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Ana Lívia Rocha Monteiro
MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE MONITORAMENTO DE FAUNA
Botucatu-SP
2006
Ana Lívia Rocha Monteiro
MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE MONITORAMENTO DE FAUNA
Seminário apresentado à Disciplina de
Seminários I, do Programa de Pós-graduação
em Medicina Veterinária, nível Mestrado, Área
de Reprodução Animal, da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ /
UNESP – Campus de Botucatu
Aluna: Ana Lívia Rocha Monteiro
Orientador: Prof. Ass. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira
Professores Responsáveis: Prof ª Dr ª Maria Denise Lopes
Prof Dr Sony Dimas Bicudo
Botucatu-SP
2006
RESUMO
Há hoje uma preocupação global com a conservação dos animais, por outro
lado se observa um grande número destes em extinção, situação provocada pela
expansão urbana desordenada, degradações ambientais e principalmente o
tráfico de silvestres, no qual atinge principalmente as aves, sendo 82% dos
animais apreendidos no Brasil. Dentro de todo esse contexto vê-se a real
necessidade de programas de conservação desta espécie. A neuroendocrinologia
comportamental é o elo entre a função neuroendócrina e o comportamento em
animais, sendo, portanto uma importante ferramenta no auxílio à conservação,
pois auxilia na avaliação da saúde de uma população ou de um indivíduo. Esses
hormônios podem ser avaliados a partir do plasma sangüíneo (métodos invasivos)
ou a partir de metabólitos nas fezes (métodos não-invasivos), por RIA
(radioimunoensaio), EIA (ensaio imunoensimático) e HPLC (Cromatografia
Líquida de Alta Performance).
PALAVRAS – CHAVE
“Monitoramento não-invasivos, hormônios, reprodução, estresse, bem-estar”
Sumário
1. Introdução 5 2. Revisão de literatura 6 2.1. Animais em extinção 6 2.2. Hormônios do estresse 7 2.2.1. Corticosteróides 8 2.2.2. Prolactina 8 2.3. Hormônios da Reprodução 8 2.3.1. Testosterona 9 2.3.2.Progesterona e Estrógeno 9 2.4. Avaliação dos Hormônios 10 2.4.1. Métodos invasivos 10 2.4.2. Métodos não-invasivos 11 2.4.2.1. Corticosteróides 13 2..4.2.2. Testosterona 13 2.4.2.3. Progesterona e Estradiol 15 2.4.3. Interação entre os Métodos 16 2.4.4.Análise dos Hormônios 16 2.4.4.1.Extração dos Hormônios 16 2.4.4.2. Cromatógrafo Líquido de Alta Performance ( HPLC) 17 2.4.4.3. Radioimunoensaio (RIA) 17 3. Considerações Finais 18 4. Referências Bibliográficas 19
5
1. INTRODUÇÃO
Há hoje uma preocupação global com a conservação dos animais, por outro
lado se observa um grande número destes em extinção. Esta crise de extinção é
predominantemente causada por atividades humanas, incluindo habitat,
destruição, introdução de novas espécies e predação direta.
As últimas pesquisas apontam que milhares de espécies animais foram
extintas nos últimos cem anos. Muitas destas espécies jamais serão conhecidas
por gerações futuras. Sabemos que, muitas delas, poderiam revelar ao homem
informações importantes sobre o meio ambiente e até mesmo a cura para
determinados tipos de doenças.
Estratégias para aliviar esta crise devem ser desenvolvidas pelo homem,
como o controle da população humana, preservação do habitat e uma gestão
mais eficiente de populações nativas e exóticas.
Dentro deste contexto percebe-se a real necessidade de programas de
conservação para animais ameaçados de extinção e conseqüentemente para a
sobrevivência das espécies, promovendo a procriação, criando condições para a
sobrevivência de populações de vida livre em suas regiões de origem.
