„Molekulare Biophysik“ NMR-Spektroskopie (Teil...

„Molekulare Biophysik“

NMR-Spektroskopie

(Teil 3)

DasNMR-Spektrometer

Peter SchmiederFMP

Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie

Das NMR-Spektrometer

Magnet

Hardware-SchrankProbenkopf

Probenwechsler

Peter SchmiederFMP

Magnet

B0 [Tesla] 0 [MHz]

1.4 60

5.9 250

9.4 400

14.1 600

21.2 900

Das Erdmagnetfeld hat eine Stärke

von 30-60 T (0.3 –0.6 Gauss)

Peter SchmiederFMP

Magnet

flüssiger Stickstoff

Supraleitende Spule

Bohrung des Magneten:54 mm „narrow bore“89 mm „wide bore“

flüssiges Helium

Peter SchmiederFMP

Magneten sind faszinierend aber auch gefährlich

Peter SchmiederFMP

RT-Probenkopf

Cryo-Probenkopf

ATM-Probenkopf

Peter SchmiederFMP

Der Probenkopf

Peter SchmiederFMP

Die Probe im Probenkopf

Helmholtz-Spule

Peter SchmiederFMP

Der Shim, das Problem der Homogenität

a,b,c,d

a,b,c,da,b,c,d

a,b,c,d

Peter SchmiederFMP

Die Hardware, d.h. die Elektronik

Peter SchmiederFMP

Hardware

Peter SchmiederFMP

Hardware

Peter SchmiederFMP

;zgdc;avance-version (03/04/17);1D sequence with decoupling

#include <Avance.incl>

"d11=30m"

1 zed11 pl12:f2

2 30m do:f2d11 cpd2:f2d1p1 ph1go=2 ph3130m do:f2 mc #0 to 2 F0(zd)

ph1=0 2 2 0 1 3 3 1ph31=0 2 2 0 1 3 3 1

Software

Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie

Peter SchmiederFMP

Ein Problem der eindimensionalen NMR-Spektroskopie ist, dass selbst recht einfach

Moleküle oft nicht oder nur mit hohem Aufwand eindeutig zugeordnet werden können

Zimtsäureethylester

Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)

Peter SchmiederFMP

Ein Zuordnung mit Datenbanken ist oft nicht sicher genug

7.30 4.19

01234567PPM

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm

Peter SchmiederFMP

Mit 13C oft noch besser als mit 1H

126.4 145.2

166.561.4

020406080100120140160180PPM

160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

Peter SchmiederFMP

Der entscheidende Vorteil dermehrdimensionalen NMR-Spektroskopie ist:

MagnetisierungstransferEs entstehen Signale, die auf eine Wechselwirkung zwischen den Kernen hinweisen. Das können WW

durch die Bindung (via J-Kopplung) oder durch den Raum (via NOE) sein.

Diese Signale werden auf einer Fläche oder in einem mehrdimensionalen Raum verteilt, was eine gute

Auflösung ermöglicht.

Peter SchmiederFMP

1D-NMR2 Achsen:

Intensität vs. Frequenz

2D-NMR3 Achsen:

Intensität vs. Frequenz (1)vs. Frequenz (2)

Peter SchmiederFMP

1D-NMR schematisch

Preparation Detektion

Peter SchmiederFMP

1D-1H-Spektrum

C11H13N2O3Br

Peter SchmiederFMP

2D-NMR Sequenzen enthaltenzwei neue Elemente:

Evolutionszeit und Mischzeit

Preparation Evolution Mischung Detektion

Evolution:Erzeugen einer weiterenFrequenzachse durch indirekte Detektion

Mischung:Transfer von Magnetisierung von

Spin zu Spin über Wechsel-Wirkungen zwischen Spins

(t1) (t2)

Peter SchmiederFMP

Mit der Evolutionszeit wird

eine indirekte Dimension

erzeugt, man bewerkstelligt

das durch die systematische

Veränderung einer

Zeitspanne in einer Sequenz

von Pulsen, man braucht also

mindestens zwei Pulse.

