View
7
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
T.C.
SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
İN VİTRO ÇİNKO UYGULAMASININ DNA HASARI,
ERİTROSİT FRAJİLİTE VE LİPİT PEROKSİDASYONU
ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Tuğba DEMİRAL
Danışman
Prof. Dr. Mustafa CALAPOĞLU
YÜKSEK LİSANS TEZİ
KİMYA ANABİLİM DALI
ISPARTA - 2018
©2018 [Tuğba DEMİRAL]
i
İÇİNDEKİLER
Sayfa İÇİNDEKİLER .................................................................................................................... i ÖZET ................................................................................................................................. iii ABSTRACT ....................................................................................................................... iv TEŞEKKÜR ........................................................................................................................ v ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................................. vi ÇİZELGELER DİZİNİ ...................................................................................................... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ....................................................................... viii 1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ .................................................................................................... 3
2.1. Çinko ....................................................................................................................... 3 2.1.1. Çinkonun kimyasal ve fiziksel özellikleri ............................................................ 4 2.1.2. Çinkonun kullanım alanları ve maruziyeti ........................................................... 5 2.1.3. Çinko maruziyeti ................................................................................................ 5
2.2. Çinko Biyokimyası ................................................................................................... 7 2.3. Çinko Elementinin Emilimi ve Metabolizması .........................................................10 2.4. Çinko Hemeostazı ...................................................................................................11 2.5. Çinkonun Hücre Ölümündeki Rolü ..........................................................................14
2.5.1. Çinkonun apoptozise etkisi ............................................................................... 14 2.6. Çinko ve Oksidatif Stres .........................................................................................16
2.6.1. Çinkonun oksidatif stress ile ilişkili kronik hastalıklardaki rolü ......................... 23 2.7. Eritrositler ve Redoks Düzenlemesi .........................................................................25
2.7.1. Eritrositlerde oksidan kaynaklar ........................................................................ 27 2.7.2. Eritrositlerdeki antioksidan sistemler................................................................. 29 2.7.3. Oksidasyon reaksiyonlarının ve redoks düzenleme bozukluklarının sebep
olduğu eritrosit hasarı ....................................................................................... 29 2.7.4. Eritrosit hemolizin biyokimyasal sonuçları ........................................................ 30
2.8. DNA Hasarını Belirlemede Kullanılan Yöntemler....................................................30 2.8.1. Comet testi (tek hücre jel elektroforezi) ............................................................. 31
3. MATERYAL ve YÖNTEM ...........................................................................................33 3.1. Deneylerde Kullanılan Cihazlar ...............................................................................33 3.2. Deneyde Kullanılan Kimyasal Maddeler ..................................................................33 3.3. Eritrosit Membran Stabilizasyonunun Belirlenmesi ..................................................33 3.4. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu Tayini .........................................................35 3.5.Tek Hücre Jel Elektroforezi (Comet ) Tayini.............................................................36
3.5.1. Kan örneklerinin alınması ................................................................................. 36 3.5.2. Lenfosit örneklerinin hazırlanması .................................................................... 36 3.5.3. Çinko çözeltilerinin hazırlanması ve lenfositler ile muamele ............................. 36 3.5.4. Hücre sayımı..................................................................................................... 37 3.5.5. Comet tekniği ................................................................................................... 37 3.5.6. Boyama ............................................................................................................ 37 3.5.7. Değerlendirme .................................................................................................. 37 3.5.8. Comet sonuçlarının istatistiksel değerlendirmesi ............................................... 38
4. ARAŞTIRMA BULGULARI .........................................................................................39 4.1. Eritrosit Membran Stabilizasyonunu Bulguları .........................................................39 4.2. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu ....................................................................42 4.3. İn-Vitro Comet Bulguları .........................................................................................43
5. TARTIŞMA VE SONUÇLAR .......................................................................................45 6. ÖNERİLER....................................................................................................................53
ii
KAYNAKLAR ..................................................................................................................55 ÖZGEÇMİŞ .......................................................................................................................70
iii
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
İN VİTRO ÇİNKO UYGULAMASININ DNA HASARI, ERİTROSİT
FRAJİLİTE VE LİPİT PEROKSİDASYONU ÜZERİNE ETKİLERİNİN
ARAŞTIRILMASI
Tuğba DEMİRAL
Süleyman Demirel Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Mustafa CALAPOĞLU
Zn2+, büyüme, hücre bölünmesi, metabolizma, yara iyileşmesi, bağışıklık, üreme, tat
ve görme fonksiyonlarının işleyişi gibi birçok fizyolojik süreç için gerekli olan iki
değerli bir geçiş iyondur. Çinko maruziyetinin insan eritrosit membranının bazı
özellikleri üzerindeki etkisi in vitro olarak çalışıldı. Ayrıca, insan periferal kan
lenfositlerinde çinkonun genotoksik potansiyelini ortaya koymak için alkali comet
analizi yapılmıştır. Bu çalışmada, değişen konsantrasyonlardaki tüm Zn2+
çözeltilerinin, doza bağımlı bir şekilde lipit oksidasyonunu inhibe etmede oldukça
zayıf bir etki göstermiştir. Eritrositlerin çinko ile inkübasyonunun ardından,
çinkonun hücrelerin hemolitik direncindeki belirgin azalmaya yol açtığını da
saptadık. Çalışmalarımız, yüksek konsantrasyonlarda çinkonun insan eritrositleri için
toksik olabileceğini ve hemolitik direncin değişmesine neden olabildiğini
göstermektedir. Comet sonuçları, kontrolle karşılaştırıldığında yüksek dozlardaki
çinko doz-bağımlı olarak istatistiksel anlamlı düzeyde DNA hasarı oluşturdu (p
<0.05). Bu çalışmanın in vitro verileri yüksek dozda çinko alımının faydadan daha
fazla zarara neden olabileceğini düşündürmektedir.
Anahtar Kelimeler: Çinko, Mebran stabilizasyonu, Genotoksisite, Lipid
peroksidasyonu
2018, 70 sayfa
iv
ABSTRACT
M.Sc. Thesis
INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF IN VITRO ZINC TREATMENT
ON DNA DAMAGE, ERYTHROCYTES OSMOTIC FRAGILITY AND LIPID
PEROXIDATION
Tuğba DEMİRAL
Süleyman Demirel University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Chemistry
Supervisor: Prof. Dr. Mustafa CALAPOĞLU
Zn2+is a divalent transition ion essential for many physiological processes including:
the growth and cell division, metabolism, wound healing, immunity, reproduction,
functioning of taste and eyesight. The effect of zinc exposure on some properties of
the human erythrocyte membrane was studied in vitro. In addition, the alkaline
comet assay was used to investigate genotoxicity potential of the zinc in dte
peripheral blood lymphocytes. In this study, all the various concentrations of Zn2+
solutions showed quite weak efficacy to inhibit lipid oxidation in dose dependent
manner. We also detected that incubation of erythrocytes with zinc lead to the
marked decrease of hemolytic resistance of the cells. Our studies demonstrate that
zinc at higher concentrations may be toxic to human erythrocytes causing changes in
the hemolytic resistance. The comet results indicated a significant DNA damage at
higher doses after treatment with zinc when compared to controls showing a clear
dose-dependent response (p<0.05). The in vitro data of the present study suggest that
high dosage intake of zinc may cause more harm than benefit.
Keywords: Zinc, Membrane Stabilizing, Genotoxcicity, Lipid peroxidation
2018, 70 pages
v
TEŞEKKÜR
Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları bilgi ve tecrübesi ile
aşmamda yardımcı olan değerli Danışman Hocam Prof. Dr. Mustafa
CALAPOĞLU’na teşekkürlerimi sunarım.
Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan aileme sonsuz sevgi ve saygılarımı
sunarım.
Tuğba DEMİRAL
ISPARTA, 2018
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 2.1. Çinko zehirlenmesi ile eksikliği etkilerinin karşılaştırılması ............ 5
Şekil 2.2. Zn homeostazisi. ............................................................................. 10
Şekil 2.3. Hücrelerdeki çinko dağılımı şeması. ................................................ 12
Şekil 2.4. Hücresel çinko homeostazı ve çinkonun sitotoksisite üzerindeki
etkisi ............................................................................................... 13
Şekil 2.5. Çinkonun antioksidan mekanizmalardaki rolü ................................. 22
Şekil 2.6. RBC'lerde redoks regülasyonu ......................................................... 27
Şekil 2.7. Comet Metodunun Genel Basamakları ............................................ 32
Şekil 3.1. Tuz konsantrasyonundaki azalma ile oluşan tipik eritrosit hemoliz
eğrisi ............................................................................................... 35
Şekil 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin
zamana göre H50 değerleri ............................................................... 41
Şekil 4.2 Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin
zamana göre dX değerleri ................................................................ 42
Şekil 4.3. Çinkonun H2O2 aracılıklı lipid oksidasyonu üzerine etkisi ............... 43
Şekil 4.4. Farklı konsantrasyonlarda çinko’ya maruz kalan lenfosit
hücrelerinden elde edilen % kuyruk DNA kometi hata çubuk grafiği 44
vii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 2.1. Çinkonun fonksiyonlarına örnekler .............................................. 9
Çizelge 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinkonun zamana göre insan eritrosit
membranının osmotik stabilitesi üzerine etkisi. ............................ 40
Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda çinko ile muamele edilen insan
lenfositlerinin comet verileri ........................................................ 44
Çizelge 5.1. Plazma çinko konsantrasyonlarının, yaş gruplarına, cinsiyete ve
açlık durumuna göre cutoff değerleri. .......................................... 49
Çizelge 5.2. Olası, yeni geliştirilen ve yararlı olmayan çinkonun biyolojik
belirteçleri. .................................................................................. 52
viii
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
AE Akrodermatisis entropatika
ASC Askorbik asit
CRP C-reaktif protein
GI Gastrointestinal
GPx Glutatyon peroksidaz
Hb Hemoglobin
MT Metallotiyoin
MTF Metal transkripsiyon faktör
NMDAR N-metil-D-aspartat reseptör
PBS Fosfor tamponlu tuz çözeltisi
PÇK Plazma çinko konsantrasyonu
PRx Peroksiredoksin
ROS Reaktif oksijen türleri
SOD Süperoksit dismutaz
T Tiyonin
TBA Tiyobarbütirik asit
TBS Trisin tamponlu tuz çözeltisi
1
1. GİRİŞ
Çinko insan metabolizmasında çeşitli enzimler aracılığı ile yaşam için normal
büyüme ve gelişmede çok önemli rol oynar. Hücre büyümesi, bölünme ve
farklılaşmasında yeralan çinkonun özellikle bebeklik, çocukluk, adelosan ve
hamilelik gibi hücre üretiminin arttığı hızlı büyüme dönemlerinde çok önemli olduğu
gösterilmiştir. Gebelikte yeterli miktarda çinko, bakır değerleri gebeliğin normal
seyrinde, komplikasyonsuz bir doğum ile anne ve bebek sağlığı için önem
taşımaktadır.
Çinko insan sağlığı için kritik olan bir elementtir ve çok az eksikliğinde dahi birçok
hastalık ortaya çıkar. Çinko eksikliği anoreksi, iştah kaybı, tat ve koku kaybı gibi
birçok semptoma yanı sıra immün sistemi etkileyebilmekte, aterosiklorozu
tetikleyebilmekte ve anemi oluşturabilmektedir. Çinko eksikliği fitomitojenlere T-
lenfosit cevabında azalma, T hücre sayısında azalma ve trombosit kümelenmesindeki
kusura bağlı olarak baskılanmış hemostasis oluşumuna yol açar. Çinko yegâne doğal
olarak oluşan lenfositik mitojendir (Keen ve Gershwin, 1990; Tapiero ve Tew,
2003). Çinko eksikliği ayrıca gastrointestinal bozukluklara, böbrek hastalığına, orak
hücre anemisine, alkolizme, bazı kanser tiplerine, yaşlanmaya da eşlik etmektedir
(Keen ve Gershwin, 1990)
Çinko bütün canlı organizmalarda birçok fizyolojik olaylar için gerekli olan halk
sağlığı ve klinik anlamlılığı açısından önemli olan bir esansiyel eser elementtir.
Çinko desteği için son yıllarda yapılan geniş çaplı randomize kontrollü çalışmalar,
popülasyonlarda çinko eksikliğinin yaygın olduğunu ve bu duruma bağlı olarak
oluşan halk sağlığı sorununun çözümünde çinko desteğinin önemli olduğunu
göstermektedir. Beslenme açısından esansiyel elementlerin alım aralıkları, alımın
çok düşük (eksiklik) veya çok yüksek (toksisite) olduğu durumlarda ortaya çıkan
sağlık üzerine olumsuz etkileri genellikle basit bir model çerçevesinde
tartışılmaktadır. Bir çok yerleşim birimlerini, popülasyonları ve araştırma
dizaynlarını içeren çalışmaların ortaya koyduğu genel konsensüs, diyare, pnömoni ve
büyüme bozukluğu görülen hastalara uygulanan çinko desteğinin olumlu tepkiler ile
ilişkili olduğudur. Ayrıca bu durum, sağlık masraflarının karşılanmasında bireysel
veya toplumsal olarak fon eksikliği ile karakterize edilen sağlık sistemlerinin geçerli
2
olduğu toplumlarda hafif ila orta şiddette çinko eksikliğinin nispeten yaygın olduğu
sonucuna yönelik temel kanıtlar ortaya koymaktadır.
Tahmini olarak ABD'de nüfusunun % 15'i çinkoyu diyet takviyesi olarak
kullanmaktadır (Briefel vd., 2000). Karışık bir diyetle beslenen sağlıklı yetişkinlerde
çinko dengesi oluşabilmekte veya günlük 11 mg çinko alımıyla da pozitif çinko
dengesi sağlanmaktadır. Çinko, et, bazı sebzeler (fasulye ve nohut) ve fıstık gibi
gıdalarda bulunur. Çoklu vitamin formüllerine eklenmesiyle, çinko alınımı tavsiye
edilen günlük alınım değerlerinin birkaç katına kadar ulaşabilmektedir. Ayrıca,
alternatif dergilerde ve kitaplarda tanıtılan sağlık yararları nedeniyle yüksek
miktarlarda ilave çinko tüketilebilmektedir. Bununla birlikte, kronik yüksek doz
çinkonun insan sağlığı üzerinde ne gibi etkileri olduğu açık değildir.
