View
226
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
orgánově nespecifickéEndomysiumAnti - mitochondrieAnti – jaderné
ANA – antinuclear autoantibodiesANF
orgánově specifickéANCA (granulocyty)GBM (ledvina)LKM (játra, ledvina)
Laboratorní diagnostika autoprotilátek
Laboratorní diagnostika autoprotilátek ANA (IgG) skríning Autoprotilátky proti antigénom bunkového jadra ENA (IgG) skríning Skríning, resp. konfirmácia autoprotilátok proti extrahovateľným ENA konfirmácia jadrovým antigénom (SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, RNP, Sm) Anti ds-DNA Autoprotilátky triedy IgG, IgA, IgM proti dvojvláknovej DNA Anti-DNP Autoprotilátky proti deoxyribonukleoproteínu ANCA skríning Antineutrofilné cytoplazmatické protilátky cANCA (PR-3) Antineutrofilné cytoplazmatické protilátky typu Proteináza 3 pANCA (MPO) Antineutrofilné cytoplazmatické protilátky typu Myeloperoxidáza Anti GBM (IgG) Autoprotilátky proti glomerulárnej bazálnej membráne ACLA (IgG-A-M) skríning Autoprotilátky triedy IgG, IgA, IgM proti kardiolipínu tTG (IgG) Autoprotilátky triedy IgG proti tkanivovej transglutamináze tTG (IgA) Autoprotilátky triedy IgA proti tkanivovej transglutamináze AGA (IgG) Protilátky triedy IgG proti gliadínu AGA (IgA) Protilátky triedy IgA proti gliadínu ASCA (IgG-A-M) Autoprotilátky proti sacharomyces cerevisiae AIH/PBC (IgG) skríning Skríning, resp. konfirmácia primárnej biliárnej cirhózy AIH / PBC konfirmácia pri autoimunitnej hepatitíde (AMA-M2, LKM-1, LC-1, SLA / LP) ASMA Autoprotilátky proti hladkému svalstvu Priečne pruhovaný sval Autoprotilátky proti priečne pruhovanému svalstvu
Autoprotilátky proti antigénom neurónov Anti-Hu (ANNA-1), Anti-Ri (ANNA-2), Anti-Yo (APCA)
Neuro panel
organ. specificke
6%ANCA14%
ANA67%
organ nespec.6%
endomysium7%
Statistika diagnostiky autoprotilátek
r. 1948 - Hargraves popsal fenomén LE - buněkLE - buňka je polymorfonukleární leukocyt, který fagocytoval uvolněný jaderný materiál jiného leukocytuDetekce LE - buněk se stala laboratorní metodou průkazu SLE, ale i u RA, SS
r.1957- metoda nepřímé imunofluorescence, která zachycuje mnohem širší spektrum ANA (ANF)60. léta - metody imunodifuze vedly k přesnější detekci nových autoprotilátkových specifit, např.anti-Sm, anti nRNP, anti-SSA/Ro…70. léta - dosud rozvoj laboratorních technik a metod- imunodifuze, radioaktivní imuniprecipitace, ELISA…
Anti jaderné protilátky (ANA)
Nepřímá imunofluorescence -NIF
Sérová protilátkaKonjugát,
protilátka značená FITC
Tkáňový řez, buňka
UV světlo
Viditelné světlo
Jaderné autoantigenypolynukleotidyhistonyribonukleoproteinyantigeny jadérekcentroméradalší antigeny
Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy
buněčné organelyantigeny cytoskeletudalší antigeny
Antigeny asociované s dělením buňky
centrioladělící vřeténkoseparační zóna buňky
NIF - HEp-2 buňky
Jaderné autoantigeny
polynukleotidy
histony
ribonukleoproteiny
antigeny jadérek
centroméra
další antigeny
dsDNAssDNARNA
H1,H2A,H2B, H3…...