Die Evolutionszeit

Peter SchmiederFMP

Die Aufzeichnung des FIDs

haben wir uns schon im Detail

angeschaut, sie wird jetzt für

jeden neuen Zeitwert

wiederholt. Auch in der

indirekten Dimension müssen die

Zeiten ganzzahlige Vielfache

eines Intervalls t sein

Die Evolutionszeit

Peter SchmiederFMP

Das schauen wir uns wieder näher an und nutzen die gleichen

drei Linien wie beim 1D

y 90°-x

y 2000 Hz-500 Hz

-1500 Hz

90Y90-x

kt1kt2

Peter SchmiederFMP

Man erkennt dass die Anfangsintensität in t2

von der Frequenz abhängt

(kt1 = t1)

Peter SchmiederFMP

3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000

10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0

t1 = 166 sec

t1 = 0 sec

t1 = 332 sec t1 = 498 sec

t1 = 0 sec

t1 = 166 sec

t1 = 332 sec

t1 = 498 sec

Peter SchmiederFMP

3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000

10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0

t1 = 0 sec

t1 = 166 sec

t1 = 332 sec

t1 = 498 sec

t [msec]

0.2 0.3

0.5Iy0

Entlang der indirekten Zeitachse entsteht das gleiche Bild wie entlang der direkten

Peter SchmiederFMP

Insgesamt also ein zweidimensionaler FID

Peter SchmiederFMP

Eine erste FT ergibt ein „Interferogram“.

Peter SchmiederFMP

Eine zweite FT ergibt ein zweidimensionales Spektrum.

Peter SchmiederFMP

Zur Auswertung

betrachtet man

Contour-Plots, die

Peakintensität als

Höhenlinien

darstellen.

Peter SchmiederFMP

In mehrdimensionalen Experimenten wird gute Auflösung

durch mehr Werte für kt1 erreicht.

Daher ist in mehrdimensionalen Experimenten die

Auflösung in den indirekten Dimensionen immer begrenzt.

Die Zeit für die Messung ist

aber der Anzahl der

aufgezeichneten FIDs direkt

proportional, gute Auflösung

bedeutet also lange Messzeit.

Peter SchmiederFMP

Gäbe es nur Evolution und Detektion dann würde in

beiden Zeitdimensionen immer die gleichen Frequenzen

detektiert, ganz entscheidend ist also die Mischzeit, in

der es zur Übertragung von Magnetisierung von einem

Kern zum nächsten kommt.

(t1) (t2)

Peter SchmiederFMP

Diese Übertragung von Magnetisierung während der Mischzeit kann durch verschiedene Mechanismen

geschehen. Der am meisten verwendete Mechanismus ist die J-Kopplung, von großer Bedeutung ist aber auch

der NOE-Effekt, die Übertragung durch den Raum.

Peter SchmiederFMP

Wichtig ist auch ob die Übertragung zwischen gleichen Spins der gleichen Kernsorte oder

andersartigen Spins erfolgt.Man unterscheidet daher homonukleare und

heteronukleare Experimente.

Peter SchmiederFMP

homonukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen gleichartigen Kernen statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen des gleichen Kerns. Findet Transfer statt, ergibt sich in beiden Dimensionen eine unterschiedliche Verschiebung: KreuzsignalFindet kein Transfer statt, dann ergibt sich in beiden Dimensionen die gleiche Verschiebung:Diagonalsignal

Peter SchmiederFMP

heteronukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen unterschiedlichen Kernsorten statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen unterschiedlicher Kerne. Findet Transfer statt, ergibt sich ein Signal am Schnittpunkt der chemischen Verschiebungen der involvierten Kerne. Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich kein Signal.

Peter SchmiederFMP

3D-NMR

Preparation

Evolution

Mischung

Detektion

Preparation Evolution (1) Mischung (1) Evolution (2) Mischung (2) Detektion

Ein dreidimensionales Experiment entsteht formal durch

Kombination von zwei zweidimensionalen Experimenten,

solche Experimente sind vor allem bei Proteinen wichtig.

Peter SchmiederFMP

Das Spektrum ist dann keine Fläche mit

Signalen mehr sondern ein Würfel, mit drei

Achsen mit chemischer Verschiebung.

