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Conjunto de metodologías que permite transferir
genes de un organismo a otro y expresarlos
(producir las proteínas para las cuales estos genes
codifican) en organismos diferentes al de origen.
¿Qué es la Ingeniería Genética?
1- Obtención del gen de interés
2- Clonación del gen
3- Obtención de la cepa productora
4- Producción de la proteína de interés (POI)
5- Purificación / procesamiento de la POI
6- Formulación
PRODUCTO SISTEMA DE PRODUCCIÓN INDICACIÓN TERAPÉUTICA
Factores de coagulación
Factor VIII Cultivo de células de mamífero
Hemofilia A
Factor IX Cultivo de células de mamífero
Hemofilia B
Factor VIIa Cultivo de células de mamífero
Ciertas formas de hemofilia
Anticoagulantes
Activador del plasminógeno tisular
Cultivo de células de mamífero
Infarto de miocardio
Activador del plasminógeno tisular
E. coli Infarto de miocardio
Hirudina Levaduras Trombocitopenia y prevención de trombosis
Productos farmacéuticos aplicados a la salud
humana y que provienen de organismos
genéticamente modificados
Hormonas
Insulina Levaduras Diabetes mellitus
E. coli
Hormona de crecimiento E. coli Deficiencia de la hormona en niños, acromegalia, síndrome de Turner
Folículo-estimulante Cultivo de células de mamífero Infertilidad, anovulación y superovulación
Paratiróidea E. coli Osteoporosis
Gonadotrofina coriónica Cultivo de células de mamífero Reproducción asistida
Tirotrofina Cultivo de células de mamífero Detección /tratamiento de cáncer de tiroides
Luteinizante Cultivo de células de mamífero Ciertas formas de infertilidad
Calcitonina E. coli Enfermedad de Paget
Glucagon Levaduras Hipoglucemia
Factores hematopoyéticos
Eritropoyetina (EPO) Cultivo de células de mamífero Anemia
Factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF)
E. coli Netropenia, transplante autólogo de médula
Interferón e interleuquinas
Interferón alfa (IFN alfa) E. coli Hepatitis B y C, distintos tipos de cáncer
Interferón beta (IFN beta) Cultivo de células de mamífero Esclerosis múltiple
Interferón gamma (IFN gamma 1b) E. coli Enfermedad granulomatosa crónica
Interleuquina 2 (IL-2) E. coli Cáncer de riñón
Anti-hepatitis A Levaduras Inmunización contra la hepatitis A
Anti-enfermedad de Lyme E. coli Inmunización contra la enfermedad de Lyme
Anticuerpos monoclonales recombinantes
Anti-IgE (recombinante) Cultivo de células de mamífero Asma
Anti-TNF (recombinante) Cultivo de células de mamífero Arthritis reumatoidea
Anti-IL2 Cultivo de células de mamífero Prevención del rechazo agudo de transplante de riñón
Otros productos recombinantes
Proteína morfogénica del hueso-2
Cultivo de células de mamífero Fractura de tibia
Galactosidasa Cultivo de células de mamífero Enfermedad de Fabry (deficiencia en alfa-galactosidasa)
Iaronidasa Cultivo de células de mamífero Mucopolisacaridosis
Proteína C Cultivo de células de mamífero Sepsis severa
Beta-glucocerebrosidasa E. coli Enfermedad de Gaucher
DNAsa Cultivo de células de mamífero Fibrosis quística
Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 Nº8- Cuadernillo 49de PorqueBiotecnología
Vacunas
Anti-hepatitis B Levaduras Inmunización contra la hepatitis B
• Ruptura celular: ruptura mecánica o
enzimática
• Remoción de lípidos: detergente
• Remoción de proteínas: proteasas, fenol
cloroformo
• Precipitación del ADN: sal + etanol
• Agentes quelantes (EDTA): remoción de
Ca 2+, Mg 2+, para inhibir DNasas
Elección de la sal
Acetato de Na+ (0,3 M)
NaCl (0.2 M): muestras con SDS
LiCl (0,8 M): para ARN (inhibe síntesis proteica y ADN polimerasa)
Acetato de NH4+: para remoción de dNTPs (inhibe T4 PNK)
Separación de fragmentos de ácidos nucleicos:
Electroforesis de ADN y ARN
La carga neta de los ácidos nucleicos es
negativa
Migración : de cátodo a ánodo
Separación de fragmentos de ácidos nucleicos:
Electroforesis de ADN y ARN
Electroforesis en gel de agarosa
Fabricación del gel Siembra de las muestras Transcurso de la electroforesis
(30-60 min)
Electroforesis en gel de poliacrilamida
* Menor rango de separación pero mayor resolución que los geles de agarosa.
