

40-120 μm (G-10, G-15, G75-200 bukan superfine) 100-300 μm (coarse), 50-150 μm (medium), 20-80 μm (fine) dan 10-40 μm (superfine)

● Ukuran partikel

Coarse

Medium

Fine

Superfine

Untuk filtrasi yang perlu laju alir cepat pada tekanan rendah

Untuk tujuan preparatif

Untuk kolom dengan resolusi tinggi dan KLT

● Stabilitas kimia sephadex

○ tidak larut dalam semua pelarut (kecuali telah terdegradasi)

○ Stabil dalam air, larutan garam, pelarut organik,

larutan basa dan asam lemah.

○ Pada larutan asam kuat, ikatan glikosida pada matrix

gel terhidrolisis

○ Tidak berubah sifat dalam HCl 0,1 M selama 1-2 jam,

dan dalam HCl 0,02M selama 6 bulan.

○ pereaksi yang bersifat oksidator merusak struktur gel

● Stabilitas fisika sephadex

○ dapat disterilisasi, 30 menit, 120oC. Pemanasan dengan T>1200C sephadex rusak membentuk karamel

○ Derajat ikatan silang tinggi (G-10 dan G-15), kaku, hanya untuk laju alir rendah

○ Derajat ikatan silang rendah (G-200 & G-150) dapat dipadatkan

● Sifat kromatografis sephadex

○ selektivitas

○ Penyimpangan sifat

Tiap tipe G punya batas kisaran BM berbeda

• Molekul kecil pada G dengan ikatan silang tinggi (G-10 & G-15) mengalami penyimpangan elusi, tidak selalu seperti aturan elusi

▪ Molekul dengan BM>limit ekslusi tertinggi, tidak ditahan, keluar lebih dulu

▪ Molekul kecil masuk ke pori gel, ditahan dan keluar lebih dulu yang berukuran besar

▪ Molekul-molekul < limit eksklusi terkecil, masuk ke pori gel, ditahan sangat lama dan keluar paling akhir tanpa pemisahan jelas

•Ada interaksi ionik dan interaksi aromatik

Senyawa aromatik berinteraksi dengan sephadex & terelusi paling akhir

Diatur dengan mengubah kekuatan ionik dan pH, dapat dihilangkan dg pelarut fenol-asam asetat-air & urea 8M

(Interaksi bertambah bila pelarutnya metanol dan etanol)

Gugus karboksil pada sephadex ; interaksi dengan contoh bermuatan

Zat bermuatan positif ditahan, negatif keluar (tidak ditahan)

Dihilangkan dengan pelarut berkekuatan ionik tinggi (>0,02M)

APLIKASI KROMATOGRAFI EKSKLUSI

● Analisis campuran molekul dengan BM berbeda

● Desalting

● Penentuan Bobot molekul

○ Pemisahan rafinosa, maltosa, glukosa, menggunakan sphadex, pH 7 laju alir 5 ml/menit, eluen H2O

○ Pembebasan garam dan senyawa berBM rendah dari molekul makro

○ Bobot molekul protein, dextran, etilenaglikol

○ Pemisahan berbagai protein/enzim

○ Pemisahan asam nukleat dari nukleotida

70

90

110

130

150

170

190

210

230

250 Volu

me e

lusi (m

L)

104 105 106

Bobot molekul

Gambar: volume eluesi sebagai fungsi dari bobot molekul protein pada sephedex G-200, pH 7,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

Ve

/V0

Blue dextran

sukrosa

Kurva kalibrasi untuk penetapan bobot molekul

pada kromatografi ekslusi

Preparasi Kolom Filtrasi Gel

● Sephacryl, superdex, superosa, sepharosa

Preswollen tapi mengandung etanol20% sebagai pengawet Perlu dilarutkan dalam eluen sebelum dimasukkan ke kolom

