View
218
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
© 2012 Illumina, Inc. All rights reserved.
Illumina, illuminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium,
iSelect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of
Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.
Library Poolの際のIndexの選び方
イルミナ株式会社
テクニカル アプリケーション サイエンティスト
渡辺 真子
2
なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？
いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングする
ガイドラインを考慮するのか？
マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？
– TruSeq LT and RNA v2
– TruSeq HT
– Nextera
最適なインデックスの組み合わせを選択するためのIllumina Experiment
Managerを使用する方法は？
目的
3
なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？
– インデックス付きのライブラリー構造とインデックスリードの順序の概要
目的
4
TruSeq DNA LT and TruSeq RNA v2 Single Index Library
5
詳細は “Sequencing: Illumina’s Dual Indexing Strategy” をご覧ください:
http://support.illumina.com/training/sequencing_training.ilmn
TruSeq HT and Nextera – Dual Index Library
6
なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？
– インデックス付きのライブラリ構造とインデックスリードの順序の概要
– なぜインデックスリードでカラーバランスが重要なのか？
目的
7
同一サイクルに同数の赤 (A and C) と緑(G and T)の塩基
– 蛍光強度により適切にクラスターの位置を定めるために両カラーが必要。
一般的に、多数のサンプル＝よりよいカラーバランス
カラーバランスの重要性
A
T
C
A
C
G
C
G
A
T
G
T
T
T
A
G
G
C
T
G
A
C
C
A
A
C
A
G
T
G
G
C
C
A
A
T
C
A
G
A
T
C
A
C
T
T
G
A
G
A
T
C
A
G
T
A
G
C
T
T
G
G
C
T
A
C
C
T
T
G
T
A
Cycle 1
Cycle 2
Cycle 3
Cycle 4
Cycle 5
Cycle 6
✓
8
なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？
– インデックス付きのライブラリ構造とインデックスリードの順序の概要
– なぜインデックスリードでカラーバランスが重要なのか？
– カラーバランスがとれていないと、何が起こるか？
目的
9
クラスターの位置で、 intensity （蛍光強度）が正しく並らばないかもしれない。
インデックスによるサンプルの振り分けに問題が生じる。
– インデックスがない = 使用可能なデータがない。
– 期待されるアウトプットより少ない。
すべてのクラスターに影響を及ぼすのではないかもしれない
カラーバランスがとれていないと、何が起こるか?
10
なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？
– インデックス付きのライブラリ構造とインデックスリードの順序の概要
– なぜインデックスリードでカラーバランスが重要なのか？
– カラーバランスがとれていないと、何が起こるか？
いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングするためのガイドラインを考慮するのか？
目的
11
ライブラリー調製前にインデックスの組み合わせを考えることが重要！
特に以下のような場合にインデックスの組み合わせを考慮してください：
– キット内にある全セットより少ないサンプル数でプーリングする場合
– インデックス付のサンプルを不均一な濃度でプーリングする場合
12
なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？
いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングするためのガイドラインを考慮するのか？
マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？
目的
13
重要な役割：各インデックスサイクルにおける赤と緑 のヌクレオチドの量のバランスをとる。
– Single-index と dual-index サンプルに適用。
– すべてのサンプル調製キットとシーケンスプラットフォームに適用。
マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？
G
C
C
A
A
T
C
T
T
G
T
A
適切な
組み合わせ
G
C
C
A
A
T
C
A
G
A
T
C
不適切な
組み合わせ
注：これらのサンプルは等モル量をプールしていると仮定。
Cycle 1
Cycle 2
Cycle 3
Cycle 4
Cycle 5
Cycle 6
14
いくつかの最適な組み合わせについて実施しており、これらの組み合わせは下記のガイドにてご覧いただけます！
ライブラリーに合わせて適切なサンプル調製キットのガイドをご使用下さい！
The good news...
15
詳しく見てみましょう...
TruSeq DNA LT/RNA v2 pooling guidelines
Single index library structure:
16
詳しく見てみましょう...
17
詳しく見てみましょう...
TruSeq DNA LT/RNA v2 pooling guidelines
AD006 GCCAAT
AD012 CTTGTA
AD005 ACAGTG
AD019 GTGAAA
インデックス配列は Illumina Adapter Sequence Letterにて掲載。
https://icom.illumina.com/Download/Summary/5kKzNLtAtUCIhbHYc3NkUw
18
インデックス配列は Illumina Adapter Sequence Letterにて掲載。
詳しく見てみましょう...