Electroforesis de ADN
Electroforesis en gel de agarosa
Efecto de la concentración
de agarosa en la migración
-
+
DNA cromosómico digerido con EcoRI
1.0
1.62.0
3.04.05.0
kbp
DNA plasmídico digerido
con diferentes enzimas de
restricción
Electroforesis de ARN
Expresión diferencial de un gen
en diversos tejidos (Northern blot)
Resolución de muestras de
ARN total en un gel
de agarosa al 0,8%.
Una solución de ADN tiene una A260= 0,40
¿Cuál es la concentración de ADN en μg/ml?
50 μg/ml = X μg/ml
1 OD 0.4 ODX = 20 μg/ml
Coeficiente de extinción de ADNdc: E o ε= constante de absorción = coeficiente de absorción
Abs. 260 nm de una sc. 1 mg/ml de ADNdc = 20 = E(pH neutro, G+C 50%, paso de luz 1 cm)
Ley de Beer: A260= E260.l.c.
l = 1 cm A260= E260.c
C= A260/E260
Una solución de ADN tiene una A260=1
¿Cual es la concentración de ADN en μg/ml?
C= A260 C= 1 = 0.05 mg/ml = 50 μg/ml
E260 20
A260 nm de una sc. 1 mM de ADNdc = 6,7 = E260
Coeficiente de extinción, E260, para una
solución de ADNdc 1 mM
Una solución de ADN tiene una A260=0.212.
¿Cuál es la concentración expresada en milimolar?
1 mM = x mM x= 0.03 mM
6,7 OD 0.212 OD
ESPECTROSCOPIA UV: λ 260 nm
ADN simple cadena
ADNsc: Abs. 1= 33 μg/ml
Peso Molecular de deoxinucleotido: 330 daltons = g/mol
E260 ADNsc 1 mM = 8,5
Un stock de ADN del fago M13, de 7250 nucleótidos,
tiene una concentración de 412,5 μg/ml
¿Cuál es la concentración expresada en pmoles/μl?
7250 nuc x 330 g/mol = 2,39 10 6 g/mol = pg/pmol
1 nuc
412,5 μg/ml= 0.4 μg/ μl = 412000 pg/μl
0.4 pg/ μl x 1 pmol = 0.17 pmol/ μl
2.39 pg
Cuantificación de oligonucleótidos
Unidades de densidad óptica (OD u)
1 ODu = cantidad de oligonucleótido disuelto en 1 ml con A260 = 1 en
cuveta de 1 cm de paso de luz
OD u = A260 x vol. Oligonucleótido x factor de dilución
Abs260=1 = 1 OD u = 33 μg/ml ADN sc
Concentración de oligonucleótido expresada en pmol/μl
A260 x 100
C= x factor de dilución
(1,54 x nA) + (0,75 x nC) + (1,17 x nG) + (0,92 x nT)
Coeficiente de extinción de cada base
Una solución 1M de dATP tiene A260= 15400 E26015400L/mol = 0,00154 μl/pmol
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Endonucleasas de restricción.
* Enzimas producidas de manera natural por microorganismos cuya función
es la de degradar el ADN exógeno.
* Se unen específicamente a secuencias concretas de ADN de doble cadena
y la rompen (endonucleasas).
Tipo I: poseen actividad metilasa y de restricción. ATP-dependientes. Rompen
el ADN lejos del sitio que reconocen (>1Kbp) de manera aleatoria carecen
de interés práctico.
Tipo III: poseen actividad de restricción y modificación. Cortan fuera de la
Secuencia que reconocen. Requieren dos secuencias de reconocimiento en
orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Son ATP-dependientes.
Tipo II: sólo actividad de restricción. No ATP-dependientes. Reconocen
secuencias específicas de ADN (de 4 a 8 bp, muchas de ellas palindrómicas).
Punto de rotura característico para cada una y próximo a la secuencia
reconocida fragmentos discretos. Hay cientos comercialmente disponibles.
Palindromo:
Palabra o frase que se lee igual de izquierda a derecha que de
derecha a izquierda , ej. RADAR, ANILINA, DÁBALE ARROZ A LA
ZORRA EL ABAD
TTAGCACGTGCTAA
AATCGTGCACGATT
Toman el nombre de las bacterias que las producen. Ej.