● Sephadex, Bio-Gel-P

Harus digembungkan/dikembangkan dulu dengan eluen dalam waktu tertentu

Sephadex G10 2-3 3 1

Sephadex G15 2,5-3,5 3 1

Sephadex G25 4-6 6 2

Sephadex G50 9-11 6 2

Sephadex G75 12-15 24 3

Sephadex G100 15-20 28 5

Sephadex G150 18-20*; 20-30 72 5

Sephadex 200 20-25*; 30-40 75 5

Bio-GelP-2 3 4

Bio-Gel P-4 4 4

Bio-Gel P-6 6,5 4

Bio-Gel P-10 7,5 4

Bio-Gel P-30 9 4

Bio-Gel P-60 11 4

Bio-Gel P-100 12 4

Jenis gel Volume

pack

(ml/g ±10%

Waktu hidrasi (jam)

20oC 100oC

Saringan Molekul Anorganik: Zeolit

Struktur Zeolit:

○Molekul tetrahedral yang bergabung, ada rongga rongga besar yang dihubungkan oleh saluran kecil.

○Penampang lintang saluran kecil menentukan ukuran molekul yang dapat masuk ke rongga

○ Ukuran & posisi ion logam (mis Na, Ca) dalam kristal

zeolit & jaringan rangka tetrahedral alumina silikat zeolit,

menentukan diameter efektif saluran kecil

◊ tipe saringan molekular 5A: 4A yang punya K & Ca sbg pengganti Na)

Etana, alkohol 4C, nasuk rongga

Siklopropana , senyawa aromatik tidak masuk rongga

◊ tipe 10X dan 13X: Na8(AlO2)80(SiO2)106

○Tipe zeolit

◊ tipe saringan molekular 4A: [Na12(AlO2)12(SiO2)12

molekul <4A spt H2O, CO2, H2S, SO2 dan hk 2C masuk ke rongga

Soal era create

• Waktu hidrasi dipengaruhi oleh suhu saat hidrasi

dilakukan, makin tinggi suhu makin lama waktu yang

diperlukan (benar atau salah)

• Bila ingin membuat kolom Sephadex G25 dengan

ketinggian 15 cm pada kolom gelas dengan diameter 1,5

(a) berapa gram sephadex yang dibutuhkan

• Jawab : volume = luas diameter x tinggi kolom = R2 =

3.14 x 0.75 cm x 0.75 cm x 15 cm = 26.5 ml ; volume

paking 4-6 ml/g untuk menghasilkan 26,5 ml gel jadi

diperlukan = 26,5 ml x 1 gram resin kering/4-6 ml =

4.4-6,6 gram

• (b) berapa jumlah tersebut bila diameter kolom 3 cm

Soal kromatografi Ekslusi

Soal

Polifinil standar dengan berbagai bobot molekul

dianalisis melalui kromatografi ekslusi mengasilkan

data sebagaimana pada tabel

Suatu sampel yang mengadung polyfinil dianalisis

dan menghasilkan volume retensi sebesar 8.45

Perkirakan bobot molekul sampel

Soal penetapan bobot molekul dengan

kromatografi ekslusi

• Suatu kolom sephadex

G-70 dengan dimensi 25

x 35 cm2 memberikan

hasil sebagai Tabel

berikut :

• Tentukan bobot molekul

suatu zat yang terelusi

dengan volume eluen

76.5 ml

protein Mr Volume

eluen

(ml)

Ribonuklease 13.700 109.5

Aldolase 158.000 55.0

Blue dextran 2 x 107 53.1

Ovalbumin 4.7 x103 71.8

Pemisahan protein dengan

kromatografi ekslusi

protein Mr Volume eluen (ml)

Ribonuklease 13.700 109.5

Aldolase 158.000 55.0

Blue dextran 2 x 107 53.1

Ovalbumin 4.7 x 103 71.8

KROMATOGRAFI

PERTUKARAN ION

PERTEMUAN MINGGU 12,13 14

D3 KIMIA 2009

KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

• PRINSIP

• BAHAN PENUKAR ION

• PEMILIHAN PENUKAR ION

• REGENERASI PENUKAR ION

• PEMBUATAN KOLOM PENUKAR ION DAN APLIKASI SAMPEL

• PEMISAHAN SENYAWA BM RENDAH

• PEMISAHAN SENYAWA BM TINGGI

• KROMATOGRAFI PERTUKARAN LIGAN

• Pemisahan molekul bermuatan berdasarkan kesetimbangan antar ion immobil dan ion mobil dengan muatan berlawanan