U1-nRNP, Sm, SS-A, SS-B
U3-nRNP/Fibrilarin, RNA- polymeráza 1, Pm-Scl, 7-2-RNP (To),organizér jadérka
Proteiny kinetochoru
Scl-70Cyclin(PCNA)jaderné granulaKu
NIF - HEp-2 buňky
Terminologie IF obrazů na HEp-2Homogenní jaderná membránaPóry v jaderné membráněHomogenní jaderná plazmaHomogenní jaderná fluorescence s poz. fluorescencí jadérekHomogenní jaderná fluorescence s neg. fluorescencí jadérekHomogenní obraz podobný Scl-70
Terminologie IF obrazů na HEp-2Jaderná fluorescence s velkými skvrnami (matrice)Hrubá skvrnitá fluorescenceJemná skvrnitá fluorescenceRůznorodá zrnitá fluorescence (anti-PCNA)Chromatinová destičkaCentromérová fluorescenceČetné jaderné tečkyOjedinělé jaderné tečky (svinutá tělíska)
Terminologie IF obrazů na HEp-2Homogenní jadérkaChuchvalcovitá jadérkaTečkovitá jadérkaCentriolyPóly dělícího vřeténka (NuMA)Vlákna dělícího vřeténkaDělící tělísko (MSA-2)
Terminologie IF obrazů na HEp-2Jemně zrnitý cytoplazmatický obrazDifúzní cytoplazmatický obrazMitochondriální obrazLysozomální, peroxizómový obrazGolgiho aparátAktinVimentin
Typ fluorescence ANA OnemocněníHomogenní anti-histonové SLE, RA, LI-SLE, JCA
anti-dsDNA SLEMembránový anti-dsDNA SLE
anti-laminové SLESkvrnitý/zrnitý anti-U1 RNP MCTD, SLE
anti-Sm SLEanti-SS-B SS, SLE, vzácně RA
anti-SS-ASS, SLE, neonatální lupus, řídce RA
anti-PCNA/cyklin SLEanti-Ku SLE, SCL/DManti-Scl-70 SCL
jadérkový/nukleolární anti-ribozomální RNP SLEhomogenní anti-PM-Scl SCL/DM
chomáčkovitý anti-U3 RNP (fibrilarin) SCLskvrnitý anti-RNA polymeráza I SCL
Tečkovaný anti-centromerové CRESTCytoplazmatický anti-tRNA syntetázy (Jo-1,Pl-7) PM/DM
anti-ribozomální RNP SLEanti-SS-A SLEanti-mitochondriální PBC
Anti - jaderné protilátky (ANA)
SLE - systémový lupus erythematodes, LI-SLE - léky indukovaný SLE, RA - revmatoidní artritida, SS - Sjögrenův syndrom, SCL -systémová sklerodermie, PM/DM - polymyozitida/dermatomyozitida, CREST - limitovaná forma sklerodermie, MCTD - smíšené onemocnění pojiva, JCA - juvenilní chronická artritida, PBC - primární biliární cirhóza
Anti - ds DNAAutoprotilátky proti nativní dvouvláknové DNASLE (60-90%), test je vysoce specifický pro aktivní neléčený SLEStanovení metodou ELISAStanovení nepřímou imunofluorescencí proti Crithidia luciliae
ENA – extrahovatelné jaderné antigenyVe fyziologickém roztoku rozpustné antigeny jádra a cytoplasmy
SmU1-snRNPSS-ASS-BScl-70Jo-1
určení metodami protisměrné elektroforézy, ELISA, blot
ENA
Sm - SLE (20-40%)SS-A/Ro- Sjogrenův syndrom (40-95%), SLE (20-60%)SS-B/La - Sjogrenův syndrom (40-95%), SLE (10-20%)Scl/70 -systémová sklerodermie (25-75%)Jo-1 -polymyozitida/dermatomyozitida (25-35%)nRNP/Sm-smíšené choroby pojiva (95-100%), SLE (30-40%)
Protilátka nebyla identifikovánanapř. zrnitá fluorescence jádra
Nepřímá imunofluorescencemultispecifická metoda
Potilátky proti centroméře VÝSLEDEK
Jasná identifikace protilátkynapř. centroméra
protilátky proti SS-A
Monospecifická metodanapř. ELISA, imunoblot
ANA
HEp-2 játraHEp-2 játra
ověření
Strategie ANA diagnostiky
titrace
Orgánově nespecifické autoprotilátky
Endomysiumvazivo uvnitř svalu, dříve též označované jako perimysium internum
Diagnostika CELIAKIE