Çinko ve diğer metallerin biyolojisi, insan hastalıklarıyla ilişkilidir. Örneğin, metal
taşıyıcıları kodlayan genlerdeki genetik defektler, metal eksikliğine veya fazlalığına
yol açarak hastalıklara neden olabilmektedir (Clayton, 2017). Buna ek olarak,
kontamine olmuş içme suyunun tüketilmesinden sonra veya mesleki maruziyet
yoluyla ortaya çıkabilecek yüksek seviyeli metallerin birikmesi insan gelişimini
olumsuz yönde etkileyebilmekte ve hastalığa neden olabilmektedir.
Günümüzde çinko preparatları çeşitli hastalıklar için terapötik ajan olarak
kullanımının yanı sıra besin desteği olarak ta yoğun tıbbi kullanıma sahip olduğu
bilinen bir gerçektir. Ayrıca çinko preparatlarının kullanımı herhangi bir klinik
değerlendirme yapılmadan özellikle de çocuklarda besin desteği olarak da
kullanılabilmektedir. Çalışmamızda çinko kullanımının in-vitro genotoksik, oksidatif
ve eritrosit membran stabilizasyonu üzerine etkileri hücresel seviyede
değerlendirilerek, gereksiz çinko veya aşırı çinko kullanımının toplum sağlığı
üzerine etkilerini belirleme amacıyla düşük veya yüksek çinko alınımına bağlı olarak
ortaya çıkabilecek patolojik durumların araştırılmasının yanı sıra çinko ile ilgili
oluşabilecek olumsuzlukları tanımlama ve maruziyet ile sonuç arasındaki ilişkiyi
ortaya koyulması hedeflemektedir.
3
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1. Çinko
Mineraller yer kabuğunda doğal olarak oluşan inorganik maddelerdir. Çoğu
mineraller sağlığın sürdürülmesi, hayatın devamı ve çeşitli biyolojik fonksiyonlar
için gereklidirler ve “esansiyel besinler” olarak adlandırılırlar.
Çinko sağlıklı bir yaşam için duyulan mineral miktarına göre iki gruba
ayrılmaktadırlar.
1. Makro mineraller: Sodyum (Na), kalsiyum (Ca), potasyum (K), klor (Cl),
fosfor (P), mağnezyum (Mg) ve kükürt (S) gibi yüksek miktarlarda (>100
mg/gün) ihtiyaç duyulan minerallerdir.
2. Mikro mineraller veya iz elemnetler: Demir (Fe), çinko (Zn), bakır (Cu),
selenyum (Se), molibden (Mo), krom (Cr), brom (Br), flor (F) ve kobalt (Co)
gibi düşük miktarlarda (< 100 mg/gün) ihtiyaç duyulan minerallerdir (Van
Schoor, 2008).
Mikro mineraller gurubuna dahil olan çinko elementi organizmaların tüm
organlarında, dokularında ve vücut sıvılarında yer almaktadır. Çinko canlılardaki
proteinlerin yapısına girmesinin yanı sıra enzimlerin aktif bölgelerine bağlanarak,
enzim katalizinde anahtar rol oynar. Çinko ayrıca intraselüler bir düzenleyici olup,
moleküler etkileşimlerde proteinler için yapısal destek sağlar. Biyolojik
membranların ve iyon kanallarının stabilitesini ve bütünlüğünü korur. Nükleik asit
veya diğer gen düzenleyici proteinlerde yapısal element olarak rol oynar. Redoks
aktivitesinin olmaması nedeniyle bağlandığı proteini dayanıklı hale getirir.
Karbonhidrat, protein, lipid, nükleik asit, hem sentezi, gen ekspresyonu, üreme ve
embriyogeneziste de görevleri vardır (Arcasoy, 2002; Rostan vd., 2002).
Perreira ve Parise (1993), ısı pompalarında kullanılan pistonlu kompresörlerde
kapasite kontrolü üzerine bir araştırma yapmışlardır. İnceledikleri sistem, açık tip
birpistonlu kompresör, su soğutmalı kondanser, su soğutmalı evaporatör ve genleşme
4
valfinden oluşmaktadır. Evaporatörün sabit aşırı kızdırma sıcaklığında ve sabit
basınçta çalıştığı kabul edilmiştir. Sistemde R12 soğutucu akışkanı kullanılarak beş
farklı kontrol yöntemini incelemişlerdir. Bu kontrol yöntemleri, değişken hız,
değişken hacim, basma gazının by-pass edilmesi, emiş gazının kısılması ve emiş
valfinin kapatılmasıdır. Yaptıkları simülasyonda, değişken hız ile değişken hacim
değerleri için kompresör verileri kullanılmıştır. Diğer parametreler için matematiksel
model oluşturulmuştur. Beş farklı sistem parametresinin karşılaştırılabilmesi için
ısıtma performans katsayısı ve kompresör basma sıcaklığı değerleri tespit edilmiştir.
Model sonuçlarına göre kapasite kontrolü için en iyi sonuçları değişken hız ve
değişken hacim kontrol mekanizmaları vermiştir. Değişken hızlı kapasite
kontrolünde, soğutucu akışkan debisi arttıkça volümetrik verim düşmüş, güç tüketimi
ile basma sıcaklığı artmıştır. Diğer bir sonuca göre, kondanser suyu çıkış sıcaklığı
kompresör hızıyla beraber artmıştır.
2.1.1. Çinkonun kimyasal ve fiziksel özellikleri
Çinko periyodik çizelgenin geçiş elementlerinin II B grubunda yer alan bir
elementtir. Çinkonun atom numarası 30, atom ağırlığı ise 65,39’dur. Çinko ilk kez
1746 yılında kimyacı S. Margraaf tarafından kömür ve kalaminin ısıtılması ile izole
edilmiştir. Canlılarda çinkonun önemini ilk olarak 1869 yılında Raulin ortaya
atmıştır (Özçelik, 1998).
Çinko iki elektronunu kaybetme eğiliminden dolayı +2 değerlikli katyon olarak sulu
çözeltilerinde değişen çözünürlükte tuzlar oluşturmaktadır. Çinko azot, sülfür ve
oksijen gibi elektronegatif ligandlar ile nispeten kararlı koordine bağlar yapmaktadır.
Çinko sulu alkali ortamda [Zn(OH)4]-2 gibi zinkatları oluşturmaktadır.
Farklı çinko bileşiklerinin çözünürlükleri birbirinden farklıklılar göstermektedir.
Örneğin çinko klorürün (ZnCl2) 25°C’de sudaki çözünürlüğü 432g/100mL olmasına
rağmen çinko oksidin (ZnO) 29°C’deki çözünürlüğü ise 0,00016 g/100 mL’dir
(Walsh vd., 1994). Çinko doğada asla serbest olarak bulunmaz. Mineral zinkitte ZnO
olarak, hemimorfitte çinko silikat (Zn2SiO4) olarak, simitsonit mineralinde çinko
karbonat (ZnCO3)olarak, fraklinit mineralinde karışık ZnO ve Fe2O3 (demir oksit)
olarak ve sfalerit mineralinde ise çinko sülfür (ZnS) olarak bulunmaktadır.
5
2.1.2. Çinkonun kullanım alanları ve maruziyeti
Çinkonun en önemli uygulaması galvanizasyondur. Çinko kaplama, daha çok çelik
malzemelere uygulanmakta ve çinko ile galvanizlenen malzemenin korozyona karşı
dayanımını ve ömrünü artırmaktadır. Çinkonun diğer kullanımları ise çeşitli
alaşımlar-özellikle pirinç-motor ekipmanları, elektrikli ev aletleri, yapı malzemeleri,
farmasötikler, tıbbi cihazlar, kozmetik, boya pigmentlerinin üretimi, tıpda antisptik
merhem olarak, elektroluminesansın yer aldığı uygulamalarda, fotokonduktivitede ve
diğer elektronik uygulamaları içermektedir.
Çinko metali tüm canlı organizmalar için vazgeçilmezdir. Çinko hücrelerin yapısal
ve fonksiyonel bütünlüğünün sağlanmasında kritik rol oynayan esansiyel bir besindir
(Arcasoy, 2002).
2.1.3. Çinko maruziyeti
İnsan vücuduna çinko girişi teneffüs, deri ve sindirim olmak üzere üç ana yoldan
oluşur. (ATSDR, 2005). Her maruz kalma türü, vücudun belirli bölümlerini
etkilemektedir (Şekil 2.1.).
Şekil 2.1. Çinko zehirlenmesi ile eksikliği arasındaki etkilerin karşılaştırılması. Aşırı çinkoya maruz
kalma veya aşırı çinko alınımı (sol taraf) sonucu oluşan intoksikasyonunun ve yetersiz
beslenme veya tıbbi koşullarla (sağ taraf) bağlı çinko eksikliğinin farklı organ sistemlerinde
meydana getirdiği zararlı etkileri. Belirli bir organ sistemine atfedilemeyen veya birkaç
organın etkilenmesi, sistemik semptomlar olarak sınıflandırılmıştır (Plum vd., 2010).
6
2.1.3.1. Teneffüs yolu ile maruziyet
Çinko içeren dumanın teneffüs edilmesi genellikle galvanizleme gibi endüstriyel
işlemlerden kaynaklanmakta olup başta üretim işçilerini etkilemektedir. Askeri
duman bombaları çinko oksit veya çinko klorür içermektedirler. Homma ve
meslektaşları çinko klorür içeren duman bombasına maruz kalan kişilerin erişkin
solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) geliştiğini rapor etmişlerdir (Homma, 1992).
Çinko içeren dumanın teneffüs edilmesi ile ilgili en yaygın bilinen etki, çoğunlukla
çinko oksitin teneffüs edilmesiyle oluşan metal duman ateşidir (MFF). Bu akut
sendrom, çoğunlukla çinko eritme veya kaynak yapma gibi mesleki durumlarda 1
μm'den küçük partikül boyutu olan taze metal dumanlarının teneffüs edilmesi ile
ortaya çıkan endüstriyel bir hastalıktır (Vogelmeier, 1987). Bu geri dönüşümlü
sendromun belirtileri genellikle akut maruziyetten birkaç saat sonra başlamaktadır ve
ateş, kas ağrısı, mide bulantısı, yorgunluk, göğüs ağrısı, öksürük ve solunum güçlüğü
görülmektedir (Rohrs, 1957). Genelde MFF hayatı tehdit edici değildir ve solunum
etkileri bir ila dört gün içinde kaybolmaktadır (Brown, 1988).
2.1.3.2 Deri yolu ile maruziyet
Çinko dermal yolla absorbe edilebilmektedir, ancak bu konuda yapılan çalışmaların
sayısı sınırlıdır ve mekanizma hala açıklığa kavuşturulamamıştır. Agren ve
arkadaşları cildin pH'sının, uygulanan çinko miktarının ve kimyasal
spesifikasyonunun çinko emilimini etkilediğine dikkat çekmişlerdir (Agren, 1999;
Agren vd., 1991).
Yüzde yirmibeşlik çinko oksit yamasının (2.9 mg / cm2) 48 saat boyunca insan
derisine yerleştirildiği bir çalışmada, dermal tahriş olduğuna dair herhangi bir kanıt
bulunmamaktadır (Agren, 1999). Farelerde, tavşanlarda ve gine domuzlarında farklı
çinko bileşiklerinin dermal etkisini karşılaştıran başka bir çalışmada, çinko klorür’ün
en fazla tahriş edici olduğu ve ardından orta derecede çinko asetat ve çinko sülfata
ise en düşük tahrişe neden olmuştur. Çinko oksit ise herhangi bir tahriş edici etki
göstermemiştir (Landsdown, 1991).
7
2.1.3.3. Oral maruziyet
Çinko, esansiyel bir iz element olarak doğası gereği, düşük miktarlarda çinkonun oral
alımı, hayatta kalmak için şarttır. Çinko için önerilen günlük alım miktarı (RDA)
erkekler için 11 mg/gün ve kadınlar için 8 mg/gün'dür (Trumbo vd., 2001). Daha
düşük ortalama vücut ağırlıkları nedeniyle bebekler için 2-3 mg / gün ve çocuklar
için ise 5-9 mg/gün çinko alımı önerilmektedir (Trumbo vd., 2001). RDA değerleri,
sıçanlarda ve farelerde yapılan eşdeğer çalışmaların karşılaştırılması ile insanlar için
tahmini olarak belirlenen 27 g çinko/gün LD50 değerinin önemli ölçüde altındadır
(ATSDR, 2005). Genel olarak, bu kadar yüksek miktarda Zn alımı pek mümkün
değildir, çünkü yaklaşık 225-400 mg çinko, emetik doz olarak saptanmıştır (Brown
vd., 1964). Oral yolla 28 g çinko sülfat bir kadın hastada alımın hemen ardından
kusma, taşikardi hiperglisemi gelişdiği ve alımdan 5 gün sonra hemorajik pankreatit
ve böbrek yetmezliği nedeniyle de öldüğü rapor edilmiştir (Fox, 1989).
Gastrointestinal sistem, vücutta dağıtılmadan önce doğrudan tüketilen çinkodan
etkilenmektedir. Bu nedenle çinkonun oral alınımı sonrasında çoklu gastrointestinal
semptomlar ortaya çıkabilmektedir. Galvanizlenmiş kaplarda depolanan yiyecek
veya içecek tüketilmesine bağlı olarak yüksek miktarda çinko alınımı. Yutma,
yiyecek veya içeceklerin orta derecede asitli doğasından kaynaklanır ve galvaniz
kaplamadan yeterli miktarda çinko çıkartılabilir. Ortaya çıkan belirtiler mide
bulantısı ve kusma, epigastrik ağrı, abdominal kramplar ve ishali kapsar (Brown vd.,
1964).
2.2. Çinko Biyokimyası
Demir ve bakırdan farklı olarak, çinko redoks nötr bir elementtir ve biyolojik
reaksiyonlarda Lewis asidi olarak reaksiyon verir. Bu özelliğinden dolayı çinko,
yapısal, katalitik ve sinyal bileşenleri olarak anahtar rol üstlenmektedir. Proteinlerin
yapısal bir bileşeni olarak, çinkonun protein/peptitlerle olan ilişkisi, ilk önce çinko ile
insülinin kristallenmesiyle doğrulanmıştır (Scott ve Fisher; 1938). İlk bulunan
"Çinko parmak" motifi, Xenopus'un transkripsiyon faktörü TFIIIA'dır (Miller vd.,
1985). Çinko parmaklar artık 20'den fazla yapısal olarak farklı modül grubuna
ayrılmıştır ve çeşitli proteinler, lipidler ve nükleik asitlerle etkileşen işlevsel bir motif
8
olarak bilinmektedir (Andreini vd,, 2011; Berg ve Shi, 1996; Krishna vd., 2003)
(Çizelge 2.1).