EcoRI E: género Escherichia
co: especie coli
R: cepa RV 13
I: primera endonucleasa aislada de esta cepa
Enzima Fuente Secuencia de
reconocimiento
Corte
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC
3'CTTAAG
5'---G AATTC---3'
3'---CTTAA G---5'
Pvu II Proteus vulgaris 5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'---CAG CTG---3'
3'---GTC GAC---5'
KpnI Klebsiella pneumoniae 5'GGTACC
3'CCATGG
5'---GGTAC C---3'
3'---C CATGG---5'
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
ISOESQUISÓMEROS
Endonucleasas de restricción que reconocen la misma secuencia
SmaI CCCGGG XmaI CCCGGG Neoisoesquisómeros
GGGCCC GGGCCC
BspDI ATCGAT ClaI ATCGAT
TAGCTA TAGCTA
Pag.295
Hay enzimas que reconocen secuencias
tetranucleotídicas
En algunos casos esas secuencias están dentro
de una secuencia de 6 nucleótidos, blanco de
otra enzima. Ej.
MboI y Sau3AI 5´…….GATC……3´
3´…….CTAG……5´
BamHI 5´……GGATCC……3´
3´……CCTAGG……5´
SalI GTCGAC …. G
CAGCTG ……CAGCT
GTCGAG No se corta
CAGCTC con XhoI ni
con SalI !!!
XhoI CTCGAG TCGAG…..
GAGCTC C…..
Ligación de fragmentos generados por 2
enzimas de restricción
Procariontes
Dam metilasa……………GmATC
Dcm metilasa……………CmCAGG y CmCTGG
EcoKI Metilasa…...………metila A en AAC(N6)GTGC o GCAC(N6)GTT
La mayoría de las cepas que se usan para clonado son Dam+ y Dcm+
La eficiencia de transformación puede variar con el estado de metilación del
plásmido
METILACIÓN
S-adenosilmetionina
METILACIÓN
Eucariontes:
Metilasas de sitios mCG.
Los patrones son tejido específicos,
heredables y correlacionan con la
expresión de genes.
Los patrones de metilación CpG no se mantienen cuando el ADN es clonado en bacterias
La metilación de los sitios de restricción puede
impedir la acción de la enzima de restricción
Los sitios se pueden desmetilar usando
cepas de E coli dam- dcm-
Pag 206
M. EcoRI GAATTC inhibe el corte con EcoRI
CTTAAG
M.HaeIII
M. HaeIII GCCNNNNNGGCC inhibe el corte con HaeIII y BglI
BglI
M. TaqI TCGATCGA M.TaqI TCGATCGA
AGCTAGCT AGCTAGCT
TaqI TaqI DpnI
Modificación de sitios de restricción por
metilación del ADN
Corta sólo si está metilado
Sistemas de restricción dependientes
de la metilación en E. coli
EcoKI :genes hdsRMS, ataca ADN NO protegido por
metilación en A en sitio: AA[N6]GTGC o GCAC[N6]GTT
McrA, McrBC y Mrr: genes mcrA, mcrB y mrr, atacan
ADN metilado en ciertas posiciones
Para clonar usar preferentemente cepas defectuosas
en loci hds, mcrA, mcrBC y mrr
Pag.206
FACTORES QUE INFLUENCIAN LA ACTIVIDAD DE
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Composición del buffer
Temperatura de incubación
Metilación del ADN
“Star activity”……………pH alto (>8) , baja fuerza iónica (ej. olvido de buffer)
Cc de glicerol >5%
Cc muy alta de enzima (> 100 U/ug de ADN)
Solventes orgánicos (ej. Etanol, DMSO)
Digestión con múltiples enzimas
Variabilidad en la digestión de diferentes ADNs
Pag. 276-284
Digestión de un plásmido, preparado con kit Wizard
plus midipreps Promega, con BamHI y NotI
ADN sin precipitar ADN precipitado
REBASE Tools
•Theoretical digests with all
REBASE prototypes...
•Blast your sequence against
REBASE...
•New England Biolabs
NEBcutter...
•REBpredictor...
http://rebase.neb.com/rebase/rebtools.html
LIGACIÓN DE ADN
VECTOR: Moléculas transportadoras que transfieren y replican
fragmentos de ADN que llevan insertados.