Intensität zeigt sich als „vierte Dimension“

Peter SchmiederFMP

Mit einem Satz homo- und heteronuklearer 2D-Experimente sollte eine Zuordnung aller Resonanzen von kleinen Molekülen möglich sein, oft braucht man

nur ein COSY, ein HMQC und ein HMBC

Zimtsäureethylester

Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)

Das COSY-Experiment

Peter SchmiederFMP

Die einfachste denkbare zweidimensionale

Sequenz besteht aus zwei Pulsen, das ist das

homonukleare COSY:

90Y90x

Peter SchmiederFMP

Wir haben mit derEvolutionszeit eine zweiteDimension erzeugt aber

das 2D Spektrumhat nur eine Diagonale.

Wenn wir nur die Evolution betrachten haben wir aber auf beiden Achsen die gleiche Information.

H1 H2H (ppm)

H (ppm)

Peter SchmiederFMP

Wenn wir in der Mischzeit aber Transfer haben dann

ist etwas neues entstanden:

Es gibt Signale, die in den

beiden Dimensionen mit

unterschiedlichen

chemischen Verschiebungen

„markiert“ worden sind:

die Kreuzsignale. 1 2

H1 H2H (ppm)

H (ppm)

Transfer

Peter SchmiederFMP

Ein Anwendungsbeispiel:

H H H H

?J12 J34

J12 ~ J34

Eine Zuordnung ist im 1Dnicht möglich...

Peter SchmiederFMP

....aber im 2D ganz leicht.

Peter SchmiederFMP

Im COSY ist die Ethylgruppe leicht, Aromat und Olefin nicht komplett zuzuordnen

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

7.07.5 ppm

7.30 4.19

Das HMQC/HMBC-Experiment

Peter SchmiederFMP

HMQC/HMBC

Bislang haben wir ein homonukleares Experiment betrachtet, man kann aber auch in natürlicher

Häufigkeit heteronuklearen Experimente machen, entweder basierend auf der direkten 1H-X-

Kopplung (HMQC) oder der Weitbereichskopplungen (HMBC).

nX X X

1H HMQCHMBC

Peter SchmiederFMP

HMQC/HMBC

Ob ein Transfer stattfindet hängt von der Größe

der Kopplungskonstanten ab und kann auch durch die

Pulssequenz beeinflusst werden.

Mit Kopplungen < 1 Hz ist kein Transfer möglich.

Kopplungen über eine Bindung sind größer als über

mehrere Bindungen.

1JHH = 276 Hz

2JHH = 0 .. 30 Hz3JHH = 0 .. 20 Hz4JHH = 0 .. 3 Hz

1JHC = 125 .. 200 Hz

2JHC = 0 .. 20 Hz3JHC = 0 .. 15 Hz4JHC = 0 .. 2 Hz

1JHN = 60 .. 100 Hz

2JHN = 0 .. 15 Hz3JHN = 0 .. 8 Hz4JHN = 0 .. 1 Hz

Peter SchmiederFMP

HMQC/HMBC

Man kann sich zwei Varianten von heteronuklearen

zweidimensionalen Experimenten überlegen, je

nachdem welchen Kern man detektiert und welchen

man in der indirekten Dimension hält.

Das hat Einfluss auf die Auflösung, die erreichbar

ist, und auf die Empfindlichkeit der Messung.

In der indirekten Dimension erfordert doppelte

Auflösung doppelte Zeit, in der direkten Dimension

ist das kein Problem.

Peter SchmiederFMP

HMQC/HMBC

Die Empfindlichkeit der Messung hängt von mehreren Faktoren ab:

MagneticMoment

Spin AngularMomentum

Bd 0S/N ~ (pB0) (d)( )

H ~ 4 C, die Detektion auf Protonen bringtalso einen Faktor 8 !!

Peter SchmiederFMP

HMQC/HMBC

HMQC = Heteronuclear MultipleQuantum Correlation

Ein Signal zeigt die direkte Bindung

zwischen H und X an.

Die Kopplung zwischen H und X ist nicht zu sehen, während der Evolution

und der Acquisition wird „entkoppelt“.