Katalitik fonksiyonlarda, çinko güçlü Lewis asidi özelliğinden dolayı negatif yükleri
stabilize ederek enzimatik katalizde önemli rol oynar (Maret, 2004). Çinkoya bağımlı
bir enzim olarak eritrosit karbonik anhidraz enziminin ilk olarak tanımlanmasından
ardından enzim komisyonunca (EC) belirlenen altı sınıftaki birçok enzimde çinko
varlığı saptanmıştır (Çizelge 2.1).
Proteinlerin içinde, çinko azot, oksijen ve sülfür atomları ile koordine olabilir ve
çinko farklı koordinasyon sayılarına da sahip olabilir (Maret, 2012). Çinko proteomu,
ökaryotlarda proteinlerin % 9'unun çinko proteini olduğunu ve yüksek
organizmalarda bu sayının önemli ölçüde arttığını göstermektedir. İnsanlar tarafından
kodlanan çinko proteinlerin sayısı ~% 10'dur (Andreini vd., 2006).
9
Çizelge 2.1. Çinkonun fonksiyonlarına örnekler
Çinko fonksiyonları Açıklama
Yapısal bileşenler Çinko parmaklar
C2H2-benzeri parmak; klasik çinko parmak motif, transkripsiyonel faktör
TFIIIA, 20–30 amino asit sekansı
Çinko kurdele; bir çok transkripsiyon faktörü, ribozomal proteinler,
RanBP
Sol anahtarı; HALKA parmak domeni, Arf-GAP domeni, LIM domeni,
FYVE domeni, PHD domeni, MYND domeni, nükleer reseptör DNA-
bağlayan domen, GATA, PKC
Çinko kolyeler; transkripsiyonel adaptör proteininde TAZ domeni
CBP/p300
Proteinler arası bağlama mediatörü (örnek, çinko hock motifi)
İnsülin gibi peptidlerin kristalizasyonu
Katalitik faktör Altı ana enzim sınıfında enzim kofaktörleri
Oksidoredüktazlar; alkol dehidrogenaz, sorbitol dehidrogenaz
Transferaz; bu sınıfta çinkonun temel fonksiyonu katalitik özelliği
değildir (sadece %34 katalitiktir)*
Hidrolaz; karboksipeptidazlar, alkalin fosfatazlar, anjiotensin-konverting
enzim
Liyaz; karbonik anhjidraz, δ-aminolevulinik asit dehidrataz
İzomeraz; fosfomannoz izomeraz
Ligaz; bu sınıfta çinkonun temel fonksiyonu katalitik özelliği değildir
(sadece %39 katalitiktir)*
Sinyalizasyon
mediatörü
(Çinko
sinyalizasyonu)
Ekstraselüler çinko sinyalizasyonu
Merkezi sinir sisteminde nöromodülasyon fonksiyonları
Çinko ile aktive olan reseptörler (ZnR/GPR39)
insülin salınımını azaltma ve hepatik insülin temizlenmesini baskılama
İntraselüler çinko sinyalizasyonu
İkincil mesajcı fonksiyonları
Enzim aktivitesinin inhibisyonu (kaspazlar, protein trozin fosfatazlar,
fosfodiesterazlar)
Sinyalizasyon yolunun düzenlenmesi (PKC, ERK, JAK/STAT,
BMP/TGF-β, NF-κB, cAMP-CREB, PI3K/Akt, B-hücre rreseptörü)
Çinko dalgasıı; perinüklear bölgeden sitocole çinko salınımı.
Çinko kıvılcımı; oositlerden çinko atımı. Çinko kıvılcımı yumurta
embriyo dönüşümü için gereklidir
* Yüzdeler bilinen yapıların çinko enzimleri ile ilişkilendirilen EC numaralarını ifade
etmektedir.
10
2.3. Çinko Elementinin Emilimi ve Metabolizması
Zn, duodenumda ve proksimal jejunumda emilir ve apikal membranda ifade edilen
spesifik taşıyıcılar aracılığı ile eritrositlere taşınır (Turnlund vd., 1984). Sitrik asit Zn
emilimini artırmaktadır. Lif, demir ve fitat gibi Zn şelatörleri ise zinko emilimini
inhibe etmektedirler (Kenny vd., 1989; Cousins, 1985). Biyolojik kullanılabilir
fraksiyon, vücut tarafından tutulan ve kullanılan kısmıdır. Çinko miktarı et
bakımından zengin diyetlerde yüksek ve vejetaryen diyetlerde ise fitat içeriğinden
dolayı düşüktür. Sıkı vejetaryen diyetlerinde -diyet içeriğinde bulunan fitatdan
dolayı- % 50’den daha fazla Zn ilavesini gerektirebilmektedir. Emilen Zn, ya portal
sistem vasıtasıyla karaciğere taşınır ya da enterosit içinde intraselüler olarak bulunan
metalotiyoinine (MT) bağlanır. MT'ye bağlı fraksiyon daha sonra enterosit
dökülmesi esnasında barsağa geri döner. Zn, yaklaşık olarak 4 μg/mL
konsantrasyonda safra atılmaktadır (Lech ve sadlik, 2011). Salgılanan Zn'nin bir
kısmı, enterohepatik dolaşıma girerek emilir ve net gastrointestinal (GI) kaybı 2-4
mg/gün’dür. Yetişkinlerde idrar Zn atılımı ise yaklaşık olarak 0,5 mg/gün’dür. Diğer
fizyolojik kayıplar ise cilt ve saçda oluşmaktadır.
Şekil 2.2. Zn homeostazisi. Diyetsel Zn eritrositlere üst kastrointestinal yolda absorblanır. Zn’nin bir
kısmı eritrositlerde şelatlanır ve fizyolojik olarak mukozal dökülme ile gastrointestinal yola
geri döner. Emilen Zn plazma havuzuna geçerek buradan vucut dokularına tekrar dağıtılır.
Zn dengesi başlıca net gastrointestinal emilimin düzenlenmesi yoluyla sürdürülür. Adaptif
mekanizmalar diyetsel Zn’da artış veya azalışa rağmen normal Zn durumunu idame
ettirirler. Zn dağılımı üzerine adaptif ve terapötik etkiler: +, pozitif etki; -, negatif etki
olarak ifade edilmiştir. APR, akut faz cevabı; GI, gastrointestinal; IV, intravenöz; Zn, çinko.
11
2.4. Çinko Hemeostazı
Çinko homeostazı, 11-25 μmol / L (0.7-1.6 mg / L) referans aralığında sabit bir hücre
içi Zn konsantrasyonunu ve plazma konsantrasyonunu sürdürülür. Homeostatik
regülasyon bağırsak emilimi, GI salgılanması, idrar boşaltımı ve hücresel retansiyon
düzeylerinde ortaya çıkar ve regülasyonun en önemli hedef düzeyi net bağırsak
emilimidir. Diyetteki Zn içeriği azaldığında, dışkı kayıpları azalır, emilim verimliliği
hemen hemen% 100'e yükselir. Ayrıca idrar Zn atılımında azalma ve hücresel
retansiyonda artma meydana gelir. Doku Zn miktarı, dolaşımdaki IGF-I'in neden
olduğu büyümede azalma ile korunmaktadır. Bununla birlikte, adaptif mekanizmalar
kayıpları tamamen ortadan kaldıramaz. Dolayısıyla, adaptasyon esnasında dahi Zn
desteği gereklidir. Deplesyon çalışmaları, hemen hemen tamamı yavaşça turnover
havuzundan salınım hız sabitinin azalmasın bağlı olarak plazma Zn'nin % 65
oranında azaldığını göstermiştir. Bu havuz muhtemelen iskelet kasında
bulunmaktadır ve Zn alınımına karşı hassastır.
İnsan vücudu 2-3 g çinko içerir ve yaklaşık olarak çinkonun % 60'ı iskelet kasında,
%30’u kemikte, %5’i karaciğer ve deride geri kalan %2-3’lük kısmı ise diğer
dokularda bulunur (Şekil 2.2.) (Wastney vd., 1986). Çinko içeren diğer organlar
arasında prostat, karaciğer, gastrointestinal sistem, böbrek, cilt, akciğer, beyin, kalp
ve pankreas bulunur (Bentley vd., 1991; He vd., 1991; Llobet vd., 1988). Çinkonun
oral yolla alınımında incebağırsaktan emilir ve albümin, a-mikroglobülin ve
transferin gibi çeşitli proteinlere bağlı olarak serumda dağıtılır (Scott ve Bradwell,
1983).
12
Şekil 2.3. Hücrelerdeki çinko dağılımı şeması. ZnT (yeşil oklar) ve ZIP (kırmızı oklar) taşıyıcıları,
hücresel çinko homeostazını düzenlemek için koordine eder. Toplam hücre çinko
konsantrasyonu 10s-100s μM olarak kabul edilir, ancak sitoplazmadaki hemen hemen tüm
çinko iyonları (Zn2+), bir dizi metaloproteinler ve MT'lere sıkıca bağlanır veya ZnT veya
ZIP yoluyla hücre içi organel/vesiküllere kenetlenir veya serbest bırakılırlar. Bu nedenle,
sitosoldeki labil ("serbest") Zn2+ konsantrasyonu çok düşüktür (pikomolar ve düşük
nanomolar seviyeler arasında değiştiği düşünülmektedir). Bazı hücre altı bölmelerindeki
kararsız Zn2+ konsantrasyonları da gösterilmiştir. Aynı zamanda, ER ve Golgi'deki değerler konusunda mevcut görüş birliği bulunmamaktadır. Labil Zn2+, mitokondride de mevcuttur,
ancak yolu açıklığa kavuşturulmamıştır. Yüksek miktarda labil çinko, bir çok hücrede
sinaptik veziküller ve insülin granülleri gibi özelleşmiş yapılarda birikmektedir. Hücresel
çinko konsantrasyonu, çinko dalgaları ve ani çinko salınımı “çinko kıvılcımları” gibi çeşitli
yollarla dalgalanmaktadır. Sarı halkalar, Zn2 +; pembe halkalar, glutamat (Kambe vd.,
2015).
Aynı taşıyıcı aileleri çinkonun endoplazmik retikulum, mitokondri ve golgi içindeki
dağılımını da düzenler. Buna ek olarak, birçok memeli hücre tipi ayrıca “çinko
vezikülleri” şeklinde adlandırılan membrana-bağlı veziküler yapılar içerir. Bu
veziküller yüksek miktarlarda çinkoyu yakalarlar ve büyüme faktörleri gibi faktörler
ile uyarıldıklarında ise serbest bırakırlar (Haase ve Maret 2003; Taylor vd., 2008)
(Şekil 2.3)
Son olarak, metalotiyoninler (MT), çinko homeostasisinde hücre içi çinkonun hemen
hemen % 20'si ile kompleks oluşturarak belirgin bir rol oynamaktadırlar (Şekil 2.4)
13
(Chimienti vd., 2003; Tapiero ve Tew, 2003). MT, düşük molekül ağırlıklı 6-7 kDa,
yüksek sistein içeriği ve metal iyonlarını kompleksleştirme kabiliyeti ile karakterize
olan ubiquitöz proteinlerdir. Bir MT molekülü yedi çinko iyonuna bağlanabilir.
Metal iyonu bağlama bölgelerinin farklı afiniteleri sayesinde, hücresel çinko
tamponu gibi davranabilir (Krezel ve Maret, 2007). MT ile hücresel çinkonun
dinamik olarak düzenlenmesi, metal transkripsiyon faktör (MTF) -1’in tetiklenmesi
ile artan hücre içi çinko düzeyine cevaben apo-form tiyonin (T) sentezinden
kaynaklanmaktadır (Laity veAndrews 2007). Ayrıca, sistein kalıntılarının
oksidasyonu, redoks ve çinko metabolizmasını birleştiren metal bağlama tiyollerinin
sayısını değiştirebilir. (Maret, 2006).
Şekil 2.4. Hücresel çinko homeostazı ve çinkonun sitotoksisite üzerindeki etkisi. (A) Hücresel çinko
homeostazı, üç ana mekanizma aracılıdır. İlk olarak, Zip ailesinden olan hücre içine alan
taşıyıcılar tarafından plazma membranından geçişinin sağlanması ve ZnT ailesinden olan taşıyıcı proteinler de Zn’yi hücre içinden dışarıya doğru taşınması. İkincisi, metalotiyonin
gibi çinko bağlayıcı proteinlerin bu olayda yer alması. Üçüncü olarak da, endoplazmik
retikulum, Golgi ve lizozomlar dahil olmak üzere hücre içi organellere transporter aracılıklı
çinko tutulum yolunun olması. Çinko homeostazın sıkı kontrolü, hücresel canlılığın
korunması için gereklidir, buna karşın deregülasyon hücre ölümüne yol açmaktadır. (B)
Hücre içi çinko homeostazına diğer bir yol metalotiyonnin/tiyonin sistemidir. Serbest ve
zayıf bağlı çinko iyonları, metalotiyonin (MT) oluşturmak için apo-protein tiyonin (Tred)
ile bağlanır. Yüksek seviyedeki serbest çinko iyonları metal-düzenleyici transkripsiyon
faktörü (MTF) -1’in çinko parmak yapılarına bağlanması tiyonin ekspresyonunu indükler.
Ayrıca, tiyollerin reaktif oksijen (ROS) veya azot (RNS) türleri ile oksidasyonu, çinkonun
eşzamanlı salınımı yoluyla oksitlenmiş protein tiyoninin (Tox) oluşumunu tetikler.
14
2.5. Çinkonun Hücre Ölümündeki Rolü
Çinkonun sistemik toksik etkilerine ek olarak, çinko metali hücresel seviyede
sağkalım ve ölüm mekanizmalarının düzenlenmesinde de yer alır.
2.5.1. Çinkonun apoptozise etkisi
Çinkonun apoptozun düzenlenmesindeki rolü belirsizdir. Çeşitli çalışmalar, çinko
konsantrasyon -bağımlı olarak hem pre-apoptotik hem de anti- apoptotik etki
gösterebilir. Aynı şekilde hem çinko eksikliği ve hem de fazlalığı aynı hücre hattında
apoptozu indükleyebilmektedir (Cummings vd., 2009; Formigari vd., 2007; Haase
vd., 2001; Truong-Tran vd., 2001).