• Ion immobil berikatan kovalen dengan matrik polimer fasa diam;

• counter ion

– menetralkan ion immobil

– dapat dipertukarkan dengan ion bermuatan sejenis

• Penukar kation : ion immobil – /counter ion +

• Penukar anion : ion immobil +/ counter ion -

PRINSIP KROMATOGRAFI

PERTUKARAN ION

3B- PA

+ +

+ PA

+ +

+ 3A-

A- A-

A-

B-

B-

B-

+ + +

3N+ PK

- -

- PK

- -

- 3M+

M+ M+

M+

N+ N+

N+

+ + +

PRINSIP KROMATOGRAFI

PERTUKARAN ION

PA = Penukar Anion

PK = Penukar Kation

PA suatu penukar anion; terdiri dari matrik yang memiliki ion immobil (muatan + atau suatu kation). Kation ini dinetralkan dengan cara mengikat anion A- (suatu ion counter).

Pada reaksi pertukaran anion A- digantikan oleh anion B-, anion A- suatu ion mobil, B- pun disebut ion mobil karena kemudian dapat ditukar lagi dengan anion yang lain

anion lain yang kekuatan pengikatannya terhadap ion immobil lebih besar juga selanjutnya dapat mengusir B- dari posisi terikat (B lepas dari), demikian seterusnya dengan anion-anion lainnya.

PRINSIP KROMATOGRAFI

PERTUKARAN ION

Resin

Bahan fase diam dalam kromatografi pertukaran ion berupa manik terbuat dari kopolimer polistirena yang mengandung ikatan silang (cross linkage) divinil benzen

Suatu gugus bermuatan (gugus fungsional) terikat pada matrik/resin menentukan sifat bahan : sebagai PA atau PK; kuat atau lemah.

Jumlah ikatan silang menentukan sifat bahan resin, untuk pemisahan molekul Mr besar atau kecil

BAHAN KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

Resin sintetik pertama

• Diaplikasikan pada proses demineralisasi,

pengolahan air, recovery ion dalam limbah

• Matriks hidrofobik

• Crosslinking tinggi porositas kecil tidak bisa

untuk protein/makromolekul

Untuk biologi:

• selulosa, hirofilik, tidak merusak protein

• Kapasitas rendah

BAHAN KROMATOGRAFI

PERTUKARAN ION

Contoh aplikasi PA dan PK pada

pengolahan/pemurnian air

Misal : Air

dengan ion Cl-

dan Na+

PA Air dengan

OH- Na+

PK

1

2

Air dengan

OH- Na+

3

Air dengan OH- H+

(air murni)

4

1. Reaksi pada kolom

penukar anion (PA)

Pemurnian air dengan resin penukar ion

2. Reaksi pada kolom

penukar kation

Rz+OH- +Cl- Rz+Cl-

+ OH-

Rz-H+ + Na+ Rz-Na+

+ H+

Rz+ OH- : resin penukar anion dengan

counter ion OH-

Rz+Cl : resin penukar anion dengan counter

ion Cl-

Terjadi pertukaran ion Cl oleh OH-, air

yang keluar kolom tidak mengadung Cl-

PK ?

Bahan penukar ion

X

X

X

Gugus fungsional bermuatan +

atau -

Matrix : silika, resin (polistirena,

polieter) polisakarida (selulosa,

dekstran, agarosa)

Tabel : Penukar ion yang umum, jenis penukar,

matrik, gugus fungsi dan contoh produk

berikut

tipe matrix Gugus fungsi Produk

komersial

Asam

lemah

(PK)

As poliakrilat

Polistiren

Selulosa

Dextran

Agarosa

-COO-

-CH2COO-

-CH2COO-

-CH2COO-

-CH2COO-

Asam

kuat

(PK)