A neuroendocrinologia comportamental é o elo entre a função
neuroendócrina e o comportamento em animais, sendo, portanto uma importante
ferramenta no auxílio à conservação, pois auxilia na avaliação da saúde de uma
população ou de um indivíduo. Esses hormônios podem ser avaliados a partir do
plasma sangüíneo (métodos invasivos) ou a partir de metabólitos nas fezes e na
urina (métodos não-invasivos), por RIA (radioimunoensaio), EIA (ensaio
imunoensimático) e HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance).
Há necessidade de validação destes métodos para cada espécie estudada,
visto que são técnicas espécie-específicas.
A mensuração dos esteróides fecais tem provido gradativamente uma
importante técnica para avaliação da reprodução, do estresse ambiental e
agressão em populações de animais e indivíduos de vida livre e de cativeiro.
Esta revisão objetiva caracterizar técnicas não invasivas para avaliar os
hormônios ligados ao estresse e à reprodução de animais de vida livre e de
cativeiro, pois esta metodologia tem permitido o monitoramento a longo prazo dos
6
hormônios avaliados, refletida de maneira mais fisiológica, uma vez que dispensa
os estressantes da colheita de sangue.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Animais em extinção
Os cientistas estimam que hajam em torno de 10 a 15 milhões de espécies
da fauna, flora e microorganismos, desse total 60 mil seriam vertebrados (5 mil
mamíferos e 10 mil aves) e o outro restante seria de insetos e plantas
(http://www.suapesquisa.com/animais/ 18/03/2006).
O relatório do Planeta Vivo 2004 mostra que em 30 anos houve uma redução
de 40% da fauna (http://www.agirazul.com.br/a2/_a2/000001e2.htm/
18/03/2006)Outra importante pesquisa publicada em relatório da União para
Conservação da Natureza (UICN) mostrou que um quarto das espécies
conhecidas pelo homem estão ameaçadas de extinção (http://www.iucn.org/
18/03/2006).
Não se tem certeza do número exato de animais estão extinção em no
mundo, mas os especialistas mencionam que são mais de 17.000 a cada ano,
que são quase dois a cada hora. Se este rítmo continuar é estimado que no início
do século seguinte haverão apenas15 e 25 % de todas as espécies habitantes do
planeta, o que levará a um grande prejuízo futuro.
São diversas as causas que levam a extinção de animais no mundo, dentre
elas, segundo Lopes (2002), a expansão urbana descontrolada, degradações
ambientais e tráfico de animais, tendo o último, papel fundamental neste
processo.
O tráfico traz sérios e substanciais riscos para as espécies comercializadas,
para a saúde e subsistência do homem, ampliando o risco de doenças para
humanos, animais domésticos e silvestres (EUWB, 2005). De acordo com Lopes
(2002), o tráfico de animais silvestres é considerado um dos maiores negócios do
mundo, ocupando o 3º lugar no ranking da ilegalidade.
O Brasil participa com cerca de 5-15% do total mundial (LOPES, 2000 apud
RENCTAS, 2005) e envolve todas as regiões do país (LOPES, 2002). É estimado
7
que a cada ano esta atividade movimente entre dois a cinco milhões de aves
vivas, representando 82% do total de animais apreendidos (RENCTAS, 2005).
2.2. Hormônios do estresse
Um adequado balanço entre o processo de catabolismo (mobilização de
energia) induzido pelos hormônios do estresse como a epinefrina, norepinefrina e
cortisol e processos anabólicos (reparação, cicatrização e crescimento)
provocados por esteróides sexuais e hormônios de crescimento são necessários
para a sobrevivência e saúde do animal (LUNDBERG, 2005). Porém com o
aumento da pressão antropogênica e dos distúrbios ambientais, este equilíbrio
pode ser quebrado (ROMERO, 2004), induzindo ao estresse psicológico crônico.
As respostas ao estresse por longo período de tempo afetam negativamente
a sobrevivência, a reprodução e a resistência às doenças, devido à queda da
imunidade de uma grande variedade de aves e mamíferos (HOFER and EAST,
1998 apud DEHNHARD et al., 2003).
