Microbiological Examination of Non-sterile Products.pdf

Uji Mikrobiologi untukProduk Non‐steril

Marlia Singgih WibowoSekolah Farmasi ITB

• Pembahasan mencakup : “microbial enumeration tests”  dan “tests for specified micro‐organisms” 

• Untuk uji , gunakan campuran dari beberapabagian yang di sampling : bulk bahan baku ataudari beberapa isi wadah yang jumlahnya cukup

• Jika sample diencerkan dengan fluid medium, ujiharus dilakukan secepat mungkin, secara hati2 untuk mencegah biohazard. 

Acuan

• USP• EP• Harmonisasi USP dan EP

Microbial Enumeration Tests • Uji kuantitatif untuk menghitung jumlah mesophilic bacteria dan

fungi , yang tumbuh dibawah kondisi aerob. • Uji ini dilakukan terutama untuk menentukan apakah suatu

senyawa atau produk memenuhi syarat atau comply denganpersyaratan kualitas mikrobiologi. 

• Jumlah sampel dan interpretasi hasil nya harus sesuai denganinstruksi pada acuan yang digunakan. 

• Metode yang digunakan tidak dapat digunakan untuk sediaanatau produk yang mengandung mikroorganisme viabel sebagaiactive ingredients. 

• Metode Alternative , termasuk metode instrumentasi danotomatis, dapat digunakan sepanjang ekuivalen dengan metodePharmacope. 

• Jika produk yang diuji memiliki aktivitas antimikroba, maka harus dilakukan penambahan larutan penetral(hrs di neutralized)

• Jika inactivator digunakan utk tujuan tersebut, makaefektivitas nya dan ke “tidak toksik” an nya harus diujiterhadap mikroorganisme. 

• Jika senyawa aktif‐permukaan digunakan dalammenyiapkan sampel, bahan tersebut harus diuji ke“tidak toksik” an nya, dan harus diuji kompatibilitas nyadengan bahan inaktivator yang digunakan. 

Enumeration Methods • Dapat menggunakan membrane filtration method, atau the plate‐count methods.  Metode most probable number (MPN) biasanya kurang akurat, namun untuk sampelyang rendah bioburden nya, dapat pula digunakan. 

• Pemilihan metode berdasarkan : nature of the product , dan batas mikroorganisme yang dipersyaratkan . 

• The suitability of the chosen method harusestablished. 

Growth Promotion Test, Suitability of the Counting Method and Negative Controls 

• Kemampuan metode uji untuk mendeteksimikroorganisme dengan adanya produk harusdiuji. 

• Suitability harus dikonfirmasi jika adaperubahan dalam kinerja uji, yang dapatmempengaruhi hasil uji

Persiapan mikroorganisme uji

• Gunakan standardised stable suspensions of test strains  atau lihat dalam tabel yang disiapkan pada Farmakope

• Gunakan buffered sodium chloride‐peptone solution pH 7.0  atau phosphate buffer solution pH 7.2  untuk suspensimikroorganisme ; 

• Untuk spora Aspergillus niger spores, gunakan0.05 % Polysorbate 80  ke dalam buffer.

Negative control • Gunakan biakan mikroorganisme untuk inokulasi tidaklebih dari 5 passages dari master seed‐lot. 

• Gunakan suspensi dalam waktu 2 jam atau 24 jam jikadisimpan dalam suhu 2 – 8°C.  Sebagai alternatif, encerkan fresh suspension dari vegetative cells A. nigeratau B. subtilis, lalu simpan pada 2 –8°C untuk periodewaktu tertentu

• Untuk verifikasi kondisi uji, gunakan negative control dengan pengenceran yang sama, harusnya tidak akanada pertumbuhan setelah inkubasi. 

• Jika negative control menunjukkan pertumbuhan, makaperlu dilakukan inverstigasi.  

Growth Promotion Test untuk media 

• Lakukan uji untuk “ready‐prepared “medium  dansetiap batch medium, baik yang dehydrated medium atau dari ingredients described.

• Inokulasi pada media casein soya bean digest broth dan casein soya bean digest agar  dengansejumlah mikroorganisme (tidak lebih dari 100 CFU) untuk setiap media 

• Inokulasi cawan berisi Sabouraud‐dextrose agar dengan sejumlah mikroorganisme (tidak lebihdari 100 CFU) untuk setiap media

• Inkubasi sesuai tabel pada uji GPT media 

• Untuk media padat, pertumbuhan yang diperoleh tidak boleh berbeda lebih dari 2x nilai perhitungan yang diperoleh dariinokulum standar. 

• Untuk inokulum segar, pertumbuhanmikroorganisme harus sebanding dengan yang diperoleh pada uji sebelumnya.  

• Untuk media cair, pertumbuhanmikroorganisme harus dibandingkan denganhasil uji sebelumnya. 

Suitability of the counting method in the presence of product

• Persiapan sampel• Cara penyiapan sampel tergantung pada sifatfisik sampel yang akan diuji. Jika tidak ada carayang disarankan dapat digunakanuntuksampel yang akan diuji,maka metodealternatif harus dikembangkan.  