CELIAKIEimunopatologická choroba charakterizovaná zánětlivým postižením tenkého střeva vyvolaná intolerancí obilného proteinu - gliadinu
EMA – nepřímá imunofluorescenceSubstrát jícen, střevo, játra….autoprotilátky ve třídě IgA proti endomyziuvysoce specifické pro celiakii (až 98%) a dermatitis herp.Duhring
Diagnostika CELIAKIE
tTG - ELISA autoprotilátky ve třídě IgA proti tkáňové transglutaminázehlavní antigen endomyzia Ca2+ dependentní enzym katalyzující deaminaci glutaminu na glutamátvysoce specifické pro celiakii (až 98%)
AGA - ELISAprotilátky ve třídě A namířené proti gliadinu
ANCA V roce 1982 Davies a kol. poprvé popsali přítomnost protilátek proti cytoplazmě neutrofilů u pacientů s nekrotizující glomerulonefritidou (Molloy).V roce 1985 van der Woude a kol. publikovali úzkou souvislost mezi aktivní Wegenerovou granulomatózou (WG) a specifickým cytoplazmatickým imunofluorescenčním obrazem, dnes definovaným jako c-ANCA (Bradel). Na prvním Mezinárodním pracovním setkání o ANCA protilátkách, které se konalo v lednu 1988 v Kodani, byl popsán perinukleární fluorescenční obraz (p-ANCA) zcela odlišný od c-ANCA
ANCA
ANCA (Anti-Neutrophil Cytoplasmatic Antibodies )autoprotilátky proti cytoplazmě neutrofilů
pANCA – perinukleární fluorescenční obrazprotilátky namířené proti myeloperoxidase (MPO)Churg-Straussův syndrom, vaskulitidy malých cév, nodozní polyarteritidy….
cANCA – cytoplasmatický fluorescenční obrazprotilátky proti proteináze 3 (PR3)systémové vaskulitidy –Wegenerova granulomatoza (95%)
GS-ANA (granulocyte-specific ANA)zánětlivá onemocnění gastrointestinální soustavy
Laboratorní diagnostika ANCA
Nepřímá imunofluorescenceEtanolem fixované granulocytyFormalínem fixované granulocytypANCA, cANCA, jiné ANCA
ELISA, blotMPO – myeloperoxidázaPR3 – proteináza 3BPIElastázaKatepsin Glaktoferin
orgánově nespecifickéEndomysiumAnti - mitochondrieAnti – jaderné
ANA – antinuclear autoantibodiesANF
orgánově specifickéANCA (granulocyty)GBM (ledvina)LKM (játra, ledvina)
Laboratorní diagnostika autoprotilátek
Protilátky asociované s autoimunitními onemocněními jater
onemocnění autoprotilátkyAIH1AIH2AIH3
ANA (JM), SMA (anti-F-aktin)LKM1, LKM3, LC1SLA/LP, (SMA, AMA)
PBC AMA (M2, M4, M9), ANA (JT, JM, zrn.)PSC GS-ANA (atypická P-ANCA)hepat. při APS1 LKM (CYP1A2)
Laboratorní techniky diagnostice autoimunitních hepatopatií
• IF na trojkombinaci krysích (myších) substrátů játra, ledvina, žaludek
• ELISA• imunodot• Western Blot
Diagnostika autoimunitních onemocnění jater metodou IIF
AIH screen, ředění sér 1:40 (100), konjugát anti-IgG (AGM)
Možnost dg: AMALKMASMAANA LCA, LSP, LC1 anti-LMAg….APA
HEp-2 opičí krysí krysí krysí opičíjátra játra ledvina žaludek srdce
AMA anti-LSP anti-LKM anti-LKM SMA anti-pps
HEp-2 buňky
Krysí ledvina
Krysí žaludek
Opičí játra
Krysí játra
Opičí srdce
BIOCHIP mozaika pro diagnostiku autoimunitní hepatitídy
IIF na trojkombinaci krysích substrátů(játra/ledvina/žaludek)
negativní > 1:40
vyhledávánívzácných Ab
+ játra (cévy)+ ledvina (glomeruly)+ žaludek (svalovina)
+ játra (cytoplasma)+ ledvina (DT > PT)+ žaludek (PB)
+ játra (cytoplasma)+ ledvina (PT)- žaludek
+ játra (cytoplasma)- ledvina - žaludek
SLA/LP ASGPR SMA AMA anti-LKM cytosol
specifikace WB, ELISALKM3 LKM2 LKM1