Yüksek hücre içi çinko düzeyleri ile apoptozun indüksiyonu farklı dokularda ve
hücre tiplerinde gösterilmiştir (Truong-Tran vd., 2001; Fraker vd., 1997; Watjen vd.,
2002). Yapılan çalışmalar, gerek ekzojen uygulama sonucu, gerekse hücre içi
depolardan ROS veya nitrosasyon aracılıklı çinko salınımı hücre içi çinko birikimine
yol açarak p38 ve potasyum kanalları gibi pro-apoptotik molekülleri aktive olmasına
sebep olarak hücreyi ölüme getirebilmektedir (Truong-Tran vd., 2001; Kim vd.,
1999; McLaughlin vd., 2001; Wiseman vd., 2006). Artmış intrasellüler çinko
seviyeleri aynı zamanda enerji metabolizmasının inhibisyonuyla da hücre ölümünü
indükleyebilmektedir (Brown vd., 2000; Sheline vd., 2000).
Anti-apoptotik Bcl-2-benzeri ve pro-apoptotik Bax-benzeri mitokondriyal membran
proteinleri çinko toksisitesinden etkilenmektedirler. Apoptozu indükleyen özellikler
bağlamında düşünüldüğünde, çinkonun Bax ekspresyonunu arttırdığını ve bu artışın
da Bcl-2/Bax oranında azalmaya neden olmaktadır. Bu durum sonuçta,
mitokondriyal membran potansiyelinin dağılmasına ve mitokondriden sitozole
sitokrom-c'nin salınmasına yol açarak hücreyi apoptoza götürmektedir (Kim vd.,
1999; Feng vd., 2008; Dineley vd., 2003; Feng vd., 2002; Mills vd., 2002;
Bitanihirwe vd., 2009).
Çinko'nun anti-apoptotik özellikleri muhtemelen iki ana mekanizmadan
oluşmaktadır. Birincisi, çinko, oksidatif stres sırasında oluşan hasarı sınırlar ve
15
böylece apoptoz ile sonuçlanan sinyal yollarını bastırmasıdır. İkincisi ise, çinkonun
doğrudan apoptozu düzenleyen çeşitli proteinleri ve yolları etkilemesidir.
Birinci mekanizma ile tutarlı olarak, çinko eksikliğinin oksidatif stres oluşturduğu
gösterilmiştir (Cui vd., 2000; Cui vd., 1999; Oteiza vd., 2000). Redoks-inert
çinkonun hücreleri oksidatif hasara karşı koruduğu mekanizmalar, proteinlerdeki
sülfhidril gruplarının oksidasyona karşı korunma özelliklerini içermektedir (Williams
vd., 1987). Çinko ayrıca, lipidleri ve proteinleri stabilize ederek, hücresel zarları ve
makromolekülleri oksidatif hasardan korur. Öte yandan, yüksek çinko düzeyleri
oksidatif strese neden olabileceği ve redoks homeostaz üzerindeki etkisi,
kullanılabilirliğine bağlı olarak, koruyucu veya teşvik edici olabilmektedir (Maret
vd., 2006).
İkinci mekanizma ile ilgili olarak çinkonun bazı apoptoz-düzenleyici moleküller ile
etkileşebilmektedir. Çinko, ICso değeri 10 nM'nin altında olan güçlü bir kaspaz-3
inhibitörüdür (Perry vd.,1997; Maret vd., 1999). Ayrıca, düşük çinko
konsantrasyonlarında kaspaz-6, -7 ve -8'in inhibisyonu da gösterilmiştir (Stennicke
vd., 1997).
Çinko eksikliği, ERK ve Akt gibi büyüme faktörü sinyal moleküllerini bozarak
apoptozu indükleyebilmektedir (Clegg vd., 2005). Çinko için diğer moleküler
hedefler, anti-apoptotik Bcl-2-benzeri ve pro-apoptotik Bax-benzeri mitokondriyal
membran proteinleridir. Çinkonun, Bcl-2/Bax oranını arttırdığı ve böylece hücrelerin
apoptosise karşı direncini arttırdığı gösterilmiştir (Fukamachi vd., 1998). Buna
uygun olarak, Zalewski ve meslektaşları tarafından yapılan bir çalışmada hidrojen
peroksit ile premonositik hücrelerde apoptozu indüklemişlerdir. Premonositik
hücrelerine yapılan 1 mM’lık çinko ilavesi, aktif kaspaz-3'ün inhibisyonuna ve Bcl-
2'nin Bax'a oranında artış ile sonuçlanmıştır (Zalewski vd., 1991). Çinko aracılı
apoptoz, N, N, N′, N′-tetrakis (2-pyridylmethyl)-ethyenediamine (TPEN) ilavesi
sonucu oluşan şelasyon sonucu durduğu gösterilmiştir (Zalewski vd., 1993). Fakat
başka bir çalışmada ise çinkonun Bax'ın ekspresyonunu artırabileceği gösterilmiştir,
bu da Bcl-2/Bax oranının azalmasına ve sitokrom c’nin mitokondriden salınmasına
yol açarak apoptozu indükleyebilmektedir (Feng vd., 2008).
16
Çinkonun apoptoz üzerindeki etkisi çok karmaşıktır ve veriler kısmen çelişkilidir.
Diğerleri arasında, bu kompleks ağdaki değişkenler doku ve hücre tipi, çinko
konsantrasyonu, çinko taşıyıcılarının ve çinko bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu,
oksidatif veya nitrosatif stres gibi diğer çevresel koşullar ve zıt fonksiyonlu çoklu
moleküler hedeflerin bu olaylarda yer almasıdır.
2.6. Çinko ve Oksidatif Stres
Oksidatif stres, reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretimi ve antioksidan savunma
sistemi tarafından uzaklaştırılma oranındaki düşüşten dolayı oksidanlar ve
antioksidanlar arasındaki dengesizlik ile karakterizedir. Bu metabolik bozukluk,
biyomoleküllerin oksidasyonuna, hücrelerdeki ve dokulardaki oksidatif hasara,
dolayısıyla da obezite, diyabet ve kanser gibi çeşitli kronik hastalıkların gelişimine
katkıda bulunur (Butterfield vd., 2014; Feng vd., 2013; Pisoschi vd., 2015).
Çinko özellikle 300'den fazla enzim ve 2000 transkripsiyon faktörü için ko-faktör
olarak görev yaptığı için insan sağlığı için gerekli minerallerden biridir. Çinko,
hücresel sinyalizasyon için önemli aracıdır (Roshanravan vd., 2015; Jurowski vd.,
2014). Öncelikle insülin hareketini artırmada önemli rolü vardır. Çinko
antienflamatuvar bir madde olarak hücre zarlarına yapısal kararlılık sağlar ve aynı
zamanda gen ekspresyonunun önemli bir regülatörüdür (Foster vd., 2014; Fung vd.,
2015; Jansen vd., 2012).
Çinko, antioksidan savunma sisteminin düzgün işleyişine katkıda bulunan önemli
enzimler için ko-faktör görevi görür. Buna ek olarak, çinko zarların stabilizasyonunu,
prooksidan enzim olan nikotinamid adenin dinükleotit fosfat-oksidaz enzimini
(NADPH-Oksidaz) inhibisyonunu ve metalotiyonein sentezini başlatarak hücreleri
oksidatif hasara karşı korumaktadır. Metalotiyonin, hidroksil radikallerinin (OH)
azaltılması ve stres koşulları altında üretilen reaktif oksijen türlerinin tutulmasında
yer alır (Ruz vd., 2013; Chasapis vd., 2012).
Çinkonun antioksidan savunma sistemindeki rolü araştırılmaktadır. Yapılan
çalışmalarda, çinkonun glutatyon peroksidazının düzenlenmesindeki ve metalotiyoin
17
sentezindeki rolünün yanı sıra süperoksit dismutaz için de kofaktör rolü olduğu
vurgulanmaktadır. Ayrıca, çinko hücre zarında demir ve bakır ile yarışarak NADPH-
oksidaz enziminin inhibe olmasına ve dolayısıyla da kronik enflamasyonu ve
hiperglisemiyi azaltıcı yönde etki göstermektedir (Cruz vd., 2015; Lima vd., 2011).
Çinko, hücrelerin sitoplazmasında bulunan süperoksit dismutaz enziminin yapısal bir
bileşenidir. Süperoksit dismutaz, bakır ve çinko iyonunun birlikte bulunduğu aktif
merkeze sahiptir. Bu enzim, iki süperoksit radikalinin hidrojen peroksit ve moleküler
oksijene dönüşümünü katalizlemekte ve oldukça reaktif türün daha az zararlı türe
dönüşümünü sağlaması yoluyla ROS'un toksisitesini düşürmektedir (Cruz vd., 2011).
Bu nedenle, hücre içi kompartımanlarında yeterli konsantrasyonda çinkonun
sağlanması ve devam ettirilmesi antioksidan savunma sisteminin düzgün bir şekilde
çalışması için gereklidir. Homma vd, (2013) yaptıkları çalışmada çinko eksikliğinin
süperoksit dismutaz enziminin mutant benzeri bir konformasyona dönüşümüne yol
açarak kronik endoplazmik retikulum stresini indüklediğini bulmuşlardır. Sonuç
olarak, endoplazmik retikulum stresindeki artış protein sentezini inhibe etmekte olup
özelikle çinko taşıyıcı Zip-14'ün indüksiyonu ile sonuçlanmaktadır.
Çinkonun bir antioksidan olarak işlev görmesini sağlayan bir başka mekanizma,
glutatyonun de novo sentezinin hız sınırlayıcı enzim olan glutamat-sistein ligazın
ekspresyonunu etkilemesidir. Bu durum dikkate alındığında, serbest radikallerin
direk olarak glutatiyon veya dolaylı olarak glutatiyon peroksidaz kofaktörü yoluyla
nötralize edilmesinde çinkonun etkisi yadsınamaz durum ortaya koymaktadır (Eide,
2011). Ha ve arkadaşları. (2006) kültüre edilmiş insan retinal pigment epitelyal hücre
hattı ARPE-19 hücrelerine 100-150 mM konsantrasyonunda çinkonun ilave edilmesi,
bir nükleer faktör eritroid 2 (NFE2)-ilişkili faktör 2 (Nrf2)-bağımlı metabolik yolu
vasıtasıyla glutamat-sistein ligaz mRNA seviyelerini upregüle olduğunu
bulmuşlardır. Bu yolla, çinko toplam hücre glutatyon konsantrasyonunu düzenleyici
role sahiptir (Foster vd., 2010).
Çinko güçlü bir metalotiyoin indükleyicisidir. Çinko, normal fizyolojik koşullar
altında metalotiyoinine bağlanır. Oksidatif stres altında, çinko metalotiyonin
kompleksinden salınarak hücrelerde yeniden dağıtılır (Maret vd., 2007; Özçelik vd.,
18
2012). Liang et al. (2015) çinko takviyesi alan sıçanların (günde 5 mg/kg vücut
ağırlığı) karaciğerlerinde metalotiyonin ekspresyonunda artış olduğunu
gözlemlemişlerdir. Karaciğerde metalotiyonin artışı ise metalotiyonin aracılıklı
antioksidan ve antienflamatuar olaylara katkı sağlamaktadır.
Metalotiyonin'in, çinko, bakır, krom, kadmiyum, cıva gibi ağır metal iyonlarını etkili
bir şekilde tutma kabiliyetine sahiptir (Coyle vd., 2002; Günther vd., 2012a; Günther
vd., 2012b). Bu nedenle, bu enzim aşırı miktarda metal iyonuna karşı hücre
korumasında önemli bir rol oynar ve böylece toksik ağır metallere karşı
detoksifikasyonun ana sistemi olarak işlev görerek oksidatif strese karşı etkin rol
oynamaktadır (Andrews vd., 2000).
Metal-düzenleyici transkripsiyon faktör-1 (MTF-1) aynı zamanda metal
homeostazına ve oksidatif strese verilen hücresel yanıtların koordinasyonunda
önemli bir role sahiptir. MTF-1, çinko konsantrasyonu arttığında metalotiyonin ve
çinko taşıyıcı-1 (ZnT-1) genlerinin sentezlenmesini uyaran çinkoya bağımlı bir
transkripsiyon faktörüdür. ZnT-1, hücresel membranlarda bulunur ve hücreden fazla
çinkonun çıkışına sağlar. ZnT-1’in bu fonksiyonu sayesinde, sitozoldeki çinko
toksisitesi azaltır. Ayrıca, metalotiyonin de sitoplazmadaki fazla çinko iyonlarını
bağlayabilmektedir. Bu nedenle metalotiyonin ve ZnT-1 ekspresyonunun
indüksiyonu artmış çinko seviyelerine karşı etkili olan bir mekanizmadır (Günther
vd., 2012b; Andrews vd., 2000; Secler vd., 2007).
MTF-1, redoks hücre durumundaki dalgalanmalara karşı hassasiyetinden ve
stimülasyondan sonra hedef genlerin ekspresyonunu artırarak oksidatif stresten
hücreleri koruyabmektedir. MTF-1 serbest radikalleri temizleyen bir antioksidan olan
glutatiyon bağlayıcı proteini kodlayan Selenoprotein 1'in (Sepw1) ekspresyonunu
aktive etmektedir (Bonaventura vd., 2015). MTF-1 aynı zamanda, inflamatuvar
sitokinleri kodlayan genlerin ekspresyonunu aktive ederek veya baskılayarak immün
yanıtı düzenler (Grzywacz vd., 2015).
Çinko hücre zarında bulunan bağlanma bölgelerine bağlanmada demir ve bakır ile
yarışmalı olarak bağlanmaktadır. Demir ve bakır iyonları, lipit peroksitlerden radikal
üretimini katalizleyebilmektedir. Katalitik olarak oldukça aktif olan demir ve bakırın
19
katalitik olarak inaktif olan çinko ile yer değiştirebilmesi, oldukça reaktif radikallerin
oluşumunu bu yolla önleyebilmektedir (Cruz vd., 2015;Oteiza vd., 2012).
Kronik düşük dereceli inflamasyon ile oksidatif stres arasında yakın bir ilişki vardır.
Nükleer faktör κB (NF-κB) ve aktivatör protein-1 (AP-1) de dahil olmak üzere çeşitli
pro-inflamatuar transkripsiyon faktörleri, inflamatuar sitokinlerin salınmasına neden
olan ROS üretimini indükleyebilirler. Bu durum oksidatif stresin artışına yol
açabilmektedir (Bryan vd., 2013). Çinkonun anti-inflamatuar bir besin olarak
oksidatif stresi azaltması önemli olsa da mekanizması tam olarak açıklığa
kavuşturulamamıştır. Çalışmalar, çinkonun NF-κB transkripsiyonunu anti-
enflamatuar protein A20 ve peroksizom proliferatör ile aktive edilen reseptör
(PPAR-α) ile aktive olan reseptör sinyal yolağı yoluyla düzenlediğini göstermektedir
(Prasad vd., 2011).