A elevação dos níveis de glicocorticóides circulantes resulta em uma
alteração no metabolismo dos carboidratos e uma alteração na via energética em
atividades não essenciais (McKENZIE e DEANE, 2005). Contudo, se o estresse
tornar-se crônico ou freqüente, muitos efeitos deletérios podem ocorrer incluindo
inibição da reprodução e supressão da função imune (SAPOLSKY, 1992 apud
McKENZIE e DEANE, 2005). O cortisol influencia no metabolismo das células, na
distribuição da gordura e no sistema imune, seus níveis são controlados pelo
sistema de feedback no hipotálamo e a formação hipocampal (LUNDBERG,
2005).
Os animais respondem a um estressor com uma série de respostas
endócrinas que aumentam imediatamente a energia disponível em parte por
inibição de processos biológicos que não são requeridos para sobrevivência
imediata (Wingfield, 1994). Uma das respostas primárias ao estresse é um
aumento da atividade do eixo hipotalâmica-pituitária-adrenocortical causando um
aumento da concentração de glicocorticóides na circulação sanguínea. Em pouco
tempo (horas ou dias), os glicocorticóides se elevam redirecionando os recursos
para mobilizar a energia que pode ser usada para resolver a situação de estresse
(Sapolsky, 1992). Caso o estressor não for eliminado e os níveis de
8
glicocorticóides continuarem altos por mais que alguns dias, resultaram
conseqüências prejudiciais, incluindo supressão do sistema imune, diminuição de
massa muscular e supressão reprodutiva (Pottinger, 1999).
Lundberg (2005) descreve ainda que algumas implicações na saúde do
animal devido ao elevado nível de cortisol circulante podem promover o acúmulo
de gordura na região abdominal, infarto do miocárdio, problemas
cardiovasculares, diabetes Tipo 2, redução da função do sistema imune, prejuízos
de cognição entre outros.
Portanto, para avaliar a saúde de uma população, estudos sobre
mensuração de resposta ao estresse têm aumentado nas áreas de ecologia,
biologia e medicina da conservação (eg. WASSER et al., 2002).
2.2.1. Corticosteróides
A concentração plasmática de glicocorticosteróides é um indicador de
estresse confiável, acurado e preciso (BEUVING & VONDER, 1986 apud
DEHNHARD et al., 2003), porém em animais silvestres, os níveis plasmáticos de
corticosterona em aves, anfíbios, répteis e muitos roedores e cortisol em peixes e
mamíferos (ROMERO, 2004) elevam-se rapidamente, em aproximadamente 3 a 5
minutos após contenção e manipulação (WINGFIELD & ROMERO, 2001 apud
ROMERO, 2004), além de a avaliação plasmática ser pontual, não representando
os níveis hormonais ao longo do tempo (HARPER & AUSTAD, 2000).
2.2.2. Prolactina:
A prolactina plasmática eleva rapidamente seus níveis durante o estresse em
mamíferos, este aumento é freqüentemente considerado como parte da resposta
clássica ao estresse (De VLAMING, 1979 apud CHASTEL et al., 2005). Porém,
segundo Chastel (2005), em aves, há várias indicações que os níveis de
prolactina plasmática podem decrescer em eventos de estresse.
2.3. Hormônios da Reprodução
Entender os processos básicos de reprodução é crucial para determinar
porque alguns animais se reproduzem e outros não. Diversas espécies de
9
felídeos não domésticos se reproduzem fracamente em cativeiro, e há poucas
informações fisiológicas disponíveis para ajudar a identificar as causas desta
reprodução falha em certas espécies, sejam em populações ou indivíduos.
Portanto a meta é desenvolver uma base de dados das inter-relações de
regulação das atividades hormonais. Desse modo, monitorar padrões hormonais,
mas utilizar métodos por coleta de sangue não é prático para estas espécies. Em
substituição, deve-se fazer o uso de técnicas não invasivas para avaliar a função
reprodutiva precisam ser desenvolvidas (Brown et al, 1993).