Polistiren

Dextran

Polistiren

Polistiren

-SO3-

-CH2-CH2-CH2-SO3-

-CH2-CH2-SO3-

-CH2-CH2-CH2-SO3-

Amberlite,

SP-Sephad

Poros S

Poros SP

Penukar ion yang umum

tipe matrix Gugus fungsi Produk komersial

Basa

lemah

(PA)

Polistiren

Dekstrosa

Dekstran

Agarose

-CH2NH+R2

-CH2CH2NH+(CH2CH3)2

-CH2CH2NH+(CH2CH3)2

CH2CH2NH+(CH2CH3)2

Amberlite IR45

DEAE Sephacryl

DEAE Sepha

DEAE Sepha

Basa

kuat

(PA)

Polistiren

Selulosa

Dextran

Polistiren

-CH2N+(CH2)2

-CH2-CH2N+(CH2CH3)3

-CH2-CH2N+(CH2CH3)2

CH2-CH(OH)CH3

Kuarterner ionpolietilamin

Biorad AG-1

Cellex T

ClAE sephadex

Poros SP

Penukar ion yang umum

Gugus fungsional bermuatan

• Gugus asam kuat : RSO2O-, H+

• Gugus basa kuat : R-N+(R’)3,OH- Terionisasi sempurna

• Gugus asam lemah : RCOO-,H+

• Gugus basa lemah : amina (RN+H3,OH-)

Bahan penukar ion

sufonat gugus fungsional

pembentuk asam kuat ;

amonium kuarterner gugus

fungsional pembentuk basa

kuat terionisasi sempurna

Karbonil gugus fungsional pembentuk

asam lemah; amina gugus fungsional

pembentuk basa lemah terionisasi

sebagian, tergatung pH lingkungan

Gugus Fungsional Bermuatan

• Sifat penting penukar ion

• Jenis gugus : menentukan Tipe, kekuatan dan Kapasitas

• Gugus fungsi Penukar Anion (PA)

– amino etil (AE)

– dietilaminoetil (DEAE)

– quarternary aminoetil (QAE)

• Gugus fungsi Penukar Kation (PK)

– karboksimetil (CM)

– phospho

– sulphoproyl (SP)

penukar ion kuat terionisasi sempurna pada kisaran pH

yang luas, kapasitas tidak bergantung pH,

Bahan penukar ion

Gugus fungsi bermuatan

• AE --OCH2CH2NH3+

• DEAE --OCH2CH2NH+(CH2CH3)2

• QAE

--OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

• CM --OCH2COO-

• Phospho --PO4H2-

• SP --CH2CH2CH2SO3-

Bahan penukar ion

• Soal Bahan Penukar ion :

• Diketahui informasi suatu bahan penukar sebagai berikut: kopolimer stiren divinil benzen, gugus fungsional sulfonat contoh nama dagang Dowex 50 W X8 (kopolimer stiren dengan DVB 8%). Benar atau salah atau Mana yang benar dari pilihan berikut :

1. Jenis PK atau PA

2. Gugs fungsi kuat/ lemah

3. Lebih tinggi porositasnya dibandingkan kopolimer yang sejenis dengan 20%DVB

4. Dapat menukar Mg2+, tidak menukar Cl-

5. Afinitas terhadap Cd2+> K+

6. Kapasitas total ~ jumlah HSO3-/ gram bahan

7. Suatu bahan hidrifob/hidrofil

8. Matrik penukar bahan alami/ bahan sintetik

9. Kapasitas total pada pH 5 = kapasitas pada pH 10

Kapasitas Pertukaran

• Kemampuan untuk mengambil counter ion yang dapat ditukar

• Jumlah gugus bermuatan/gram penukar ion (kapasitas total)

• Kapasitas tersedia = kapasitas yang benar-benar ada saat perlakuan dipengaruhi oleh

– Gugus fungsional (ascessibility)

– Konsentrasi eluen

– Sifat counter ion

– Selektifitas gugus fungsi

– pH eluen (terutama untuk penukar ion lemah)

Kapasitas Pertukaran

• Kapasitas break through = kapasitas satu

kolom, dipengaruhi oleh laju eluen,

kapasitas meningkat dengan menurunnya

laju.