Peter SchmiederFMP

Im HMQC unseres kleinen Moleküls bekommen wir 5 Korrelationen von Wasserstoffen zu Kohlenstoff im Aromaten / Olefin-Bereich

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

7.07.58.0 ppm

126.4 145.2

166.561.4

100% Zuordnung haben wir aber noch nicht

Peter SchmiederFMP

HMQC/HMBC

Um die Spektren ganz zweifelsfrei zuzuordnen brauchen wir dann das HMBC in dem Signale durch die

kleinen, über mehrere Bindungen reichenden Kopplungen erzeugt werden.

Im allgemeinen sind 2J und 3J Kopplungen groß genug um eine Korrelation zu ergeben, in bestimmten Situationen können aber auch Kopplungen über mehrere Bindungen

Signal ergeben.Signale durch direkte Kopplung versucht man zu unterdrücken um das Spektrum zu vereinfachen.

Peter SchmiederFMP

HMQC/HMBC

= via 1JHX

Transfer via 1JHX Transfer via nJHXX

HMBC = Heteronuclear MultipleBond Correlation

HMQC HMBC

Es bleiben nicht unterdrückte Signale von den 1JHC übrig als kleine Doubletts, andere Signale zeigen

Weitbereichskopplung an.

Peter SchmiederFMP

Im HMBC sind die Signale der Ethylgruppe wieder eindeutig und man findet auch leicht das CO der Säuregruppe

126.4 145.2

166.561.4

H Hppm

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

Peter SchmiederFMP

Um mit Aromaten und Olefinen klar zu kommen muss man sehr genau hinschauen

126.4 145.2

166.561.4

grün = HMQC, rot = nicht unterdrückte Signale

6.66.87.07.27.47.67.88.0 ppm

Ein Beispiel

Peter SchmiederFMP

Ein Beispiel: Brivudin

C11H13N2O3Br Desoxythymidin

Das Molekül: Brivudin

Brivudin wird bei Herpes zoster angewendet

Peter SchmiederFMP

Die Experimente

1D-1H 1 min

1D-13C 1 h

DEPT 10 min

COSY 10 min

13C-HMQC 10 min

13C-HMBC 50 min

15N-HMQC 3 h

15N-HMBC 35 h

Peter SchmiederFMP

1D-1H-Spektrum

C11H13N2O3Br

1 1 11 1 1 1 1 1 2 2

Peter SchmiederFMP

C11H13N2O3Br

1D-13C-Spektrum

Peter SchmiederFMP

C11H13N2O3Br

DEPT-Spektrum

1D-13C-Spektrum

Peter SchmiederFMP

Zuckerbereich

Korrelation von Frequenzen via 1H-1H-Kopplung, i.a. nur zwei oder drei Bindungen.

7 oder 8,nicht unterscheidbar

Peter SchmiederFMP

3‘OH

5‘OH

4‘5‘

Peter SchmiederFMP

13C-HMQCZuckerbereich

Basenbereich

5‘3‘

6Korrelation von Frequenzen

via 1H-13C-Kopplung, man korreliert nur direkt

aneinander gebundene Kerne.

Peter SchmiederFMP

1‘4‘ 5‘3‘6 7/8 7/8

1D-13C-Spektrum

Peter SchmiederFMP

13C-HMBC

Zuckerbereich

Basenbereich

Korrelation von Frequenzen via 1H-13C-Kopplung, man korreliert über bis zu 4

Bindungen (2JHC bis 4JHC), 1JHC gibt ein Dublett.

Peter SchmiederFMP

13C-HMBC(Basenbereich)

Korrelation ausgehend von H1‘ Korrelation zu 5 ist

schwach und 5 ist von 7/8 aus zu sehen.

= via 1JHC

Peter SchmiederFMP

Korrelation ausgehend von H3

C2 fehlt !!

Hier muss 7 sein N

6 1‘

Peter SchmiederFMP

Korrelation ausgehend von H7, das via H3 zugeordnet ist.

Peter SchmiederFMP

Korrelation ausgehend von H8, das via H3/H7 zugeordnet ist.

Peter SchmiederFMP

Korrelation ausgehend von H6, alles ist zu sehen, das hilft nicht beim Zuordnen,

es passt aber alles.