Prasad ve ark. Tarafından yürütülen hücre kültürü çalışmasında (Prasad vd., 2011),
yüksek çinko konsantrasyonuna sahip olan hücrelerin A20 proteininin artmış
ekspresyonunun yanı sıra IκB kinazı (IKK-α) / NF-κß sinyalizasyonunda ve pro-
inflamatuar sitokinlerin aktivasyonunda azalma olduğunu göstermişlerdir. Bao ve
ark. (2010), çinko desteğinin, interlökin 6 (IL-6), TNF-a, monosit kemoatraktan
protein-1 (MCP-1), C-reaktif protein (CRP), hücreler arası adezyon molekülü 1
(ICAM-1) ve E- selektin gibi inflamatuar molekülleri azalttığı, PPAR-α ve A20’nin
ekspresyonunu ise artırttığını belirlemişlerdir.
Çinko eksikliğinin oksidatif hasara ve dolayısıyla endotel disfonksiyonuna neden
olduğu bilinmektedir. Endotel hücrelerindeki çinko eksikliği, muhtemelen artmış
hücresel oksidatif stres ile ilişkili mekanizmalar yoluyla sitokinler ve lipidlerin
aracılık ettiği inflamatuvar cevabı tetiklemektedir. Buna karşın, çinko takviyesi,
vasküler sistemin hasar görmesine karşı koruyucu bir rol oynar. Çinkonun kan
damarlarını koruduğu mekanizmaların en başında, antioksidan enzimleri şifreleyen
genlerin sentezlenmesi ve metalotiyoninin ekspresonu ve indüksiyonu için önemli
olan önemli olan transkripsiyon faktörü eritroid-2 ile ilişkili faktör-2’nin (Nrf2)
düzenlenmesi gelmektedir (Biagiotti vd., 2016; Jenner vd., 2007; Miao vd., 2013).
20
Çalışmalar aynı zamanda çinkonun, hücre dışı ortamdan sitozole kalsiyum taşınımını
sağlayan N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörlerinin inhibisyonunda rol oynadığını
göstermiştir. Çinkonun bu fonksiyonu göz önüne alındığında, çinko eksikliği
durumunda NMDA reseptörlerinin aktivasyonununda ve dolayısı ile de hücre içi
kalsiyum konsantrasyonun artış meydana gelmektedir (Weglicki vd., 2011). Hücre
içi kalsiyum konsantrasyonundaki artış, nöronal hücrelerden substant P’nin
salınımına yol açar. Nöronlardan salınan substant P mediyatörü lökositleri ve
makrofajları aktive ederek oksidatif stresin oluşumuna katkı sağlayan inflamatuar
sitokinlerin salınmasına ve serbest radikallerin üretilmesine yol açmaktadır
(Weglicki vd., 2011). Ayrıca çinko eksikliği durumunda, NADPH oksidaz ve nitrik
oksit sentaz aktive edilerek reaktif oksijen ve azot türlerinin üretimine katkı
sağlanmaktadır (Oteiza vd., 2012), (Şekil 2.5).
Çinko aynı zamanda hiperglisemik koşullar altında ROS sentezini azaltmaya,
dolayısıyla oksidatif stres yollarının aktivasyonunu inhibe etmeye katkıda bulunarak
insülin duyarlılığını ve glisemik kontrolü artırmaktadır (Lima vd., 2011). Çinko
glikozun hücre içerisine alınımında rol oynayan pankreasın beta hücrelerinden
insülin salınımının uyarılmasına, insülin reseptörünün β alt biriminin
fosforilasyonuna ve fosfatidilinositol protein 3-kinaz ve protein kinaz B veya Akt'in
aktivasyonuna yol açarak glikozun hücre içersine taşınmasınına katkı sağlamaktadır
(Ranasinghe vd., 2015; Vardatsikos vd., 2013).
Çinko taşıyıcı proteinlerin hücresel oksidatif stres üzerindeki etkisine bakan son
araştırmalar, bu taşıyıcı proteinlerin hücresel hasarın hafifletilmesinde koordineli
hareket ettiklerini göstermiştir. Liang ve ark. (2013) çinko taşıyıcısı ZnT-7'nin
oksidatif stres koşulları altında osteoblastik hücre hattı MC3T3-E'nin hayatta
kalmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Bu araştırmacılar aynı zamanda
hidrojen peroksidin hücre içi çinkonun artışını indükleyebildiğini bulmuşlardır. ZnT-
7, serbest çinko iyonlarının toplanmasını azaltması ve hidrojen peroksit-indüksiyonlu
apoptozu engellemesinden dolayı hücreleri koruyabilmektedir. ZnT-7'nin bu işlevi,
tirozin kinaz proteinlerinin aktivasyonuna bağlanmaktadır. Tirozin kinaz proteinleri
aktive edildiklerinde pro-apoptotik proteinlerin fosforilasyonu yoluyla apoptosisi
inhibe ederler.
21
Oksidatif stres, çinko taşıyıcı proteinlerin ekspresyonunu değiştirebilmektedir. Sun
ve ark. (2014), kronik alkol maruziyetinin, hepatositlerde Zip-5 ve Zip-14 çinko
taşıyıcılarının ifadesini azalttığını göstermişlerdir. Kronik etanol maruziyetinin yine
hepatositlerde Zip-7 ve ZnT-7 çinko taşıyıcılarının ekspresyonunu arttırdığı ve aynı
şekilde hepatositlerin in vitro hidrojen peroksit ile muamelesinde de protein
ekspresyonunda artış olduğu gözlemlenmiştir (Sun vd., 2014). Karaciğer çinko
taşıyıcılarının etanol maruziyeti ile değişebilen ekspresyonu, karaciğerdeki çinko
homeostazını bozabilmektedir. Zip-5 ve Zip-14 hepatositlerin plazma zarında
bulunurlar ve bu nedenle, bu transporterlerin etanol maruziyeti ile azaltılmış
ekspresyonu, karaciğerdeki çinko seviyelerinin azalmasına neden olabilmektedir.
Zip-7 ve ZnT-7 endoplazmik retikulum ve Golgi aparatı gibi organellerin üzerinde
bulunurlar. Dolayısıyla, bu çinko taşıyıcılarının değişmiş ekspresyonu, organellerde
çinko homeostazı ile etkileşime girmekle kalmaz aynı zamanda organel
fonksiyonlarında bozukluğa da neden olabilirler (Sun vd., 2014; Aydemir vd., 2012;
Kirschke vd., 2003; Taylor vd., 2004).
Kronik etanol tüketiminde izole karaciğer hücrelerinin endoplazmik retikulum ve
mitokondrideki çinko seviyeleri önemli ölçüde azalmaktadır. Bu durumda, çinko
takviyesi ile yapılan muamele, çinkoyu mitokondri ve endoplasmik retikülumdan
sitozole taşıyan Zip-8 ve Zip-13'ün ekspresyonunda artışa yol açar. Çinko takviyesi,
çinkoyu sitozoldan mitokondriaya nakleden ZnT-4 ifadesini de arttırmaktadır (Sun
vd., 2015). Bu organellerdeki çinko eksikliği ökaryotik başlatam faktörü 4'ün (eIF4)
fosforilasyonu, C/EBP'nin artmış ekspresyonu, sitokrom c'nin salınması ve kaspaz-3
ve apoptosisin müteakip aktivasyonu ile hücre ölümünü aktive eden Bcl-2 ailesinin
bir proteini olan Bax’ın aklenmesinin dahil olduğu oksidatif stres yollarıyla ilişkili
gibi görünmektedir (Sun vd., 2015).
22
Şekil 2.5. Çinkonun antioksidan mekanizmalardaki rolü. GPx: Glutatyon peroksidaz; MT:
Metalotiyonin; MTF-1: Metal-düzenleyici transkripsiyon faktör-1; NADPH:
Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat; NMDAR: N-metil-D-aspartat reseptör; SOD:
Süperoksit dismutaz; Zn: Çinko (Marreiro vd., 2017).
Çinko, metalotiyonin'in güçlü bir uyarıcısıdır ve metalotiyonine bağlanır. Çinko,
oksidatif stres altında metalotiyonin kompleksinden salınır. Çinko-bağımlı
transkripsiyon faktörü olan MTF-1, hücreleri oksidatif strese karşı koruyabilen
metalotiyoninin gen ifadesini aktive eder. Çinko, süperoksit dismutaz enziminin
yapısal bir bileşenidir ve bu metaloenzim iki süperoksit radikalinin hidrojen peroksit
ve moleküler oksijene dönüşmesini katalizler. Çinko, glutatyonun sentezinde rol alan
ve serbest radikallerin nötralleştirilmesine doğrudan katkı sağlayan glutamat-sistein
ligazın ifadesini etkiler. Çinko ayrıca hücre dışı ortamdan kalsiyumun sitozole
girişini sağlayan NMDA reseptörlerini inhibe eder. Böylece, çinko eksikliği NMDA
reseptörlerinin aktivasyonuna yol açar ve bu da hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu
arttırır. Çinko eksikliğinde, NADPH oksidaz enzimleri ve nitrik oksit sentaz
aktifleşerek oksijen ve reaktif azot türlerinin üretilmesine katkıda bulunurlar
(Marreiro vd., 2017).
Öte yandan çinko konsantrasyonu düşük veya yüksek olduğunda ise pro-oksidan
görevi görür ve pro-inflamatuar ve pro-apoptotik roller üstlenir. Çinko fazlalığı
ayrıca bakır eksikliğine yol açarak bakır eksikliği ile ilişkili birçok yan etkilere sebep
olabilmektedir. Bu yan etkiler, anti oksidan savunmada önemli olan süperoksit
dismutaz ve seruloplasmin gibi bakır bağımlı enzimlerin azalmış ekspresyonunu
23
içermektedir (Maret, 2013; Maret vd., 2006). Dahası, çinko iyonlarının
metalotiyoinine bağlanma yeteneği sınırlıdır. Bu durumda oksidatif stres yüksek
serbest çinko konsantrasyonlarına neden olur ve pro-oksidatif durum oluşturur.
Düşük çinko konsantrasyonu oksidatif strese neden olarak hücre ölümüne sebebiyet
verir ve ayrıca ROS üretimini de tetikler (Cleg vd., 2005; Maret, 2008 ).
2.6.1. Çinkonun oksidatif stress ile ilişkili kronik hastalıklardaki rolü
Araştırmalar, artmış oksidatif stres ile ilişkili olan hastalıklar gibi patofizyolojik
koşullar altında çinko durumunun değişebileceğini göstermiştir. Özellikle, obez
bireyler ortaya çıkan çinko eksikliğinin oksidatif stresi artırdığı ortaya koyulmuştur
(Martins vd., 2014; Sulibuska vd., 2014). Habib ve ark. tarafından yürütülen bir
çalışma. (Habib vd., 2015), obez bireyler kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, obez
grubunda lipid peroksidasyonunun bir belirteci olan malondialdehiti kontrol grubuna
göre yüksek bulmuşlardır. Bununla bağlantılı olarak, araştırmalar, düşük seviyedeki
glutatyonun ve süperoksit dismutaz aktivitesindeki azalışı, çalışılan hastalarda
gözlenen çinko eksikliklerine bağlı olabileceğine işaret etmektedir.
Tip 2 diabetes mellitus'taki kronik hiperglisemi, tip 2 diyabetli hastalarda antioksidan
savunmayı zayıflatan lipid peroksidasyonu ve hücrelerdeki oksidatif hasar ile
ilişkilendirilmiştir. Lima ve diğ. (Lima vd., 2011), tip 2 diyabetli hastaların
plazmasında çinko konsantrasyonlarında azalma olduğunu göstermişlerdir.
Muhtemelen, hiperglisemi ve poliüri sonucu çinkonun idrarla yüksek oranda
kaybedilmesinden kaynaklanabilmektedir. Bu araştırmacılar ayrıca, tip 2 diyabetik
hastalarda uygun çinko durumu ve yüksek süperoksit dismutaz aktivitesi ile ilişkili
oksidatif strese karşı cevabın arttığını göstermişlerdir. Serum insülin
konsantrasyonları çinko ve süperoksit dismutaz aktivitesi etkileyebilmektedir.
Çinko eksikliği, gıda alımı ve bağırsaklardaki emiliminin azalması, kalsiyum ve
demir ile etkileşim ve diyaliz sırasında mineral kaybının artması ile ortaya çıkan
kronik böbrek hastalığında da görülebilmektedir. Bu hastalıkta, çinko albumin gibi
üremi ile modifiye edilmiş proteinlere bağlanarak eksikliği daha da artabilmektedir
(Tonelli vd., 2009; Magalhães vd., 2011). Magalhães ve ark. Tarafından yürütülen
bir çalışmada (Magalhães vd., 2011) süperoksit dismutaz enzimi aktivitesinde azalma
24
ve antioksidan savunmada bozulma ile korelasyon gösteren kronik böbrek
hastalarında çinko konsantrasyonlarının azaldığını da göstermişlerdir.
Guo ve Wang (2013) tarafından yapılan çalışmada günde 11 mg çinko takviyesi, bu
mineralin plazma konsantrasyonunu artırabilmede yeterli olduğunu ve kronik böbrek
yetmezliği için hemodiyalize giren hastalarda bakır konsantrasyonunu da
düşürebildiğini ifade etmişlerdir. Çinko takviyesi aynı zamanda kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında bir oksidatif ürün olan malondialdehitin plazma
konsantrasyonunu düşürmekte ve süperoksit dismutaz aktivitesini ise artırmaktadır.
Ekstraselüler çinko konsantrasyonlarının düzenlenmesi, sinir ağının homeostazını
korumak için son derece önemlidir, çünkü bu mineral beyin fizyolojisinde ve
patofizyolojisinde rol oynamaktadır (Sensi vd., 2011). Sinapslarda, çinko havuzu
presinaptik veziküllerde oluşur; burada serbest çinko nöral aktivite sırasında glutamat
ile birlikte serbest bırakılır ve sinaptik yarıktaki NMDA reseptörlerini bastırmaya
çalışır (Vergnano vd., 2014). NMDA reseptörlerinin inhibisyonu, nöronal hücreler
tarafından substant P’nin serbest bırakılmasını azaltarak organizmayı oksidatif strese
karşı korur (Oliveira vd., 2015).
Ayrıca, çinko homeostazı ile bağlantılı antioksidanlar ve anti-kanserojen
mekanizmalar, neoplastik hücrelerin büyümesinde önleyici rol oynamaktadır. Çinko,
genetik kararsızlık ve genetik mutasyonlara karşı koruma sağlar. Bu anlamda,
süperoksit dismutaz antikanserojenik bir enzimdir. Meme kanseri oluşumunda
başlatma, ilerletme ve ilerleme evrelerini inhibe eder (Prabasheela vd., 2011).