• Ukuran butir juga mempengaruhi

kapasitas

Kapasitas Pertukaran

• PA atau PK kuat

– Kapasitas tak bergantung pH

– Kapasitas pertukaran tetap

– Sulfonat dan amonium quarterner

• PA atau PK lemah

– Kapasitas bergantung pH

– COO- (CM) : penukar kation bila pH cukup tinggi untuk

disosiasi –COOH kisaran kerja pH 5 -14

– Amina tersier : penukar anion bila pH rendah (asam)

gugus bermuatan + pada N kisaran kerja pH 1 - 9

Kapasitas pertukaran

Ilustrasi Kapasitas tersedia dan kapaitas total:

• Suatu PK akan ditentukan kapasitas penukarannya terhadap ion Cd2+ yang terdapat dalam dua contoh yang berbeda, (1) air laut dan (2) larutan kadmium nitrat 50 ppm

• Kapasitas PK terhadap Cd2+ pada (1) > (2) sebab contoh 2 selain mengadung Cd2+ juga mengandung kation lain yang sama-sama dapat terikat pada gugus fungsional, (PK tidak selektif pada kation Cd)

• Bila digunakan PK lemah, kapasitas pada keduanya lebih besar pada pH 10 dibandingkan pada pH 3 (pada pH rendah ionisasi gugus fungsional pada matrik tidak sempurna

• Asam sangat lemah tidak ditahan oleh resin penukar anion dengan basa lemah

Kapasitas pertukaran

• Jumlah total ekivalen H+ yang

dipertukarkan per unit volume atau unit

massa resin

• Nilainya bergantung tahanan zat terlarut

sehingga hanya ion dengan kapasitas

tinggi saja yang digunakan untuk

pemisahan campuran yang kompleks/

karena kenaikan tahanan zat terlarut

Kesetimbangan pertukaran ion

• resin-H+ + K+ resin-K+ + H+

• Koefisien selektivitas kK/H

• Afinitas (pengikatan K oleh resin)

– muatan ion ( )

– ukuran ion tersovatasi ( )

– polarisabilitas ion ( )

K K/H (K+)r (H+)

(H+)r (K+) =

larutan larutan

Faktor pemisahan (retensi relatif) =

Misalnya K+ dan Na+ dengan resin-H+

K/Na = kK/H

kNa/H

kK/Na =

Kesetimbangan

pertukaran ion

= kd1

kd2

1, 2 = ion-ion

dalam campuran

, K/Na

Kasetimbangan pertukaran ion

Resin-H

NaCl

Resin-Na

HCl

Resin-H + NaCl Resin-Na + HCl

Donnan : Kesetimbangan antara bagian

dalam resin dengan larutan di luar

penggantian ion swelling

Kesetimbangan pertukaran ion

Kation anorganik

• Afinitas gol IA dan IIA meningkat dengan meningkatnya BA

• Hidrasi ion mengurangi afinitas

Anion Anorganik dan Organik

• Pada amberlite (poliamina) daya pertukaran hidroksida>sulfat>kromat>sitrat>tartrat>nitrat>arsenat>fosfat>molibdat>asetat=iodida=bromida>klorida>fluorida

• Reaksi resin-Cl + Na-borat semua Cl terdesorpsi tanpa diganti borat

Aturan umum afinitas pertukaran ion

• Pada C rendah dan T biasa, berlangsungnya pertukaran meningkat dengan meningkatnya valensi ion Na+<Ca2+<Al3+<Th4+ (Th4+ tertinggi peluang diikatnya oleh suatu PK)

• Pada C rendah dan T biasa, dan valensi ion sama, pertukaran meningkat dengan meningkatnya nomor atom ion Li+<Na+<K+= NH4

+<Rb+<Cs+<Ag+<Be2+<Mn2+<Mg2+= Zn2+<Cu2+=Ni2+< Cs2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+

• Pada C tinggi, perbedaan potensial pertukaran ion yang berbeda valensi, berkurang bahkan adakalanya terbalik

• Pada T tinggi, dalam media non aq, atau C tinggi potensial pertukaran ion yang bermuatan sama akan sama

Aturan umum afinitas pertukaran ion

• Potensial pertukaran oleh ion H+ dan OH-

bervariasi sesuai dg sifat gugus fungsi dan

kekuatan asam/basa yang terbentuk antara

gugus fungsi dan ion tsb. Semakin kuat asam/

basa, semakin rendah potensial pertukaran.

