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L’espressione di un gene può essere controllata interferendo con la reazione di poliadenilazione

La regolazione del gene che codifica per la proteina U1A

Esempio di regolazione on/off della reazione di taglio e poliadeniazione

La proteina U1A e’ presente nell’U1 snRNP, particella ribonucleoproteica coninvolta nel processo di splicing

E’ in grado di legare una sequenza sul proprio pre-mRNA, a monte del sito di taglio e poliadenilazione, contenente due motivi di sequenza simili a quello a cui si lega sull’U1 RNA.

Quando il livello della proteina U1A supera i livelli cellulari dell’U1 snRNA l’accumulo della proteina viene bloccata!

DD

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1) La proteina U1A lega il piccolo RNA di splicing U1 snRNA e con esso forma la particella ribonucleoproteica U1 snRNP coninvolta nel processo di splicing

Complesso della snRNP U1: sono evidenziati le proteine Sm all'estremità 3' e altre proteine specifiche del complesso. Il sito di legame di U1A richiede una sequenza di 7 nucleotidi del loop e 3 bp dello stern.

free RNA

U1A -

Il sequenziamento del gene codificante U1A ha rivelato la presenza al 3', vicino al sito di poliadenilazione (AUUAAA), di 2 sequenze simili a quella del sito di legame sull’ U1 snRNA.

Il saggio di ritardo elettroforetico utilizzando l’mRNA di U1A marcato in continuo e quantità crescenti della proteina U1A conferma la presenza di due siti di legame per la proteina sul proprio messaggero

2) U1A è in grado di legare il 3’ UTR del proprio pre-mRNA. Questa sequenza si trova a monte del sito di taglio e poliadenilazione.

Al contrario l’utilizzo di un RNA già tagliato e quindi con un 3' OH libero, all'aumentare della proteina U1A la reazione di poliadenilazione era sempre più inibita.

U1A WT

-inp

ut

U1A 103-119

U1A Inverted

poly(A)+

3) Quando il livello della proteina U1A supera i livelli cellulari dell’snRNA U1 la produzione della proteina viene bloccata!

4) Il controllo su U1A è quindi di tipo a feed−back ed ha come target la corretta formazione del 3' del suo messaggero. Man mano che la quantità di U1A nel nucleo aumenta, questa si va a legare al 3' del proprio mRNA impedendo la poliadenilazione e di conseguenza destabilizzando il trascritto che viene degradato.

In estratti contenenti i fattori di taglio e poliadenilazione e contemporaneamente EDTA, quindi viene inibita la reazione di poliadenilazione del pre-mRNA, si osservava un andamento inalterato delle reazioni di taglio.

La proteina non blocca il taglio, bensì la poliadenilazione

U1A interagisce specificamente con la parte C−terminale di PAP, in un domino specifico che inibisce il suo normale funzionamento. Questa interazione è stata dimostrata con la tecnica del two− hybrid in lievito.

E' da notare inoltre che la sequenza del sito di poliadenilazione (AUUAAA) è un sito sub-canonico: in tal modo si ha un legame meno stabile con CPSF che può essere più facilmente scalzato.

U1A interagisce specificamente con la parte C−terminale di PAP

un sito sub-canonico

Formazione dell’estremità 3’ del pre-mRNA degli istoni

U7 RNA

U7 -snRNP

ACCACA histone pre-mRNA

HBP

AAAGACUUUUCUGC

Histone pre-mRNA 3’ processing

HLF

3’ 5’ 3’

5’

U7 snRNA

Pre-mRNA per gli istoni

Formazione dell’estremità 3’ del pre-mRNA degli istoni