Diyetteki çinko eksikliği meme kanseri riskinde artış ile bağlantılıdır (Chasapis vd.,
2012; Bostancı vd., 2015). Çinko eksikliğinden kaynaklanan oksidatif stres, bu
bölgedeki meme bezi dokusunda değişikliklere ve makrofaj infiltrasyonuna yol
açarak toksik bir mikro çevreye yol açar. Bu mekanizmalar, mineral
hiperakümülasyonuna yol açar ve bu hiperakümülasyon ise östrojen reseptörü-
alfa’nın (ERα) ekspresyonunda artış, organizasyonda duktal değişiklikler ve meme
bezinde fibrozis artışı ile ilişkilidir (Bostancı vd., 2015).
25
Metalotiyonin sentezinin, kemoterapiye direnç ve kötü prognoz gösteren meme
kanserinde bozulduğu dikkat çekicidir. Metalotiyonin, kemoterapi ve radyasyona
dirençli tümör hücrelerinin gelişimini promote eden mekanizmalar yoluyla
karsinogeneze katılır. Kanser hücrelerinde yüksek metalothionein seviyeleri, serbest
radikalleri inhibe ederek, apoptozu ve hücre proliferasyonunu arttırarak hasara karşı
koruma sağlar. Metalotiyonin ile çinko iyonları arasındaki etkileşim, karsinogenezise
katkıda bulunan çeşitli transkripsiyon faktörlerinin düzenlenmesinde rol
oynamaktadır (Alam vd., 2012).
Epilepsi, şizofreni, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları gibi hastalıklarda çinkonun
zararlı etkileri de gözlemlenebilmektedir. Bu koşullarda, çinko, presinaptik nöronlar
ve astrositler tarafından aşırı miktarda salınımı, mikrogliaların aktivasyonua,
nöronlarda NADPH oksidaz ve ROS üretimine yol açarak nöronal ölüme sebebiyet
verebilmektedir (Kim vd., 2002; Higashi vd., 2011; Furuta vd., 2016). Ayrıca çinko,
hipoksi veya iskemi ile indüklenen beyin hücrelerinin apoptozuna da neden olur
(Wang vd., 2015). Hücre kültürü ve deney hayvanı çalışmalarında N, N, N’, N’-
Tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamin (TPEN) olarak adlandırılan çinko şelatörü
uygulamalarında, nörolojik tutulumu azalttığı, serebral infarktüs alanını ve nöronal
apoptoz oranını azalttığı, süperoksit dismutaz aktivitesinde artma ve plazma
malondialdehit ve interlökin-6 (IL-6) seviyelerinde azalma gösterilmiştir. Sonuç
olarak, çinkonun, apoptozun önlenmesinde, başlıca oksidatif stres ve inflamatuar
yolaklar yoluyla rol oynamaktadır (Marreiro vd., 2017).
2.7. Eritrositler ve Redoks Düzenlemesi
Eritrositlerin başlıca işlevi oksijeni akciğerlerden dokulara taşımaktır. Dokulara
taşınan oksijen buradan hücre içerisindeki mitokondrilere geçerek elektron alıcısı
olarak ATP sentezinde kullanılmaktadır. Buna ek olarak, eritrositler dokulardaki
katabolik süreçlerin sonucunda üretilen karbondioksiti (CO2) bağlayarak
akciğerlerden atılmak üzere akciğerlere taşımaktadır. CO2, Hb zincirlerinin amino
gruplarının reaksiyonu ile karbaminohemoglobin oluşumu yoluyla eritrositlerdeki Hb
tarafından taşınabilmektedir. Fakat dolaşımdaki CO2'nin büyük bir kısmı, eritrosit
içersine difüze olarak H2O ile karbonik anhidraz enzimi katalizörlüğünde karbonik
26
asit (H2CO3) oluşturmakta ve oluşan karbonik asit ise bikarbonat iyonlarına (HCO3-)
dönüştürülerek plazmada taşınmaktadır. Akciğerlerde ise tekrar oluşan H2CO3,
karbonik anhidraz enzimi ile deprotonize edilerek alveollerden atılır. Bu işlevler
birbirine yakından bağlantılıdır ve Hb'nin demirli heme (Fe2+) grubuna O2 bağlanma
afinitesi, oksijen kısmi basıncı (pO2), asit/baz dengesini (pH) ve 2,3-difosfogliserat
seviyeleri ile düzenlenir. CO2 taşınımı, karbonik anhidrazın aktivitesine bağlıdır ve
doğrudan eritrositlerin pH’sı ve tamponlama kapasitesinin kontrolü ile ilgilidir.
Hb'nin prostetik grubunda bulunan ferröz heme (Fe2+) demiri, methemoglobin
(metHb) oluşturmak üzere ferrik (Fe3+) heme oksitlendiğinde, hemoglobinin oksijene
olan afinitesi önemli ölçüde azalır. Hb’nin fonksiyonelliğini sürdürebilmesi için
indirgenmiş durumda tutulması gerekir. Bu durumun sağlanmasında üç temel zorluk
şu şekildedir: İlk olarak, eritrositler sayısız oksidan kaynağa (Hb'ye bağlı yüksek
moleküler O2 seviyeleri dahil) maruz kalmaları ve içermeleri (Johnson vd., 2005);
İkinci olarak, eritrositler, Hb'nin (Johnson vd., 2005) prostetik grubunda yüksek
seviyelerde demir taşımaları; demir serbest çözünebilir formunda, Fenton reaksiyonu
ile güçlü bir ROS üretimi katalizörüdür; ve üçüncü olarak, eritrositlerin, eritropoetik
olgunlaşma sırasında protein ekspresyonu kaybı nedeniyle hasar gören elementlerin
yenilenmesinde sınırlı kapasiteye sahip olmasıdır (Şekil 2.6).
27
Şekil 2.6. RBC'lerde redoks regülasyonu. ROS'un sürekli oluşumu, oksiHb'nin metHb'ye heme oksidasyonu ve süperoksit anyonların salınması (Hb'nin otoksidasyonu) ile
gösterilmektedir. SOD1 enzimi süperoksit anyonlarını hidrojen peroksite
dönüştürmektedir. RBC'de, GPx ve Prx2 yolakları, glikoz alımıyla sentezlenen
NADPH'ye bağlı olarak, üç ana detoksifikasyon yolu mevcuttur. Glikoz, Glut-1 taşıyıcısı
ile hüçre içersine alınarak glikolitik yola girer. Glikolitik yolda oluşan glikoz-6-fosfat
metabolik ihtiyaca göre kısmen pentoz fosfat yoluna yönlendirilir ve okside NADP+
indirgenmiş NADPH’ya dönüştürülür. NADPH/glutatyon (GSH) bağımlı yol: NADPH,
okside ve dimer haldeki GSH'yi (GSSG) indirgen formdaki GSH'ye geri dönüşümünü
sağlayan glutatyon redüktaz (GSH redüktaz) enziminin substratı olarak gereklidir. GSH
iki enzim tarafından kullanılır: Birincisi, hidrojen peroksitin doğrudan parçalanması
sağlayan GPx enziminde; ikinci kullanıldığı enzim ise GPx enzimidir ve bu enzim plazma
membran redoks sistemi ve difüze olan ROS etkisi ile oluşan ASC’nin DHA’ya rejenerasyonunda görev yapar. NADPH/Trx-bağımlı yol: NADPH, kofaktör Trx'i
indirgenmiş durumda [Trx (SH) 2] tutan Trx redüktazın substratı olarak da gereklidir.
Trx(SH)2 disülfid köprüleri (TrxS2) oluşturma esnasında okside olan aktif merkez
içersinde membran-ilişkili Prx2 ve tiyollere elektron verici sistem olarak görev yapar.
NADPH'dan bağımsız yol: 3. Yol ile hidrojen peroksitin parçalanması NADPH'den
bağımsızdır ve hidrojen peroksitin parçalanması katalaz enzimi tarafından gerçekleştirilir.
ASC, askorbik asit; CAT, katalaz; DHA, dehidroaskopik asit; GPx, glutatyon peroksidaz;
GRx, glutaredoksin; GSSG, glutatyon disülfid; metHb, methemoglobin; NADPH,
nikotinamid adenin dinükleotid fosfat; Prx2, peroksiredoksin 2; ROS, reaktif oksijen
türleri; Trx, tiyoredoksin (Kuhn vd., 2017).
2.7.1. Eritrositlerde oksidan kaynaklar
Her 24 saatte bir, Hb'nin % 3'ü otomatik otooksidasyona uğrayarak metHb ve
süperoksit radikal anyonu üretir (Denk. 2.1) (Eder vd., 1949). Bu nedenle,
eritrositlerde (10 mM heme karşılık gelen) Hb'nin bolluğunu göz önüne alındığında,
hemoglobin otoksidasyonu reaksiyonu eritrositlerde başlıca ROS kaynağıdır.
HbFe2+ + O2 → HbFe3+ + O2∙ − (2.1)
28
Fakat, Hb'nin sadece % 1'i metHb (Fe3+) durumundadır. Hb-Fe3+, elektron donörü
olarak NADH’ı kullanan sitokrom b5 redüktaz tarafından katalize edilen reaksiyonla
Hb-Fe2+'ye geri indirgenebilmektedir. Sitokrom b5 redüktaz geni mutasyonu,
çocukluk çağında nöron miyelinasyonunun bozulması nedeniyle siyanoz ve ciddi
nörolojik problemlere neden olabilmektedir.
Bir başka oksidan kaynağı, serbest demir (Fe3+) olup metHb'den ayrılabilmektedir
(Bunn vd., 1968). Serbest demir varlığında hidroksil radikalleri üretimine yol açan
Fenton reaksiyonunu da içeren (Denklem 2.3) Haber-Weiss (Denklem 2.2 ve 2.3)
reaksiyonu vuku bulmaktadır.
Fe3+ + O2∙ − → Fe2+ + O2
(2.2)
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + ∙OH + OH− (2.3)
Eritrositlerde ferritin bulunması serbest demirin temizlenmesine ve dolayısıyla
eritrositlerde Haber-Weiss reaksiyonunun oluşumunun sınırlamasına katkı
sağlamaktadır.
Bir diğer önemli oksidatif yol ise H2O2 ile hem demir hem de ferrik Hb arasındaki
reaksiyondur ve heme bozunması ve serbest demirin serbest bırakılmasıyla
sonuçlanmaktadır (Alayash vd., 2001). Bu reaksiyonlar, H2O2 ile ya oksiHb ya da
metHb arasındaki reaksiyondan ikincil radikallerin yanı sıra potent oksitleyici
ferrilHb türünün oluşmasına neden olur. Bu yolun hemolitik yaralanmaya aracılık
etmede önemli olduğu da öne sürülmüştür (Brownlee vd., 1977). Otooksidasyon ile
birlikte, bir başka önemli oksidatif yol, H2O2 ile hem demir hem de ferrik Hb
arasındaki reaksiyondur ve heme bozunması ve serbest demirin (Alayash vd., 2001)
serbest bırakılması ile sonuçlanmaktadır.
Hb − Fe2+ + H2O2 → Hb − Fe4+ = O2− + H2O (2.4)
Hb − Fe3+ + H2O2 → Hb∙ + − Fe4+ = O2− + H2O (2.5)
Hb − Fe4+ = O2− + H2O2 → Hb – Fe3+ + O2 ∙ − + H2O (2.6)
Hb − Fe3+ + O2 ∙ −→ heme yıkım ürünleri + Fe3+ (2.7)
29
Eritrositlerin ölçülebilir seviyelerde NO ürettiği düşünülmektedir. Bu nedenle, NO ve
O2•− arasındaki reaksiyon için hemen hemen difüzyon-sınırlı hız sabitini dikkate
alarak, en azından Denk. 2.8’e göre peroksinitritin oluşabileceği makul olarak
görülebilmektedir.
NO + O2 ∙ − → ONOO− (2.8)
Prx ve GPx de dahil olmak üzere eritrositlerde bol miktarda bulunan antioksidan
sistemlerin yanı sıra metHb'nin de güçlü peroksinitrit süpürücüleridir.
2.7.2. Eritrositlerdeki antioksidan sistemler
Eritrositlerin antioksidan sistemleri hem enzimatik hem de enzimatik olmayan
mekanizmalara dayanmaktadır. Eritrositler, askorbik asit (vitamin C), α-tokoferol
(vitamin E) ve glutatyon (GSH) gibi antioksidan molekülleri (I), NADH ve NADPH
gibi indirgenmiş ekivalent kaynakları (II) ve SOD1, Kedi, GPx ve tiyoredoksin (Trx)
sistemi de dahil olmak üzere antioksidan enzimler (III) ihtiva etmektedirler.
Eritrositlerdeki antioksidan sistemler, oksidan seviyelerini (O2 •, H2O2 ve diğer
reaktif türler dahil) çok düşük düzeyde tutmaya katkı sağlamaktadırlar.
2.7.3. Oksidasyon reaksiyonlarının ve redoks düzenleme bozukluklarının sebep
olduğu eritrosit hasarı
Tüm antioksidan sistemlerin eşgüdümlü faaliyetleri, eritrositlerin oksidasyona karşı
oldukça dirençli olmasını ve aynı zamanda etkili bir sistemik redoks tamponlama
sistemi oluşturmasını sağlamaktadır. Antioksidan savunmanın bozulması ve/veya
artmış oksidan üretiminin artması, subselüler düzeyde eritrositler için ciddi sonuçlar
doğurmaktadır. Bu sonuçlar, Hb'nin (Denklem 4-7) ve diğer proteinlerin yıkılması,
iyonik homeostazın bozulması (Ca2+) (Duranton vd., 2002), yeni antijenlerin
oluşumu (Kay vd., 1986), kısıtlı eritrosit deformasyonu (Clemens ve Waller, 1987),
eritropoezde pozumla (Schrier vd., 2003) ve fosfatidilserin (PS) maruziyetinde artma
(Jain vd., 1985). eritrosit zarındaki yüksek seviyedeki çoklu doymamış yağ asitlerin
peroksidasyona karşı duyarlılığının artması ve eritrosit membran bütünlüğünün
kaybedilmesine ve membran enzimlerinin aktivitesinde azalmaya neden olamaktadır
30
[örn., ATPaz (Yesilkaya ve Yegin, 1998) ve asetilkolinesteraz (Van der Zee vd.,
1989)].