• Pada penukar basa lemah, urutan pertukaran

OH-> SO42-, CrO4

2->sitrat, tartrat > NO3-> AsO4

3-

>PO43->MoO4

->asetat > I-, Br- = Cl-> F-.

Elusi

• Ion yang terikat pada resin dielusi dengan cara

– Displacement, oleh ion yang teradsorpsi lebih kuat

– Larutan pekat ion lain

– Pengkompleks

• Konstanta kesetimbangan distribusi ion antara larutan dan resin Kd Koefisien distribusi

Kd Ms/massa resin

Ml/vol. larutan = =

Ms

Ml massa-resin

V-larutan X

Ms dan Ml fraksi M dalam resin dan larutan

Faktor pemisahan

Kd1

Kd2

=

Regenerasi Resin

• Proses mengembalikan resin yang telah digunakan ke kondisi semula/sebelum digunakan

• Jumlah bahan organik yang tetap berasosiasi dengan penukar ion setelah elusi: kolom dicuci dengan buffer atau garam kuat mis (NaCl) setimbangkan lagi

• Kontaminan yang terikat kuat/ permanen pada resin bagian tersebut dibuang

• Sisa resin dikeluarkan cuci

Pengepakan kolom

Perhatikan bahan penukar ion :

1. Resin bekas jangan dibuangregenerasi simpan dalam wadah tertutup dan jaga tetap lembab

2. Pre Swell resin sebelum dipakai.

3. Resin kering akan mengembang dalam air (terutama 2x dan 4 x). Semakin tinggi derajat CL makin rendah pengembangannya

4. Resin direndam dalam air sampai volumenya tampak tidak bertambah lagi udara terjebak, lepas

5. Untuk pemisahan yang baik, gunakan resin yang kecil, semakin kecil pertukaran makin cepat.

Pengepakan kolom

6. Resin yg baru (dari botol) harus dibersihkan agar didapat hasil yang reproducible. Resin Pa. tidak perlu dibersihkan

Cara

Resin diekstraksi dalam soxhlet,

Mula-mula dengan HCl 2-3M, sampai ekstrak jernih dilanjutkan dengan NaOH 2-3 N, sampai ekstrak jernih, dengan etanol 95% sampai ekstrak jernih bilas resin dengan air sampai air bilasan netral dan bebas garam jaga kelembaban.

5 4

2

1

resin

air

air

Cara 1 3

Kolom diletakkan vertikal

1.Glasswool pd bagian bawah

2.Diisi air ½ kolom

3.Resin dimasukkan sedikit2

4.Air dialirkan balik udara

terusir

5.Aliran air dihentikan

6.Air yang berlebih

dikeluarkan sisakan

setinggi 2 mm

1.Glasswool pada

dasar kolom

2.Bubur kental resin

15-30 ml pelarut/ g

resin kering, 6 ml

pelarut/ g resin basah

3.Pelarut bubur

dikeluarkan

Cara 2 Bubur resin

1

3

Cara penyiapan Sampel

• Sampel padat bebas garam larutkan

dalam starting buffer atur pH

• Sampel padat bergaram larutkan dalam

starting buffer dialisis atau lewatkan

pada media permeasi gel molekul

besar bebas, garam terikat

• aplikasi

Aplikasi sampel

• Cara mengaplikasikan sampel ke kolom dapat memengaruhi pemisahan

• Sampel tidak dalam kesetimbangan dengan buffer awal bisa terjadi gradien garam pola elusi non reproducible

• Penambahan sampel tidak tepat puncak tidak simetris & recovery berkurang

• V dan C tidak sesuai dg kapasitas kolom resolusi buruk

• Cara :

Pemisahan senyawa ber-Mr tinggi

• Contoh pada pemisahan protein

– Mr besar,

– kestabilan ?