2.3.1. Testosterona
A testosterona é um hormônio esteróide do testículo, o qual é responsável
pela maturação sexual do macho humano, incluindo o crescimento dos testículos
e do pênis e facilita a espermatogênese (Griffin & Wilson, 1992). Em um grande
número de espécies sinais de agressão são testosterona dependente (Wingfield
et al., 1994).
Morais et al. (1997) em seus estudos com três espécies de pequenos
felídeos, machos, comparou a atividade adrenal com características reprodutivas,
concluiu que apesar do estudo não ter estabelecido especificamente causa-efeito
entre esta relação, houve uma modesta relação entre as altas concentrações de
corticóide fecal e a função espermática prejudicada.
2.3.2. Progesterona e estrógeno
O estabelecimento do comportamento sexual depene da exposição, ou falta
de exposição, do hipotálamo à testosterona durante o início do período neonatal.
Verdadeiramente a testosterona (convertida em estrogênio por aromatização)
promove a masculinização dos centros sexuais no hipotálamo; na ausência da
testosterona o hipotálamo torna-se feminino (CUNNINGHAM, 1999).
Existem vários princípios com relação aos efeitos dos hormônios sobre o
comportamento sexual dos animais domésticos. Primeiramente, a magnitude da
variação na concentração hormonal que afeta o comportamento sexual é
pequena: na gata, por exemplo, um aumento na concentração de 17β-estradiol de
10 a 20 pg/mL de plasma resulta em sinais de proestro. Em segundo lugar, o
10
sinergismo entre hormônios costuma ser importante para a receptividade sexual:
por exemplo, na cadela é importante a elevação do estrogênio seguida pela
progesterona. Em terceiro a seqüência de exposição ao hormônio pode ser
importante; por exemplo: na ovelha é requerida a exposição a progesterona antes
da exposição ao estrogênio para que haja manifestação do estro. O estrogênio,
originado no desenvolvimento do folículo antral, é o hormônio necessário à
receptividade sexual em todos os animais domésticos. A progesterona derivada
da granulosa do folículo pré-ovulatório, ou do corpo lúteo também é importante
para o estro em alguns animais (CUNNINGHAM, 1999).
2.4. Avaliação dos hormônios
2.4.1. Métodos invasivos
De acordo com Good (2003), a mensuração de esteróides no plasma reflete
a situação de um indivíduo em um momento pontual, portanto mudanças rápidas
e em curto prazo nas concentrações de glicocorticóides, como aquelas
provocadas por um novo ambiente ou situação, são mais bem determinadas
utilizando amostras de plasma.
Para Brown & Wildt (1997) uma única coleta de sangue pode produzir
valores que representam apenas um único momento, o pico ou o ponto médio de
uma secreção pulsátil.
No passado, glicocorticóides eram tipicamente quantificados do sangue.
Ensaios baseados no sangue (soro ou plasma) mensuram o nível destes
hormônios avaliados em resposta biológica imediata do animal (WINGFIELD et
al., 1994). Portanto o uso de avaliação sangüínea é restrito a algumas espécies,
pois normalmente o animal precisa primeiro ser capturado, conseqüentemente
comprometendo a avaliação do estresse agudo (COOK et al., 2000). Porém estes
estudos não são possíveis em animais selvagens. Em adição, a amostra pontual
provida da mensuração do sangue pode não ser representativa para análises de
níveis hormonais para um longo tempo, devido a padrões de secreção pulsátil dos
glicocorticóides no sangue (HARPER & AUSTAD, 2000).