Inokulasi dan pengenceran

• Inokulasikan ke dalam sampel sejumlahmikroorganisme (tidak lebih dari 100 CFU). Volume suspensi inokulum tidak boleh lebihdari 1 % dari volume produk yang diencerkan .

• Jika sampel itu sendiri telah memberikan efekinhibisi terhadap mikroorganisme, suspensimikroba dapat ditambahkan setelah proses netralisasi, peengenceran atau filtrasi. 

Neutralization/menghilangkanaktivitas antimikroba

• Jumlah mikroorganisme yang muncul daritreatmen sampel yang telah diencerkan, dibandingkan dengan kontrol

• Jika pertumbuhan mikroorganisme terhambat(jumlah berkurang 2x nya) ,  modifikasiprosedur untuk validasi hasilnya.  Misalnya : 

(1)Meningkatkan volume pengencer ataumedium biakan

(2)Gabungkan bahan penetraldengan bahanpengencer (

(3) Filtrasi membran atau(4) Kombinasi metode di atas

• Neutralizing agents dapat digunakan untuk me netralisasi aktivitas antimikroba senyawasampel

• Zat tersebut dapat ditambahkan ke dalampengencer atau medium sebaiknya sebelumproses sterilisasi

• Jika tidak ada metode netralisasi yg sesuai, maka dapat dipastikan adanya aktivitasmikrobisida dari produk.  

• Informasi ini menunjukkan bahwa produktersebut tidak mungkin terkontaminasi olehmikroba uji,  

• Namun mungkin saja produk dapatterkontaminasi dengan mikroba lain selainmikroba uji. Untukhal ini maka lakukanpengenceran lebih lanjut. 

Rekoveri mikroorganismedi dalam produk

1 Membrane filtration2 Plate‐count methods : 

‐ Pour‐plate method,  ‐ Surface‐spread method

3 Most‐probable‐number (MPN) method

Hasil dan interpretasi hasil

• Saat melakukan verifikasi suitability  membrane filtration method atau Plate‐count method, rata2 perhitungan ada ujimikroorganisme tidak berbeda lebih dari 2x nilai kontrol

• Saat verifikasi suitability MPN method, nilaiyang dihitung dari inokulum, harus berada di dalam rentang 95 per cent confidence limits dari hasil kontrol .  

• If the above criteria cannot be met for one or more of the organisms tested with any of the described methods, the method and test conditions that come closest to the criteria are used to test the product.

Uji terhadap Products 

• Jika tidk dinyatakan lain, gunakan 10 g or 10 mL produk yg akan diuji

• Untk cairan atau padatan dlam aerosol gunakan 10 containers.

• Untuk transdermal patches, sample 10 patches. 

• Jumlah sampel yg diuji dapat dikurangi padakondisi sbb :

• jumlah per dosage unit (mis. tablet, kapsul, injeksi ) kurang atau sama dengan 1 mg  ataujumlah per gram atau milliliter (for preparations not presented in dose units) kurang dari 1 mg. 

• Dalam kasus ini, jumlah sampel tidak kurang darijumlah 10 dosis(dosage units) atau 10 g atau 10 mL dr produk. 

• Untuk bahan aktif yang digunakan dalamproduk yang sangat kecil (i.e. lebih kecil dari1000 mL atau 1000 g), maka jumlah yg diujiharus 1 % dari batch kecuali jumlah nyaditetapkan sebelumnya. 

• Untuk jumlah produk total kurang dari 200 (mis. Utk sampel clinical trials), ukuran sampeldapat dikurangi jadi 2 unit saja

• Untuk sampel yg kurang dari 100, makasampel dapat digunakan 1 saja. 

• Select the sample(s) at random from the bulk material or from the available containers of the preparation. To obtain the required quantity, mix the contents of a sufficient number of containers to provide the sample. 

Examination of the product

• Membran filter method• Pour Plate method• Spread‐surface method• MPN method

Interpretasi hasil

• The total aerobic microbial count (TAMC) is considered to be equal to the number of CFU found using casein soya bean digest agar; if colonies of fungi are detected on this medium,they are counted as part of TAMC. The total combined yeasts/mould count (TYMC) is considered to be equal to the number of CFU found using Sabouraud‐dextrose agar; if colonies of bacteria are detected on this medium, they are counted as part of TYMC. When the TYMC is expected to exceed the acceptance criterion due to the bacterial growth,  so>>>

Sabouraud‐dextrose agar containing antibiotics may be used. If the count is carried out by the MPN method the calculated value is the TAMC. • When an acceptance criterion for microbiological quality is prescribed it is interpreted as follows: ‐10  CFU: maximum acceptable count=20,‐101 CFU: maximum acceptable count=200,‐102 CFU: maximum acceptable count=2000, and so forth.

• The recommended solutions and media are described in Tests for specified 3 micro‐organisms.