LIGACIÓN DE ADN
T4 Ligasa liga extremos cohesivos y romos
Necesita ATP y Mg++
Relación molar vector:inserto
Temperatura óptima
Cantidad de enzima
Inhibición por alta sal y EDTA
Se inactiva a 65 ºC 10 min
Buffer ligasa ¡siempre frio!!!
ADN LIGASAS
Ligasa del bacteriófago T4. Requiere ATP y Mg2+.
Extremos cohesivos y romos. dsDNA o dsRNA.
Ligasa de E. coli. Requiere NAD+.
La eficiencia de ligación depende de:
La cc absoluta de ADN: La cc debe ser lo suficientemente alta para
asegurar que la ligación intermolecular esté favorecida sobre la auto
ligación pero no demasiado alta que cause la formación de
oligómeros.
Por ej. para vectores pET…1 nM, 50-100 ng vector en 20 μl de
reacción
Relación inserto/vector. La máxima eficiencia de ligación se
obtiene en general usando una relación molar de inserto/vector=2
Estrategia de clonado
Vector digerido con 2 enzimas distintas
y purificado por gel
Vector digerido con 2 enzimas distintas
sin purificar por gel
Vector digerido con 1 enzima y
desfosforilado
Vector digerido con 1 enzima
sin desfosforilar
Masa de inserto en ng = Tamaño del inserto en pb x Masa del vector en ng
Tamaño del vector en pb
Cálculo de la cantidad de inserto
¡¡¡¡Probar varias relaciones molares!!!!!
LIGACIÓN
extremos cohesivos extremos romos
ATP 5 mM 0,5 mM
Ligasa 0,1 uWeiss 50 uWeiss
ADN > cc….PEG
Unidad Weiss: cantidad de enzima que cataliza el intercambio de 32P
de pirofosfato a [γ,β-32P]ATP en 20 minutos a 37ºC.
ADN Polimerasas
Templado: ADN
E. coli ADN Polimerasa I (y fragmento Klenow)
T7 ADN Polimerasa
ADN Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent, etc.)
Templado: ARN
Transcriptasas Reversas
cebador o primer
E. coli ADN polimerasa I
E. coli ADN polimerasa I
(109 KDa)
5’→ 3’ ADN polimerasa
5’→ 3’ exonucleasa
3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)
Proofreading activity = lectura de prueba
*Verifica nucleótidos después de ser añadidos.
*Permite eliminar nucleótidos desapareados en extremos 3’ y generar
extremos romos .
ADN polimerasa I
*No deseable en muchos casos por su actividad 5´ 3´ exonucleasa porque
degrada el extremo 5´de primers y remueve 5´P de extremos a ser ligados
Fragmento de Klenow de la E. coli ADN polimerasa I
5’→ 3’ DNA polimerasa
3’→ 5’ exonucleasa
Fragmento Klenow de la
E. coli ADN polimerasa I
(68 KDa)
5’→ 3’ ADN polimerasa
3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)
* Síntesis de la 2a hebra en ADNc
* Fill in o marcación de extremos 3´recesivos de ADNdc
* Marcación de ADN por el método random primer
* Secuenciación de ADN por el método de Sanger
* Mutagénesis sitio específica con oligonucleótidos sintéticos
T7 ADN Polimerasa
-Carece de actividad exo 5’-3’. Modificable química o genéticamente para
eliminar actividad exo 3’-5’ SequenaseTM)
- Muy procesiva: muy útil en secuenciación de ADN (Sequenase™) por el
método de Sanger.
T7 ADN polimerasa I
5’→ 3’ DNA polimerasa
3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)
ADN transferasa terminal
•Adición de nt’s al extremos 3’ del ADN:
- ssDNA (incluyendo extremos 3’ protuberantes de dsADN).
- Añade también homopolímeros de nucleótidos al extremo 3’ de ADN
- Con menor eficiencia en extremos romos y recesivos
Utilidades:
• Marcación de los extremos 3' del
ADN
•Añade colas de homopolímero
al ADN
Nombre 3'->5‘ Exo Origen Propiedades
Taq No Thermus aquaticus Vida media a 95º C 100 min.