Estudos com avaliação de hormônios em felídeos selvagens não
progrediram tão rápido quanto os de felídeos domésticos, principalmente por
11
causa de tecnologias inadequadas. O primeiro estudo sério para investigar o
sistema endócrino do gato doméstico foi para fundamentar a atividade hormonal
em fêmeas, portanto estas foram mantidas sob condições extremamente
controladas e contidas, um pequeno volume de sangue foi coletado por várias
vezes para estabelecer a dinâmica da gonadotrofina pituitária e a secreção do
esteróide ovariano envolvido na regulação da reprodução. Foram estabelecidos
então valores normais para o gato doméstico, mas por causa da dificuldade de
coleta de sangue para deduzir o dado hormonal e a impossibilidade de
estabelecer padrão semelhante para outras espécies, não há como identificar
estes valores para os felídeos selvagens (BROWN & WILDT, 1997), com este tipo
de abordagem.
Para haver uma coleta sangüínea em animais selvagens é necessário
anestesiá-los e apesar de anestesias ocasionais para este fim não afetar
desfavoravelmente o potencial reprodutivo, a dinâmica da secreção hormonal
(amplitude do pulso e freqüência) pode ser interrompida temporariamente por
drogas anestésicas específicas (JOHNSON & GAY, 1981).
De acordo com Brown & Wildt (1997) o uso de anestesia no intervalo peri-
ovulatório para coleta sangüínea em felídeos selvagens é contra-indicado porque
os dados subseqüentes do hormônio podem está comprometidos.
2.4.2. Métodos não-invasivos
Métodos não invasivos para quantificar o estresse estão sendo
desenvolvidos e aplicados em estudos de vertebrados, o qual oferece diversas
vantagens sobre os métodos invasivos. Os ensaios feitos com metabólitos fecais
de hormônios estão sendo agora utilizados em uma variedade de áreas (ciência
animal, ecologia comportamental, biologia conservacionista, ornitologia e
primatologia) para examinar o estatus reprodutivo e adrenocortical (Dehnhard et
al., 2001).
Estes métodos não invasivos são em particular usados porque amostras
podem ser facilmente obtidas sem incômodo ao animal e sem colocá-lo em perigo
durante a captura (Wasser et al., 2000). Conseqüentemente, amostras podem ser
coletadas em intervalos regulares ao longo do tempo. Por não causar incômodo
ao animal, técnicas não invasivas podem suprir uma avaliação acurada do
12
estresse sem a influência do aumento nos glicocorticóides induzidos pela captura.
Portanto os ensaios feitos com metabólitos fecais de glicocorticóides refletem um
nível médio destes hormônios circulantes por um período de tempo, melhor que
uma amostra pontual, e por isso pode prover uma avaliação mais acurada de um
longo tempo de seus níveis (HARPER & AUSTAD, 2000).
Métodos não-invasivos de análise de hormônios ligado ao estresse e a
reprodução, realizada através das fezes, urina e saliva, têm demonstrado uma
importante ferramenta para o monitoramento do bem-estar dos animais
(WASSER et al. 2002; DEHNHARD et al., 2003; LUNDBERG, 2005; McKENZIE e
DEANE, 2005).
Nas fezes há uma grande quantidade de hormônios esteróides como os
andrógenos, estrógenos e progestágenos; glicocorticóides como os
corticosteróides, cortisol e dehidroepiandrosterona e mineralocorticóides. Os
hormônios proteicos, de alto peso molecular, como os luteinizantes e o hormônio
do crescimento são destruídos no intestino e vão para a urina, não podendo ser
avaliados nas fezes. Em adição, hormônios de baixo peso molecular, como os
tireóideos e prostaglandinas, são grupos pouco estudados e apresentam-se nas
fezes (WASSER et al., 2002).
A variação da excreção dos hormônios esteróides pela urina e fezes varia
conforme a espécie e o hormônio a ser avaliado (PALME et al., 1996 apud
WASSER et al., 2002), devendo levar em conta possíveis contaminações ao
avaliar as amostras (WASSER et al., 2002).
Shille et al (1984, 1990) determinou que o estrógeno no gato doméstico foi
excretado nas fezes e não na urina, e em pesquisas subseqüentes afirmou que o
metabólito da progesterona foi quantificado nas fezes em felídeos selvagens.