TruSeq DNA LT/RNA v2 pooling guidelines
AD005 ACAGTG
AD006 GCCAAT
AD015 ATGTCA
AD006 GCCAAT
AD012 CTTGTA
+ any other adapter
AD005 ACAGTG
AD019 GTGAAA
+ any other adapter
AD002 CGATGT
AD007 CAGATC
AD019 GTGAAA
19
ライブラリーは2つのインデックス配列を含む:
Index 1 のみ読むことができる
Index 1 とIndex 2 の両方を読むことができる
カラーバランスのルールは両インデックスリードに適用！
Truseq HT and Nextera – 2つのインデックスが可能
20
Truseq HT ガイドライン – Index 1 のみ TruSeq DNA sample prep guide
21
Truseq HT ガイドライン – Index 1 のみ TruSeq DNA sample prep guide
カラーバランスのとれたプールが 緑のウェルを含むライトグレーの枠で示されている。
22
Truseq HT ガイドライン – Index 1 のみ TruSeq DNA sample prep guide
カラーバランスのとれたプールが 緑のウェルを含むライトグレーの枠で示されている。
注意: ガイドラインでは、全ての適用
可能な組み合わせを、示しておりません。
23
Truseq HT ガイドライン – Index 1 と Index 2 TruSeq DNA sample prep guide
24
Truseq HT ガイドライン – Index 1 と Index 2 TruSeq DNA sample prep guide
カラーバランスのとれたプールが 緑のウェルを含むライトグレーの枠で示されている。
Note: カラーバランスのとれたプールの全てが記載されているわけではありません。
25
Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリード Nextera sample prep guide
26
Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリード Nextera sample prep guide
27
なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？
いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングするためのガイドラインを考慮するのか？
マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？
適切なインデックスの組み合わせを選ぶために、Illumina Experiment
Manager ソフトウェアをどのように使用するか？
Objectives
28
HiSeq/MiSeq/HiScan/GAIIx用のサンプルシートを作製するのに役立つソフトウェア
– インデックスのカラーバランスの確認もします！
以下のリンクからダウンロード (インストーラーとユーザーガイドを含む):
https://my.illumina.com/download/summary/Do_qnPtQYkG3Inh3jPkOTA
サンプル調製の前にサンプルシートを作製するのに役立ちます！
Illumina Experiment Manager ソフトウェア
29
Illumina Experiment Manager の使用方法
30
Illumina Experiment Managerの使用方法
31
Illumina Experiment Managerの使用方法
32
Illumina Experiment Managerの使用方法
33
Illumina Experiment Managerの使用方法
34
Illumina Experiment Managerの使用方法
どのようにして決めるか？
35
Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリードNextera sample prep guide
36
Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリード Nextera sample prep guide
Index 1 Index 2
N701 TAAGGCGA N505 GTAAGGAG
N701 TAAGGCGA N506 ACTGCATA
N702 CGTACTAG N505 GTAAGGAG
N702 CGTACTAG N506 ACTGCATA
N704 TCCTGAGC N505 GTAAGGAG
N704 TCCTGAGC N506 ACTGCATA
N705 GGACTCCT N505 GTAAGGAG
37
Illumina Experiment Managerの使用方法
38
Illumina Experiment Managerの使用方法
39
Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ
40
Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ
41
Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ
42
Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ
43
Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ
どのようにして修正するか?
44
Index 1 Index 2
インデックス配列- Illumina Adapter Sequence Letter
45
Index 1 Index 2
46
Index 1 Index 2
各インデックスの各サイクルで少なくとも１つの赤または緑の塩基がある!
47
Experiment Managerで確認しましょう...
修正できた!
48
プーリングガイドラインは、インデックスリードの各サイクルにおいて 赤または緑のカラーチャンネルを持つことに、基づいてる。
– もし、カラーバランスが取れていなかったら、デマルチプレックスの後で、
データのアウトプットが低くなるかもしれない。
ガイドラインは全てのインデックスリードの全てのサイクルに適用。
Illumina Experiment Managerまたは、赤と緑のバランスを実際に見て 確認することで、プーリングガイドラインに基づいたインデックスの組み合わせを設定できる。
まとめ
49
Product Support Pages: (Pooling guidelines)
– TruSeq DNA LT:
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_lt_sample_prep_kit.ilmn
– TruSeq DNA HT:
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_ht_sample_prep_kit.ilmn
– TruSeq RNA v2:
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2.ilmn
– Nextera: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_dna_kit.ilmn
– Nextera XT: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit.ilmn
IEM software and user guide:
https://my.illumina.com/download/summary/Do_qnPtQYkG3Inh3jPkOTA
– IEM short online training course:
https://mycourses.illumina.com/courses/Sequencing_Illumina_Experiment_Manager/index.html
Illumina Adapter Sequence Letter:
https://icom.illumina.com/Download/Summary/5kKzNLtAtUCIhbHYc3NkUw
Dual-indexing short online training course:
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_dna_kit/training.ilmn
Additional information
Recommended