– Buffer anion (fosfat/asetat) bila pakai penukar kation; buffer kation (tris) untuk penukar anion

• Elusi

– Gradien pH, bila pH > pI protein lepas / utk PK

– Gradien garam selanjutnya perlu desalting

Aplikasi

Pemisahan senyawa ber-Mr rendah

Senyawa Mr rendah dengan muatan sama

• Kolom polistiren

• Kolom dengan partikel kecil

• Elusi pompa

– Isokratik

– Gradien

• Eluen

– ion

– gradien pH

Aplikasi

Pemisahan dan analisis asam amino dengan

Amino Acid Analyzer

• Digunakan kolom penukar kation asam kuat

• Cuplikan pada pH awal 2 asam amino +

• Elusi gradien, pH naik,

• Pada pH < pI asam amino sebagai kation, terikat pada resin PK

• Pada pH ≥ PI a.amino netral atau negatif (anion) maka tidak terikat lagi pada PK, terelusi – Asam amino asam & netral keluar berurutan pKa1.

– Asam amino basa keluar terakhir

• Deteksi : reaksi ninhidrin

Aplikasi

Pemisahan aldehida, keton, alkohol

• ~CO + ion H-sulfit senyawa lainterikat

kuat pada anion ex,

• alkohol + H-sulfit

keton dan aldehid terpisah dari alkohol

• + air panas keton terpisah

• + NaCl, (aldehida keluar kolom terahir)

Aplikasi

Pemisahan asam • kekuatan terhadap anion ex kuat elusi

dengan asam kuat atau elusi gradien buffer & pH menurun asam paling lemah keluar paling cepat

• Asam2 amino kation ex as amino pH < pI kation

• Asam dengan kekuatan berbeda

• Anion ex lemah asam dengan Ka kecil sedikit terikat: bila Ka < K ex asam bebas, HCN, borat, fosfat, sulfat, HCl

Aplikasi

Pemisahan sakarida/gula

• Gula + ion borat kompleks (kestabilan =)

monosakarida > disakarida terpisah,

mono-sk (heksosa, pentosa, tetrosa)

dipisah buffer borat gradien pH 7-10

•

Aplikasi

Kromatografi pertukaran ligan

• Bentuk lain aplikasi kromatografi pertukaran ion contoh pemisahan macam2 kafein sbb :

• Resin-Cu2+ pertama mengikat ligan NH3 Resin-Cu(NH3)4

2+

• Analat suatu ligan yg membentuk kompleks lebih kuat lalu dialirkan ligan NH3 terganti

• R-Cu(HN3)42+ + 4kaf R-Cu(kaf)4

2+ + 4NH3

• Elusi dengan NH3 berlebih pengusiran kafein lagi : kafein yang kekuatan kompleksnya paling lemah akan terelusi paling dulu

• R-Cu(kaf)42+ + NH3 (berlebih) R-Cu(NH3)4

2+ + Kaf …

Aplikasi

Polimer/matrik penukar ion

dengan gugus sulfonat

CH=CH2 CH-CH n

n

Polistiren dg

gugus sufonat

SO3- SO3-

Bahan Penukar Ion

CH=CH2 CH-CH n

n

stiren

polistiren

Contoh Polimer /matrik

Bahan Penukar Ion

CL = Cross linkage

(= ikatan silang)

• Diperoleh dari kopolimerisasi

• Misal : divinil benzen (DVB) dan polistiren (PS)

CH=CH2

stiren

+

H2C-CH HC-----CH2

CH2 CH CH2

CH CH C2H CH C2H CH2

CH=CH2

CH=CH2

divinilbenzen

Dowex…X4 = polistiren

dengan 4% DVB

Bahan Penukar Ion

Aplikasi pertukaran ion

• 3 kelompok aplikasi ; pengolahan air, pemekatan dan pemisahan:

• Contoh terapan pemisahan:

• Dowex 2 untuk memisahkan campuran anion halogen dengan urutan F-,C-l,Br-, I- dengan NaNO3 pH 10,4 sebagai eluen

• Dowex 50 dan amberlite120 sulfonated untuk pemisahan golongan alkali dan alkali tanah; Li+,Na+,K+ dengan eluen HC l0,7 M

• Ca2+, Sr2+, Ba2+ eluen dengan eluen 1,2 M asam laktat

• Pengaruh pH terhadap pemisahan asam amino

• Tiga bentuk asam amino saling berkesetimbangan yang dipengaruhi pH, pada kondisi lebih basa dari PI asam amino bermuatan negatif, sebaliknya pada pH < PI

• Asam amino bermuatan negatif dipertukarkan dengan PA

Aplikasi pertukaran ion

R-C-C=O

O-

NH2

H

-H+

R-C-C=O

OH NH3

H

+

R-C-C=O

O-

NH3

H

+

+H+

pI pH < pI

Bentuk kation pada

suasana lebih asam

pH > pI

Bentuk anion pada pH .

> PI

Muata

n b

ers

ih p

rote

in

pH

2 4 6 8 10

+

-

TITIK ISOELEKTRIK

PA

PK

PA penukar Anion

PK penukar Kation

Cu Zn Co Fe

4 8 [HCl]

Larutan contoh yang mengandung ion-ion: Mn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+,

Fe3+, Zn2+.dilalukan pada kolom penukar anion Dowex 1. Ion ion

Co2+, Cu2+, Fe3+, Zn2+ membentuk kompleks bermuatan negatif

dengan ligan Cl-, Mg2+ dan Ni2+ tidak. Diketahui koefisien distribusi

berbagai ion kompleks tersebut sebagai fungsi konsentrasi larutan

HCl seperti gambar berikut (Gambar 16.7, Cristian,ed 4):

Bagaimana urutan pemisahan kation-kation bila campuran

tersebut dimasukan ke dalam kolom berisi Dowex 1 yang direndam

dalam HCl 10 M dan dielusi menggunakan eluen larutan HCl

dengan konsentrasi yang semakin kecil (elusi bergradien)

Mn Ni

D = koefisien distribusi,

[M]s

[M]m D =

[M]s, konsentrasi ion logam

terikat di fase diam

[M]m konsentrasi ion logam

di fase gerak.

4 4 8 8

• Ni2+ bukan anion, akan terelusi paling dulu

dalam HCl 12 M, kemudian Mn2+ terelusi dalam

HCl 6M, Co2+ pada HCl 4M, Cu2+ pada HCl

2,5M, Fe3+ terelusi pada HCl 0,5M dan Zn2+

pada konsentrasi 0,05 M.

Jawab

Kesetimbangan pertukaran ion

Koefisien distribusi, D

atau Kd = [K+] pada larutan

[K+] pada resin

[RSO3-B+]s[H+]

Kex = konstanta pertukaran = --------------------

[RSO3-H+]s[Na+]

Kex >>> afinitas resin terhadap B+ besar B+ diikat H+,

dilepas

Informasi label pada bahan penukar ion

• Contoh : Strongly acidic, sufphonic acid, Na +, 20-50 mesh, medium porosity/8X, 4, meq/g dry.

• Penukar kation, asam sulfonat, kation untuk ditukar Na+, ukuran melewati 20 mesh, tidak pada 50 mesh

• 8X derajat ikatan silang, 8% DVB porositas medium

• Kapasitas pertukaran: 4,4 meq/g resin

Detektor kromatografi penukar ion

• Luaran suatu kolom penukar ion adalah

ion- ion analat dapat dideteksi dengan

konduktometer

Asam, amino basa asam amino basa

• Asam amino asam

• Asam aspartat : R = CH2COO-

• Asam glutamat : R = CH2-CH2COO-

• Asam amino basa

• Lisinina : R = (CH2)4NH2

• Arginina : R = (CH2)3NHC(NH2)(=NH)

• Histidina : R = CH2-C=CH

\ asama amino asam dan basa //

CH