Brown & Wildt (1997) afirmaram que o monitoramento dos hormônios por
métodos não invasivos proporcionou o entendimento da biologia reprodutiva de
animais e que esta é uma das mais poderosas ferramentas de avaliação em
zoológicos atualmente.
A amostra fecal, ao contrário da amostra sangüínea representa níveis de
metabólitos hormonais de períodos longos, conseqüentemente refletindo o
mínimo de oscilações, a confusão entre a dinâmica secretória normal e uma
resposta fisiológica é improvável. Outra vantagem desta técnica é a de que os
13
cientistas não têm um número limitado de amostras, as amostras podem ser
coletadas por diversas vezes e por tempo indeterminado (BROWN & WILDT,
1997).
Khan et al (2002) apud Whitten et al. (1998) afirmou que amostras fecais
são mais fisiológicas, mais estáveis por um tempo maior quando armazenadas
em temperaturas abaixo de zero.
Brown & Wildt (1997) afirmaram que o monitoramento por metabólitos
esteróides nas fezes habilita a avaliação do estado de puberdade, pois o início da
atividade gonadal esteroidogênica é associada com o estabelecimento e
manutenção da gametogênese; determinação da incidência de ovulação
espontânea versus induzida; previsão de parição, identificação de prenhez e
caracterização de período pós-parto; identificação de causas de inatividade
reprodutiva (senescência reprodutiva) ou hiperatividade, incluindo várias
patologias como cistos foliculares e retenção de corpo lúteo; melhora de
tratamentos com gonadotrofina exógena usada na reprodução assistida, por
exemplo, determinando se o tratamento em particular resultou em uma resposta
ovariana normal ou anormal; avaliação do nível do estresse fisiológico como uma
ferramenta para avaliar e melhorando o habitat para aumentar o bem-estar e
também o potencial reprodutivo; e comparações entre espécies para estudo da
conservação e evolução de mecanismos reprodutivos.
2.4.2.1. Corticosteróides:
Dehnhard et al. (2003) revisaram que em patos (Anas platyrhynchos) e
galinhas (Gallus domesticus) os corticosteróides circulantes são metabolizados
pelo fígado apresentando meia-vida de 10 a 15 minutos, sendo excretados pelas
fezes e urina. Porém observaram que em galinhas os níveis de corticosterona
fecal, relacionados ao estresse, são detectados 4 horas após estimulação; os
mesmos autores revisaram que há variações conforme a espécie de ave
estudada.
Hormônios esteróides são excretados via intestinal através da bile, após
clearance do sangue pelo fígado. Mudanças na dieta do animal alteram a
excreção biliar, podendo incorrer em erros na avaliação. Em um estudo com
babuínos, esta alteração fora eliminada através do método de congelamento a
14
seco das amostras. (WASSER et al., 1993 apud WASSER et al., 2002). Assim é
interessante um exame separado para cada pool de amostra fecal, de acordo com
a dieta oferecida.
A longevidade dos hormônios excretada pode ser afetada pelo local de
trabalho (temperatura/ umidade), pela forma de armazenagem de curto prazo
(material utilizado durante o transporte da amostra – p.ex. sílica ou etanol) e pela
forma de armazenagem de longo prazo (modo de conservação da amostra até a
sua análise – p.ex. congelamento, secagem ou congelamento a seco). O melhor
método de armazenagem varia conforme a espécie e o hormônio analisado
(WASSER et al., 2002).
2.4.2.3. Testosterona
Brown et al (1996, I) em pesquisas com gatos domésticos determinou o
tempo do curso e a rota primária de excreção da injeção de testosterona C14
marcada em gatos domésticos, validou o radioimunoensaio para quantificar
metabólito fecal do andrógeno e demonstrou a relevância fisiológica do
andrógeno fecal imunoreativo no gato doméstico e em felídeos não domésticos.