2.7.4. Eritrosit hemolizin biyokimyasal sonuçları
Dolaşımdaki hemolizin, özellikle kardiyovasküler sistem üzerinde derin patolojik
etkiler bıraktığı gösterilmiştir. Hemoliz özellikle hemolitik anemilerde belirgindir ve
redoks dengesizliği veya hemoglobinopatiler eritrosit membranında krılganlığa yol
açmaktadır. Eritrosit’lerin patlaması veya yırtılması sonucu, hücre içi içeriğinin -
özellikle Hb ve arjinaz 1- salınmasına yol açar. Hb bölümlenmesinin kaybedilmesi,
sistemik NO atımına neden olabilmekte ve buna bağlı oalarak endotel işlevini de
etkileyebilmektedir (Gladwin vd., 200; Risbano vd., 2015). Denklem 4-7’ye göre;
Hb ayrıca H202 ile reaksiyona girerek (örneğin enflamasyon koşulları sırasında
üretilen) feril Hb oluşumunu ve lipid peroksidasyonunu indükleyebilmektedir
(Alayash vd., 2001). Hb veya heme, Toll-benzeri reseptör 4'ü aktive ettiği ve
preinflamatuar NF-kB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells) -bağımlı sinyalizasyonu indüklediği ileri sürülmüştür (Belcher vd., 2016,
Ghosh vd., 2013). Ayrıca, arjinaz 1'in eritrositlerden salınması, arginin tükenmesine
katkıda bulunduğu ve endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) aktivitesinde de
azalmaya neden olduğu ifade edilmiştir (Morris vd., 2003).
2.8. DNA Hasarını Belirlemede Kullanılan Yöntemler
Alkali elüsyon, alkali unwinding, GC-MS, HPLC (elektrokimyasal dedektör ile) ve
comet analizi günümüzde oksidatif DNA hasarını belirlemede kullanılan
yöntemlerdir. Alkali elüsyon ve alkali unwinding güvenilir ve duyarlılığı yüksek
metodlar olmasına rağmen, komet analizine göre daha kısıtlı uygulama alanına
sahiptirler. HPLC ve GC-MS, DNA hasarını belirlemede ileri teknikler olmalarına
rağmen işlem süresinin uzun olması, daha maliyetli olmaları ve analize hazırlık
aşamasında numunelerde, oksidasyon reaksiyonlarının gelişebilmesi sebebiyle,
komet analizine göre nispeten daha az tercih edilmektedirler (Azgueta vd., 2009).
31
2.8.1. Comet testi (tek hücre jel elektroforezi)
"Tek Hücre Jel Elektroforezi" veya "Comet Metodu" DNA hasarını düşük dozlar için
bile hassas bir şekilde ortaya koyabilecek, hızlı, güvenilir ve ekonomik bir metotdur.
Radyoaktif işaretleme gerektirmemesi, özellikle insanlarda yapılan in vivo
çalışmalarda DNA hasar ölçümünde tercih sebebidir.
Alkali ortamda DNA süperkoil yapısının açılması ve kırıkların ortaya çıkmasının
ardından uygulanan elektroforezde kırılmış DNA zincirlerinin anoda doğru göçerek
bir kuyruklu yıldız görüntüsü oluşturması prensibine dayanmaktadır. Oluşan kuyruk
ne kadar fazla ise hasar derecesi de o kadar yüksek olarak kabul edilir (Dinçer ve
Kankaya, 2010). Mikroskobik incelemede hasarlı DNA’ların “kuyruklu yıldız”
şeklinde görünmesi sebebi ile “Comet Metodu” olarak isimlendirilmiştir. Metot,
günümüze kadar geliştirilerek ve çeşitli modifikasyonları üretilerek gelmiş ve DNA
hasarının tespitinde çok kullanılan, güvenilir metotlardan biri olmuştur (Dikilitaş ve
Koçyiğit, 2010)
Mikroskop lamı üzerindeki agaroz jel içine gömülen hücreler, zarların parçalanıp
çekirdekte bulunan süperkoil DNA’nın serbestleşmesi için lizis işlemine tabi tutulur.
Alkali ortamda süperkoil yapının gevşeyerek açılması ve kırıkların ortaya çıkması
sağlandıktan sonra uygulanan elektroforezde, kırılmış DNA zincirleri anoda doğru
göçerek bir kuyruklu yıldız görüntüsü oluşturur. Gerekli floresan boyama işlemi
yapıldıktan sonra boyamaya uygun mikroskop altında gerçekleştirilen inceleme ile
ortaya konan veriler, uygun istatistik yöntemler kullanılarak değerlendirilmektedir
(Dinçer ve Kankaya, 2010). Comet metodunun genel basamakları Şekil 2.7’de
gösterilmiştir.
32
2.7. Comet Metodunun Genel Basamakları (Fidan AF., 2008)
Günümüzde Comet metodu insanlarda, hayvanlarda, bitkilerde, hücre kültüründe,
deney hayvanlarında ve hatta funguslar ve bakteriler gibi çeşitli biyolojik
materyallerde farklı amaçlar ile uygulanmaktadır. Bu çalışmaların başında insanlarda
çeşitli amaçlar ile uygulan biyo-izleme (biomonitoring) çalışmaları gelmektedir.
Comet metodu, çevresel ve mesleki maruziyetlerin (kimyasal ya da radyoaktif
maruziyet gibi) izlenmesinde, biyolojik materyallerden faydalanılarak kullanılabilir.
Comet, yüksek risk altındaki bireylerin belirlenmesinde, hastalıklara neden olan
ajanlara maruziyet seviyesinin izlenmesinde veya besinlerin koruyuculuklarını
belirlemede kullanılabilir ya da bu faktörlere cevapta bireysel farklılıklar hakkında
bilgi verebilir (Yavuz , 2013).
33
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Deneylerde Kullanılan Cihazlar
Soğutmalı Santrifüj (Eppendorf MR 5415, Germany).
Manyetik karıştırıcı (IKAMAG RH, Janke&Kunkel Company GmbH und Co. KG,
IKA. Labortechnik, Staufen, Germany).
Hassas Terazi (Precisa 205A SCS, Switzerland).
Saf Su Cihazı (Millipore Progard 2, USA).
Derin Dondorucu (Liebherr, G 1211 Comfort, Germany).
Otamatik pipetler (Eppendorf, Hamburg, Germany).
Güç kaynağı (BIO-RAD POWER. PAC 1000).
PH Metre (Metler Toledo MA235 pH/Ion Analyzer, Schwerzenbach, Switzerland).
UV Spektrofotometre (Shimadzu UV 1601, Japonya).
Vorteks (Velp Scientifica, Usmate, Italy).
3.2. Deneyde Kullanılan Kimyasal Maddeler
Tris (Tris-HCl), Etilendiamin tetra asidik asit (EDTA), Sodyum klorür (NaCl),
Potasyum klorür (KCl), Disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4), Potasyum dihidrojen
fosfat (KH2PO4), Sodyum Hidroksit (NaOH), Hidrojen Klorür (HCl) Merck
firmasından, Sodyum bikarbonat (NaHCO3), Tris baz (NH2C(CH2OH)3), Sodyum
mono hidrojen fosfat (Na2HPO4.7H20) Sigma firmasından temin edilmiştir.
3.3. Eritrosit Membran Stabilizasyonunun Belirlenmesi
Eritrosit paketi oluşturmak için sağlıklı kişiden alınan heparinli’lı kan örneği 3000
rpm’de santrifüjlenerek plazma kısmı atıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu Tirisin
tamponlu tuz çözeltisi (TBS) ile (146 mM NaCl; 20mM trisin pH=7,4) 1:1 (v/v)
oranında seyreltilerek 3 kez yıkandı. Her bir yıkama ardından 10 dakika 3000 rpm’de
santrifüjlendi ve süpernatan kısımları atıldı. Son yıkamanın ardından elde edilen
eritrosit paketi 1:1 oranında TBS ile seyreltildi. H2O2
34
Daha önce yıkanan eritrosit hücrelerinden 100 µL (% 50 hematokrit) alınarak TBS-
çinko (138,56 mM NaCl, 7,64 mM ZnSO4, 20 mM tirisin, pH= 7,4) çözeltisinin
ddH2O ile seyreltilmesi sonucu faklı osmolarite (300-33,33 mOsm/L) ve farklı çinko
konsantrasyonlarında hazırlanan 10 mL çözeltilerine (40 -0,078 µg/mL) ilave edildi.
Tüpler karıştırıldıktan sonra 37˚C’deki su banyasında inkübe edildiler ve her 15
dakikada bir yavaşça karıştırıldı. Farklı zaman aralıklarında tüpler homojenize
edildikten hemen sonra ependorf tüplere alınan 1 mL’lik eritrosit süspansiyonları
1600 x g’de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüz sonrası oluşan süpernatan kısmı 540
nm’deki absorbansları okundu.
TBS konsantrasyonunun (X) fonksiyonu olarak 540 nm’de ölçülen (A540) absorbans
grafikleri Boltzmann eşitliğine göre (E1) belirlenen sigmoidal regresyon doğrusuna
(Şekil 3.1 ) göre yapıldı.
(E1)
Burada, Amin ve Amax grafik eğrisinin sırasıyla minimum ve maksimum platosu,
H50 (g/dL TBS) %50 hemolizin gerçekleştiği TBS konsantrasyonu ve dX (g/dL
NaCl) tam hemoliz geçişinden sorumlu olan tuz konsantrasyonundaki değişkendir.
Eritrosit membranının osmotik stabilitesinin değerlendirilmesinde dX ve 1/H50
parametreleri kullanıldı. % hemoliz aşağıdaki eşitliğe göre belirlendi.
% Hemoliz =100 x (OD1-OD2)/OD1
OD1= Hipotonik tampon tuzu çözeltisinin optik yoğunluğu
OD2=Hipotonik Test örneği çözeltisinin optik yoğunluğu
35
Şekil 3.1.Tuz konsantrasyonundaki azalma ile oluşan tipik eritrosit hemoliz eğrisi. Veriler sigmoidal
regresyon ile düzeltilmiştir. H50, % 50 hemolizi oluşturmak için gereken tuz
konsantrasyonudur ve 4dX, rezidüel değerden (Amin) maksimum absorpsiyon değerine
(Amax) geçiş ile ilişkili % 100 hemoliz için gerekli olan tuz konsantrasyonundaki
değişimdir.
3.4. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu Tayini
TBS-çinko (138,56 mM NaCl, 7,64 mM ZnSO4, 20 mM tirisin, pH= 7,4) stok
çözeltisi kullanılarak değişen konsantrasyonlarda (40 -0,078 µg/mL) çözeltiler
hazırlandı. Negatif kontrol olarak TBS (146 mM NaCl; 20mM trisin pH=7,4)
kullanıldı. Değişen miktarlarda çinko ihtiva eden tüplere son hemoglobin
konsantrasyonu 3g/dL olacak şekilde eritrosit paketinden ilave edildi. Tüm
seyreltmeler TBS çözeltisi ile yapıldı.
Hazırlanan çalışma ve kontrol tüpleri üzerine son konsantrasyonu 10 mM olacak
şekilde H2O2 ilave edildi. Çalışma tüpleri 37 °C’de su banyosunda inkübasyona
bırakıldı. Değişen zaman aralıklarında MDA tayini yapıldı.
MDA tayini Stocks ve Dormandy ‘ye göre yapıldı. 37 °C’de su banyosunda inkübas
İnkübasyona bırakılan tüpleri yavaşca homojenize edilmesinin hemen ardından 900
μL alınarak üzerine 0,2 M sodyum meta arsenid ihtiva eden % 28 lik’ TCA
36
çözeltisinden 600 μL ilave edildi ve 4500 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi.
Santrifüjün ardından 800 μL süpernatan alınarak üzerine 400 μL günlük taze olarak
hazırlanan 0,069 M’lık TBA çözeltisi ilave edildi ve 15 dakika kaynar su banyosunda
bekletildi. Oluşan renkli çözeltinin absorbansı 532 ve 600 nm’de spektrofotometrede
(Shimadzu UV 1601) okundu ve MDA konsantrasyonları aşağıdaki formüle göre
hesaplandı (3.1).
[MDA] = (A532 – A600) x 900 = nmol MDA / g Hb (3.1)
3.5.Tek Hücre Jel Elektroforezi (Comet ) Tayini
3.5.1. Kan örneklerinin alınması
Kan örneği sağlıklı ve sigara içmeyen kişiden heparinli tüpe yaklaşık 10 mL olacak
şekilde alınmıştır.
3.5.2. Lenfosit örneklerinin hazırlanması
Alınan kan örneği PBS ile 1:1 oranında seyreltildi, 1’er mL ependorflara bölündü ve
üzerine 400 μL Hystopaque-1077 (Sigma, Almanya) çözeltisi eklenerek +4˚C’de 400
g’de 10 dak. santrifüj edildi. Lenfosit tabakasının 400 μl si ependorf tüplere otomatik
pipetle alındı ve PBS ile 1 mL’ye tamamlanarak +4˚C’de 200 g’de 10 dak. tekrar
santrifüj edildi ve üst kısım atıldı.
3.5.3. Çinko çözeltilerinin hazırlanması ve lenfositler ile muamele
Hazırlanan stok TBS-çinko çözeltisinden (138,46 mM NaCl, 7,74 mM ZnSO4, 20
mM tirisin, pH= 7,4) 40-0,078 µg/mL çözeltiler hazırlandı ve lenfosit örneklerinin
hazırlanması aşamasındaki son basamakta santrifügasyonla dibe çöktürülen lenfosit
hücrelerinin üzerine 1 mL ilave edildi. Nagatif çözücü kontrol olarak TBS (146,2
mM NaCl, 20mM trisin, pH= 7,4) çözeltisi kullanıldı. Farklı konsantrasyonlarda
çinko içeren lenfosit süspansiyonları, sadece TBS içeren negatif çözücü kontrol
lenfosit süspansiyonu ve pozitif kontrol olarak TBS-H2O2 içeren lenfosit
süspansiyonu 370C’de 1 saat inkübasyona bırakıldı.
37
3.5.4. Hücre sayımı
Lenfosit canlılık oranları tripan blue yöntemi ile belirlendi. Hücreler 1:1 oranında
tripan blue ile boyandı ve Thoma lamına yayılarak ışık mikroskobunda sayıldı.
Hücre canlılığı %90’ın üzerinde olan lenfositlerle COMET testi değerlendirilmesi
yapıldı.