ID, WB
anti-vimentin anti-aktin M2,M4,M9 WB WB WB, ID
ELISA anti-LC1
UGT1CYP2C9
CYP2D6
AIH AIH 1 VHA AIH 1 PBCchron.VHD
polékováhepatitida AIH 2 AIH 2
upraveno podle Johanet C.: Auto-anticorps et hépatites in Auto-anticorps Actualités, Inst.Pasteur, Jun 23, 2000
AIH – sérologická diagnostika
ELISA
IIFT
BLOT
M2LKMLC-1SLA/LP
ANA ASMA Actin LKM
AMALKMLC-1SLA/LP
LC-1
Laboratorní diagnostika CIBD
IBD screen, ředění sér 1:10 pro pankreas, granulocyty a tenké střevo, 1:1000 pro S.cerevisiae, konjugát anti-IgAG
Prevalence Ab v %UC CD
PA Ab 2 39ASCA 2 69PA + ASCA 80GC Ab 28 0GS-ANA 76 7GC + GS 83
Přínos „panelu“ IBD protilátek
• Screening u asymptomatických NE• Definitivní diagnóza NE• Monitorování léčby NE• Predikce odpovědi na léčbu asi ANO• Dif. dg. UC x MC asi ANO• Symptomatičtí pacienti se susp. IBD asi ANO• Dětští pacienti s nespec. příznaky ANO • Nezařaditelná kolitida ANO• Precizace (ev.potvrzení ) diagnózy ANO
Chronická atrofická gastritida
Gastritida:samostatnáasociovaná s jinými chorobami ( DM, tyreopatie, APS, myasthenia gravis, vitiligo, Addisonova choroba )
Autoprotilátky proti:parietálním buňkám (APCA) vnitřnímu faktoru (AIF)protonové pumpě (H+K+ATPáze)
Orgánově specifické autoprotilátky
anti-GBM (bazál. membrána glomerulu)anti-BMT (bazál. membrána tubulu)anti-myokardiální protilátkyanti-příčně pruhovaný svalanti-kožní tkáň (ICS, EBM)anti-slinná žlázastřevní sliznice
anti-parientální buňkyanti-pankreat. buňky (ICA)anti-kůra nadledvinekanti-ovarium anti-testesanti-GADanti-IA2anti-neuro
Ri (mozeček) Yo (mozeček)Hu (mozeček)
Hu (střevo)myelin (nerv)
Diagnostika protilátek proti neuronálním antigenům
Metoda volby -Pokud izolovaný testovaný antigen není dostupný
Přítomnost celého antigenního spektra testovaného substrátu
> Stanovení protilátek proti antigenům, které
nemohou být izolovány
> Stanovení protilátek proti neznámým antigenů
Protilátky proti
lipocytům
Protilátky proti
sítnici oka
Protilátky proti exokrinnímu
pankreatu
Protilátky proti
ostrůvkovým buňkám
Význam imunofluorescence
Hodnocení nepřímé imunofluorescence
Negativní - Není pozorována žádná fluorescence očekávaných struktur v preparátu.
Hraniční +/- Nezřetelná, ale patrná fluorescence očekávaných struktur.
Slabě pozitivní + Zřetelná, ale slabá fluorescence očekávaných struktur.
Pozitivní ++ Zřetelná, jasná, fluorescence očekávaných struktur.
Silně pozitivní +++Velmi silná fluorescence, která může někdy způsobovat i splývání očekávaných struktur ( např. zrnění ).
Ředění a titrace vzorků pro IFScreeningové ředění séra u dané IIFA by mělo být nastaveno tak, aby 95% zdravých kontrol dávalo negativní nález (Feltkamp 1996)Orgánově-nespecifické autoprotilátky, se nacházejí ve vzorcích sér nemocných obvykle v koncentracích vyšších, výchozí screeningové ředění sér bývá vyšší (1:40 až 1:100). Orgánově specifické, v menších koncentracích proto 1:10Reálná koncentrace protilátek může být +/- 1 titr (1:160 –1:640)Titrace jako metoda pro rozlišení více typů protilátek ANAHook efekt - U silně pozitivních vzorků sér se může uplatnit prozónový efekt, hook efekt, který způsobuje, že při nižším ředění séra pozorujeme slabší až negativní fluorescenci těchto sér
Recommended