Peter SchmiederFMP

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

15N-HMQC

Peter SchmiederFMP

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

15N-HMBC

3 6 1‘ 2‘

Peter SchmiederFMP

Zuordnung1H [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]

1' 6,16 84,5 -

2' 2,17 39,8 -

3' 4,27 69,9 -

4' 3,79 87,5 -

5' 3,62 61 -

1 - - 149,7

2 - 149,2 -

3 11,92 - 157,7

4 - 161,6 -

5 - 109,7 -

6 8,09 139,4 -

7 6,87 129,9 -

8 7,25 106,5 -

13C [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]

predicted dT dT

1' 77,8 ± 8,2 85,1 -

2' 39,9 ± 5,1 40,4 -

3' 68,7 ± 1,6 71,7 -

4' 74,8 ± 9,2 88,4 -

5' 63,8 ± 0,3 62,4 -

1 - - 142,7

2 156,8 ± 10,6 151,6 -

3 - - 153,5

4 135,7 ± 6,9 137,3 -

5 117,5 ± 3,1 110,5 -

6 135,7 ± 11,4 164,9 -

7 132,6 ± 6,9 - -

8 89,4 ± 15,8 - -

Peter SchmiederFMP

Das DOSY (Diffusion Ordered SpectrocopY) ist eine besondere Art von Spektroskopie, da es zweidimensionale

Spektren erzeugt, die auf einer Achse die Diffusionrate des Moleküls anzeigen.

Die Diffusionsrate kann für unterschiedliche Untersuchungen von Bedeutung sein, z.B. für eine Bestimmung von Größe oder

Aggregation. Sie kann aber auch zur Untersuchung von Stoffgemischen eingesetzt werden, wobei die Spektren der im Gemisch enthaltenen Stoff nach deren Größe getrennt

aufgetragen werden.Das Experiment nutzt die Tatsache dass die Diffusion die

Moleküle durch das Probenvolumen bewegt, dessen Magnetfeld durch Gradienten beeinflusst werden kann.

Peter SchmiederFMP

Ohne Diffusion können zwei Gradienten durch einen 180°-Puls aufgehoben werden. Den 180°-Puls kann man auch in zwei Hälften teilen und dazwischen einfach warten das Diffusion passiert, z-

Magnetisierung ist langlebiger als x,y-Magnetisierung

180 18090 90 90

Peter SchmiederFMP

DOSYDas Experiment wird nun mehrfach durchgeführt und dabei die Gradientenstärke zwischen 0 und maximal variiert. Man erzeugt also eine indirekte Dimension mit Gradientenstärke statt Zeit.

Die Zeit für die Diffusion bleibt dabei konstant.

180 18090 90 90

Peter SchmiederFMP

g [T/m]

Die zu erwartenden Intensitäten ergeben sich aus den

Diffusionsgleichungen: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]

Das ist eine Gauss-Kurve: I = Io exp – x g2

Peter SchmiederFMP

Die kann linearisiert werden: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]

T = 2 ( - /3 - /2) - ln (I/Io) = D 2 T * g2

g2 [T2/m2]

- ln (I/Io)

y = -0,0051203 + 14,129x R= 0,99998

Damit kann die

Diffusionskonstante

aus der Steigung

ermittelt werden

Peter SchmiederFMP

% Gradient

Ein praktisches Beispiel ist die Untersuchung zweier

Komplexbildner in D2O, es sollte festgestellt werden ob die beiden

eine Komplex miteinander bilden

1H-1D-Spektrum

pseudo-2D-Spektrum

Gauss-Kurve

Peter SchmiederFMP

Zur Auswertung wurde neben der linearisierten Gausskurve….

auch eine andere Art der Darstellung gewählt

Peter SchmiederFMP

Man kann die Gausskurven durch eine inverse Laplace-

Transformation in ein Spektrum mit Diffusionskonstante auf der

indirekten Achse verwandeln.

log(m2/s)

Diffusionskonstante

Fragen: schmieder@fmp-berlin.de

Scripte: schmieder.fmp-berlin.info/teaching/vorlesung_mbph.htm

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