Concluiu que os metabólitos da testosterona são excretados quase
exclusivamente nas fezes no gato doméstico macho; que a mensuração dos
metabólitos andrógenos permite ser monitorar a atividade esteroidogênica
testicular no gato doméstico; e que este procedimento também tem um potencial
para ser uma valiosa ferramenta para acessar o status androgênico de espécies
de felídeos ameaçadas de extinção.
Morais et al (1996) utilizando três espécies de felídeos selvagens avaliou
pelo monitoramento não invasivo, analisou metabólitos fecais de esteróides para
gerar uma base de dados reprodutivos destas espécies, foram pesquisados
então: a ciclicidade do estro das fêmeas; a função testicular (esteroidogênica e
espermática) em machos e a influência da estação do ano na atividade
reprodutiva em machos e fêmeas, concluiu que as análises feitas com o
monitoramento não invasivo, por meio dos metabólitos fecais do ovário e do
testículo demonstrou utilidade; em cada espécie houve influência da estação do
ano na atividade reprodutiva, apesar de muitos parâmetros terem efeitos
modestos; estas informações são importantes para definir o processo reprodutivo
15
normal, o qual fortemente prova a ajuda valiosa para melhorar as estratégias de
auxílio à conservação de espécies.
2.4.2.2. Progesterona e Estradiol
Diversos estudos foram feitos usando análises de metabólitos fecais de
progesterona e estradiol para examinar a atividade ovariana, estas informações
foram utilizadas para avaliar as possíveis causas de performance reprodutiva
fraca em animais de cativeiro (BROWN et al, 1996, II).
Brown et al (1996, II) em estudos com fêmeas de chitas (Acinonyx jubatus),
esteróides fecais foram utilizados para avaliar eventos reprodutivos nesta espécie,
para confirmar e explicar a aparente falta de ciclicidade ovariana. Em adição, um
novo dado foi produzido na “regularidade” da resposta ovariana ao hormônio
exógeno de indução, e ao protocolo de inseminação artificial em comparação ao
perfil traçado pelo esteróide fecal na prenhez versus não prenhez dos animais
após o acasalamento.
Czekala et al (1994) analisaram metabólitos fecais do estradiol e
progesterona para monitorar a atividade esteroidogênica de felídeos. Para Brown
et al (1996, I) estes dados servem para auxiliar na reprodução assistida, pois com
eles sabe-se o momento correto de fazer uma inseminação artificial, por exemplo,
havendo assim menos chances de falha neste tipo de reprodução.
Brown et al (1993) pesquisando taxas de excreção e o metabolismo da
progesterona no gato doméstico e então desenvolver e validar o
radioimunoensaio para avaliação de progesterona fecal, monitorando assim a
função ovariana no gato doméstico.
2.4.3. Interação entre os métodos:
Nos estudos de Dehnhard et al. (2003) com galinhas, corvo-marinho e
falcão, a dinâmica das concentrações dos metabólitos fecal refletiu o curso da
atividade biológica do hormônio no plasma.O pico do metabólito fecal
acompanhou o do plasma sangüíneo com um atraso de 3,5 + 1,1 h.
2.4.4. Análise dos hormônios:
16
É de fundamental importância o anticorpo escolhido para a análise das
amostras, para evitar falsos positivos/negativos. Além da validação dos níveis de
cortisol fecal devido a grande variabilidade de excreção com relação às espécies
(WASSER et al., 2002).
Hormônios adrenais e gonadal nas fezes podem ser avaliados por técnicas
de EIA (Ensaio Imunoenzimático), RIA (Radioimunoensaio), HPLC (Cromatografia
Líquida de Alta Performance) (DEHNHARD et al., 2003).
2.4.4.1. Extração dos hormônios
Segundo Brown e Wildt (1997), o método de extração dos metabólitos
esteróides das fezes conta com a combinação de solventes orgânicos e aquosos.