Alta tasa de error (10-4 a
2.10-5 por pb)
Pfu Sí Pyrococcus furiosus Baja tasa de error. 1-2.10-6
por pb)
Vent (Tli) Sí Thermococcus litoralis Vida media a 95º C aprox. 7
horas
Máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC. (Taq polimerasa sólo 10% activ. a 37 ºC)
Muy utilizadas en reacciones de PCR
y secuenciación de ADN
ADN Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent, etc)
1976: Thermus aquaticus 1988: polymerase chain reaction (PCR)
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase.Science. 1988, 239(4839):487-91
ADN polimerasas dirigidas por ARN
Codificadas por retrovirus (Moloney murine leukemia o Avian myeloblastosis)
Dos actividades:
ADN polimerasa:in vivo copia sólo RNA, pero in vitro puede usar ssRNA o ssDNA (siempre necesita cebador de
RNA o DNA)
RNase H:Ribonucleasa que degrada RNA en híbridos RNA-DNA, como los formados durante la
transcripción reversa (exo y endonucleasa)
Usos:
- generación de cDNA
- RT-PCR
Híbrido DNA-RNA5’ 3’
5’ 3’
Transcriptasas reversas
Enzima Exo 3’-5’ Exo 5’-3’ Capacidad de
polimerización
Procesividad Error
rate
(x106)
E. coli polim. I Baja Sí Media Baja 9
Frag. Klenow Baja No Media Baja 40
T7 DNA polim. (nativa)
Alta No Rápida Alta <1
T7 DNA polim. (modificada)
Baja/No No Rápida Alta
Taq DNA polim No SíRápida
Alta 285
Transcrip. reversa
No No Lenta Intermedia
Resumen de las características de las ADN Polimerasas
Marcación de ácidos nucleicos: Síntesis de ADN uniformemente marcado.
b) Random priming
+
Desnaturalización por calor(10 ºC, 10 min)
Generación de cadenas simples
3’5’ 3’5’
Unión de oligos (6-10 nt) “random”
3’5’ 3’5’
Extensión mediante Klenow
3’5’
Generación de fragmentos Marcados (150-200 nt)
a) Nick translation
Actividad exo 5’-3’ de DNA pol. I
2
Corte (nick)por DNAsa I1
Incorporación dNTP marcadospor act. polimerasade DNA pol. I
3 dNTP
DNA duplex
c) Mediante PCR
dNTP EMPLEADO PARA LA MARCACIÓN:
Radioactivos:
32PαdNTP, 35SαdNTP, 125 I αdNTP
No radioactivos:
biotina-11-dUTP
digoxigenina-11-dUTP
α32P-ATP !!!
"nick" ruptura de un enlace éster en un fosfato 5'., con la liberación de un
grupo hidroxilo 3'. La DNAsa produce nicks
"gap" desaparición de una serie de nucleótidos contiguos
Utilidad:
1.- Marcación (p. ej. Radioactivo) de oligonucleótidos para estudios de hibridación
2.- Fosforilación de extremos 5’ no fosforilados, necesarios para ligación, de
“linkers” (adaptadores) o fragmentos de DNA.
Cataliza la transferencia de un fosfato desde el ATP hasta el extremo 5' de ADN o ARN
Comprar 32PγATP!!!!
Marcación de ácidos nucleicos: en el extremo del ADN
Polinucleótido quinasa
Nick translation (DNAsa I + DNA polimerasa I).
Random priming (Klenow)
PCR (polimerasas termoestables)
Marcación del extremo 5’ (polinucleótido quinasa)
Eficiencia
Baja
Media
Alta
Alta
Tm: temperatura de “melting”: temperatura a la
cual el 50 % de las moléculas del oligonucleótido
están formando un dúplex con su hebra
complementaria
Td: Temperatura de disociación: temp. a la cual el
50 % del oligo y su hebra complementaria unida a
membrana están en duplex para una cc particular
de sal y ADN
longitud
Tm: depende de composición: AT vs GC
cc. de sales: cationes divalentes estabilizan.. Tm
agentes desnaturalizantes: urea, álcali
solventes orgánicos: formamida Tm
Métodos para determinar Tm
http://insilico.ehu.es/tm.php
Método de Wallace:para oligos de 14-20 nucleótidos, hibridación en
membrana.
Td = 2°C(A+T) + 4°C(G+C) agregar 8ºC para convertir en Tm
% de GC
Tm=81.5 ºC+16.6 (log10[Na+])+0.41(f% G+C)-0.63(% formamide)-
(600/length)
Vecino más cercano: no para oligos > 50 nuc.
Tm= (ΔH-3,4 kcal)/((A+ ΔS)+(R ln(c/4)))-273.15 log(sal)
Δ H:sumatoria de los cambios de entalpía de los vecinos
Δ S: sumatoria de los cambios de entropía de los vecinos
R: cte de los gases
A: cte para sec. complementarias o no complementarias
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