Amostras são liofilizadas, pulverizadas e 0,1 – 0,2 g do pó é fervido em 5mL
de etanol a 90%:água destilada por 20 minutos. Posteriormente centrifugado em
500 g por 10 minutos, o supernadante é recuperado e o pellet ressuspendido em
5 mL de etanol a 90%, homogeneizado por 1 minuto e recentrifugado. Os
supernadantes do etanol são combinados, secos completamente e então
redissolvido em 1 mL de metanol. Os extratos são homogeneizados (1 minuto),
colocados em um recipiente ultrasônico, limpo por 30 segundos e livres de
partículas aderidas em sua parede, e então homogeneizado brevemente (15
segundos). O extrato depois é diluído (1:20 – 1:80 para o estradiol; 1:800 –
1:80.000 para progesterona) em fosfato (0,01 M PO4, 0,14 M NaCl, 0,5%
albumina sérica bovina (BSA), 0,01% sódio , pH 7,4) antes da análise. Este
método resulta em alta recuperação de esteróides endógenos das amostras nos
estudos rádio marcados, como também esteróides marcados (Wasser et al, 1991,
1993).
2.4.4.2. Cromatógrafo Líquido de Alta Performance (HPLC)
Brown et al. (1996), em seus ensaios com felídeos utilizou HPLC para
determinar o número e a proporção relativa de metabólitos da testosterona nas
fezes de gatos e na sua urina, e foram determinados por estágio reverso HPLC.
Antes da HPLC, amostras são reconstituídas em 0,5 mL, passadas através de
uma coluna matriz C-18 e diluída com 5mL de 80% de metanol para remover os
17
contaminantes. O filtrado de extratos fecal e urinário forma evaporados,
reconstituído em 60µL de metanol, e diluído usando um gradiente de 20-30-40-50-
100% metanol: água após 0-10-40-55-120 minutos respectivamente. Uma fração
de mL foi coletada após um período de 120 minutos (1 mL/ minuto taxa de
escoamento). O perfil co-diluição de 3H-testosterona, 3H-androsterona e 3H-
androstenediol também foram determinados. Frações HPLC de diluição foram
levados para secar, reconstituídos em fosfato-protegido salino e metabólito
imunoreativo de testosterona quantificado por RIA.
2.4.4.3. Radioimunoensaio (RIA)
Testosterona imunorreativa em extratos fecais e frações HPLC foram
mensuradas usando anticorpo duplo. 125I- testosterona RIA. O anti-soro foi
seguido à reação cruzada: 100% testosterona, 34% dihidrotestosterona, 3,8% 5β-
androstan-3α, 17β-diol, 3,3% 11-hidroxitestosterona, 2,9% 5α-androstan-3α, 17β-
diol, 2,7% 5α-androstan-3β.17β-diol, 2,1% androsterona, e <1% com drostenediol,
DHEA, 5β-dihidrosterona, aldosterona, cortisol, cortisona, corticosterona,
estradiol, pregnanediol, progesterona e 17α-hidroxiprogesterona. A testosterona
ensaiada foi validada por extratos fecais no gato doméstico por demonstração:
paralelismo entre diluições de extratos e curva padrão; e recuperação significante
de testosterona exógena (2,5-200 ng/mL), adicionada de extratos fecais.
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Por causa do potencial efeito deletério do estresse crônico há um grande
interesse entre os diversos campos de estudo em mensurar o estresse animal.
Biólogos conservacionistas estão freqüentemente interessados com o alívio dos
efeitos das condições ambientais e distúrbios induzidos pelo homem na vida
selvagem. Estes estudos auxiliam também na avaliação de manejos
desenvolvidos para animais que vivem em cativeiro.
Após o desenvolvimento de técnicas de avaliações não invasivas é hoje
possível descobrir porque indivíduos ou populações não estão reproduzindo ou
mesmo reproduzindo de forma insatisfatória, podendo facilitar em gestões para a
18
proliferação e em conseqüência conservações de diversas espécies ameaçadas
de extinção, além de evitar que outras espécies tornem-se ameaçadas.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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