3.5.5. Comet tekniği
Lamlar % 1’lik NEDA ile kaplandı ve oda sıcaklığında kurutuldu. 50 μL hücre
süspansiyonu (yaklaşık 5x104 hücre), 37 0C’deki 50 μL % 0.75’lik DEDA ile
karıştırıldı ve kaplanmış lamlara yayıldı. Lamel kapatılarak buzdolabında agaroz
katılaşıncaya kadar 15 dak. beklendi. Lameller, agaroz zedelenmeden alındı. Lamlara
üçüncü tabaka olarak 100 μL DEDA yayıldı ve lamel ile kapatılarak buzdolabında
agaroz katılaşıncaya kadar 20 dak. beklendi. Lameller agaroz zedelenmeden alındı.
Lamlar, lizis çözeltisi (62.3 mL stok lizis çözeltisi, 7 mL DMSO, 0.7 mL Triton X)
içinde 2 saat buzdolabında bekletildi. Daha sonra taze hazırlanmış soğuk elektroforez
çözeltisinde (90 mL 5 M NaOH, 7.5 mL 0.2 M EDTA) 20 dak. bekletildi.
Elektroforez tankı elektroforez çözeltisi ile dolduruldu. Elektroforez tankı buz ile
soğutularak sıcaklık +4 0C’de tutuldu. Lamlar, agaroz yayılan kısımları üste gelecek
Ģekilde tanka yerleştirildi ve sabit 15 V ve 300 mA akımda 30 dak. elektroforez
işlemi gerçekleştirildi. Oluşturulan elektrik akımı sayesinde negatif yüklü DNA
sarmal kırıklarının anoda doğru göç etmesi sağlandı. Lamlar cam şaleye yerleştirilip
nötralizasyon tamponu (0.4 M Tris) ile 3 kere + 4 0C’de 5 dak. nötralize edildi.
3.5.6. Boyama
Her lam, floresan renk vermesi için 50 μL etidium bromür (20 μL/mL) ile boyandı.
Lamel ile kapatıldı ve 15 dak. bekletildi.
3.5.7. Değerlendirme
Lamlar bekletilmeden floresan mikroskobunda (Zeiss Axio Imager A1). 400x,
büyütme ile tarandı. Her bir örnek kullanılarak başına 100 hücre Open Comet
38
software (Gyori vd., 2014) kullanılarak değerlendirmeye alındı. DNA hasarının
değerlendirilmesinde OpenComet ile ilde edilen kuyruk momenti, kuyruk uzunluğu
ve kuyruk yoğunluğu parametreleri kullanıldı.
3.5.8. Comet sonuçlarının istatistiksel değerlendirmesi
İstatistiksel analiz IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA)
paket program kullanılarak yapıldı DMSO ile muamele edilen negative control,
H2O2 ile muamele edilen pozitif control BHA ve sentez bileşikleri ile muamele
edilen test gruplarının istatistiksel karşılaştırılması ANOVA (tek yönlü varyans)
analizi ile yapıldı. Gruplar arası farklılığı ortaya koymak için LSD post-hoc testi
kullanıldı.Bütün değerler ortalama ± SD olarak ifade edildi. İstatistiksel anlamlılık
düzeyi için p<0.05 kabul edildi.
39
4. ARAŞTIRMA BULGULARI
Tez kapsamında 40-0,039 μg/mL ranjında 10 farklı konsantrasyonda çinko çözeltileri
hazırlanmıştır. Çalışmada çinkonun in vitro eritrosit membran stabilizasyonu, lipit
oksidasyonu ve genotoksik etkileri sırasıyla eritrosit osmotik direnç, MDA tayini ve
comet testi ile değerlendirilmiştir.
4.1. Eritrosit Membran Stabilizasyonunu Bulguları
Çizelge 4.1. Farklı çinko konsantrasyonları ile muamele edilen insan eritrositlerinin
membran stabilitesi ile ilgili parametreleri, Şekil 4.1. % 50 hemolizi oluşturmak için
gereken tuz konsantrasyonlarını ve Şekil 4.2 ise ve tam hemoliz geçişinden sorumlu
olan tuz konsantrasyonundaki değişimin ¼’ünü göstermektedir.
40
Çizelge 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinkonun zamana göre insan eritrosit
membranının osmotik stabilitesi üzerine etkisi.
Konsantrasyon Değişkenler 0.Saat 2.Saat 3.Saat 8. Saat
TBS (20 mM) Solvent kontrol
Amax (AU) 94,66±3,26 97,98±4,09 98,25±3,55 99,22±3,88
Amin (AU) 0,04±1,89 0,47±2,45 0,77±2,16 1,19±2,38
H50 (g/dL NaCl)
0,415±0,006 0,422±0,008 0,425±0,007 0,428±0,007
dX (g/dL NaCl) 0,017±0,006 0,021±0,007 0,024±0,006 0,028±0,006
Zn (10 μg/mL) Amax (AU) 96,49±1,51 96,77±4,83 99,15±3,45 99,52±2,55
Amin (AU) 0,73±0,90 1,11±1,21 7,88±2,67 26,76±2,92
H50 (g/dL NaCl)
0,448±0,002 0,460±0,009 0,489±0,009 0,570±0,011
dX (g/dL NaCl) 0,029±0,002 0,037±0,008 0,062±0,008 0,069±0,011
Zn (5μg/mL) Amax (AU) 98,53±0,35 98,96±0,50 100,334±1,35 101,37±3,23
Amin (AU) 1,34±0,21 1,78±0,32 4,62±0,93 16,36±2,40
H50 (g/dL NaCl)
0,446±0,001 0,459±0,001 0,477±0,002 0,487±0,008
dX (g/dL NaCl) 0,019±0,001 0,025±0,001 0,034±0,002 0,053±0,007
Zn (2,5 μg/mL) Amax (AU) 96,19±0,55 96,84±0,77 98,62±1,45 100,38±0,86
Amin (AU) 1,92±0,33 2,70±0,54 4,33±0,84 5,77±0,65
H50 (g/dL NaCl)
0,444±0,001 0,454±0,001 0,468±0,002 0,475±0,002
dX (g/dL NaCl) 0,021±0,001 0,024±0,001 0,034±0,001 0,035±0,001
Zn (1,25 μg/mL) Amax (AU) 96,47±0,29 96,61±1,19 98,14±0,71 100,35±0,73
Amin (AU) 1,64±0,18 2,15±0,85 2,35±0,52 6,40±0,53
H50 (g/dL
NaCl)
0,443±0,001 0,448±0,001 0,465±0,001 0,472±0,001
dX (g/dL NaCl) 0,020±0,001 0,023±0,001 0,027±0,001 0,031±0,001
Zn (0,625 μg/mL) Amax (AU) 96,81±0,66 98,56±0,97 100,32±0,82 100,61±1,173
Amin (AU) 1,65±0,39 2,75±0,62 6,35±0,52 6,83±0,75
H50 (g/dL NaCl)
0,438±0,001 0,446±0,001 0,452±0,001 0,459±0,001
dX (g/dL NaCl) 0,019±0,001 0,022±0,001 0,025±0,001 0,031±0,001
Zn (0,313 μg/mL) Amax (AU) 93,60±1,34 95,03±1,30 96,97±1,33 97,99±1,33
Amin (AU) 1,69±0,79 1,49±0,83 3,20±0,87 5,41±0,88
H50 (g/dL NaCl)
0,436±0,001 0,444±0,002 0,448±0,002 0,450±0,002
dX (g/dL NaCl) 0,018±0,001 0,022±0,001 0,025±0,002 0,030±0,002
Zn (0,156 μg/mL) Amax (AU) 91,65±0,83 93,98±1,38 98,83±1,51 100,02±1,56
Amin (AU) 0,77±0,51 1,33±0,88 2,45±1,01 6,03±1,04
H50 (g/dL NaCl)
0,424±0,001 0,438±0,002 0,446±0,002 0,447±0,002
dX (g/dL NaCl) 0,017±0,001 0,021±0,001 0,026±0,002 0,029±0,002
Zn (0,078 μg/mL) Amax (AU) 95,72±0,93 97,04±1,25 98,34±1,70 99,02±1,78
Amin (AU) 1,46±0,55 1,62±0,78 2,03±1,11 3,12±1,17
H50 (g/dL NaCl)
0,426±0,001 0,443±0,001 0,448±0,002 0,449±0,002
dX (g/dL NaCl) 0,018±0,001 0,024±0,001 0,027±0,002 0,029±0,002
Zn (0,039 μg/mL) Amax (AU) 96,83±1,91 96,89±1,74 97,93±1,54 99,11±1,42
Amin (AU) 0,74±1,21 2,03±1,19 2,46±1,06 4,13±0,98
H50 (g/dL
NaCl)
0,435±0,002 0,446±0,002 0,455±0,002 0,458±0,002
dX (g/dL NaCl) 0,021±0,002 0,025±0,002 0,027±0,002 0,03±0,002
Sonuçlar ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir.
Çizelge 4.1’deki verilere göre zamana bağlı olarak tüm çinko konsantrasyonlarına
eritrisit membran stabilitesi azalmaktadır. Yüksek ve düşük çinko
41
konsantrasyonlarında eritrositlerin membran stabilizasyonunda azalma meydana
gelmektedir.
Osmotik frajilite testi ile eritrosit membran stabilitesi üzerine çinkonun etkilerinin
değerlendirilmesinde kullanılan H50 ve dX değerleri sırasıyla Şekil 4.1 ve 4.2’de
verilmiştir.
Şekil 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin zamana göre H50
değerleri
Şekil 4.2 ve 4.3’deki verilere göre farklı konsantrasyonlarda çinko ile muamele
edilen eritrositlerin membran stabilitesi hem zamana ve hem de çinko
konsantrasyonuna bağımlı olarak membran stabilitesinde azalma görülmektedir.
Ayrıca, yüksek (>0,313) μg/mL ve düşük (<0,078 μg/mL) çinko
konsantrasyonlarında eritrositlerin membran stabilizasyonundaki azalma dikkat
çekmektedir.
42
Şekil 4.2. Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin zamana göre dX değerleri
4.2. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu
Eritrosit süspansiyonlarının (3g/dL Hb) H2O2 ile oksidasyonun indüklenmesi üzerine
değişen çinko seviyelerinin etkisini gösteren grafik Şekil 4.3.’de ortaya koyulmuştur.
43
Şekil 4.3. Çinkonun H2O2 aracılıklı lipid oksidasyonu üzerine etkisi.
Şekil 4.3’deki grafiğe göre çinko ve H2O2 içermeyen eritrositlerin (kontrol 1) zamana
bağlı olarak oksidasyonun arttığı görülmektedir. Çinko içermeyen ancak H2O2 içeren
eritrositlerin ise zamana bağlı olarak diğer çinko içeren ve içermeyen örneklere göre
lipid peroksidasyonu düzeylerinin diğerlerine göre yüksek çıkmıştır. Çinko ihtiva
eden eritrosit süspansiyonlarında ise lipit peroksidasyonu artan çinko
konsantrasyonuna göre azalma göstermiştir.
4.3. İn-Vitro Comet Bulguları
Çinkonun periferal lenfosit DNA hasarı alkalin comet tayini yöntemi ile ortaya
koyulmuştur.
44
Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda çinko ile muamele edilen insan lenfositlerinin
comet verileri (% kuyruk DNA).
Bileşikler Konsantrasyon Kuyruk DNA Yüzdesi1,2
TBS (Solvent kontrol) 20 mM 1,30 ± 1,39c
PBS (Negatif kontrol) 10 mM 0,95 ± 1,45b
NaCl (Negatif kontrol) %0,9 0,56 ± 0,38a
Zn
40 μg/mL 2,17 ± 2,79abc
20 μg/mL 1,87 ± 2,87abc
10 μg/mL 1,28 ± 2,04
5 μg/mL 0,85 ± 0,96
2,5 μg/mL 0,70 ± 0,76c
1,25 μg/mL 0,50 ± 0,67c
0,625 μg/mL 0,26 ± 0,31c
0,313 μg/mL 0,21 ± 0,16c
0,156 μg/mL 0,34 ± 0,40c
0,078 μg/mL 0,42 ± 0,54c
0,039 μg/mL 0,51 ± 0,56 1Ortalama ± SD; Bütün değerler pozitif kontrolün (H2O2) maksimum DNA hasarı
miktarına göre belirlenen göreceli skorlarıdır. 2Aynı kolondaki farklı üstsimgeli
ortalamalar en küçük anlamlı farklar testine (LSD testi) göre anlamlı farklılıklardır.
Çinkonun periferal lenfosit DNA hasarı, alkalin comet tayini yöntemi ile ortaya
koyulmuştur. Farklı konsantrasyonda hazırlanan çinko çözeltilerinin (40 - 0,039
μg/mL) periferal lenfosit DNA hasarı, negatif kontrollere göre istatistiksel anlamlılık
düzeyleri Çizelge 4.2.’de ve farklı çinko dozlarına göre elde edilen comet’lere ilişkin
hata çubuk grafiği Şekil 4.4.’de verilmiştir.
Şekil 4.4. Farklı konsantrasyonlarda çinko’ya maruz kalan lenfosit hücrelerinden elde edilen %
kuyruk DNA kometi hata çubuk grafiği. Sonuçlar doz başına 100 comet skorlanarak
değerlendirme yapılmıştır ve ortalama değer ± standart hata olarak ifade edilmiştir.
45
5. TARTIŞMA VE SONUÇLAR
Bu tez çalışmasında farklı konsantrasyonlarda hazırlanan ZnSO4’ün eritrosit
membran bütünlüğü, lipit oksidasyonu ve DNA hasarı üzerine etkileri sırasıyla
osmotik fragilite, MDA tayini ve comet tekniği ile değerlendirilmiştir.
Çalışmamızda ZnSO4’den hazırladığımız farklı çinko konsantrasyonları, plazma
çinko konsantrasyonlarının, yaş gruplarına, cinsiyete ve açlık durumuna göre cutoff
değerleri göz önüne alınarak hazırlanmıştır ve ayrıca hazırladığımız çinko çözeltileri
çinko eksikliği ve fazlalığı durumlarında ortaya çıkacak etkileri gözlemleyebilmek
açısından da 10 faklı konsantrasyonda çözelti hazırlanmıştır. Çinko iyonlarının neden
olduğu membran hasarının bir ölçüsü olarak eritrosit hücrelerinin hemolitik direnci
belirlendi. Çizelge 4.1’de farklı inkübasyon (0-8 saat) ortamındaki çinko
konsantrasyonundaki artışın (>0,156 µg/mL), hücrelerin hemolize daha duyarlı
olmasını sağladığını göstermektedir. Ayrıca düşük konsantrasyondaki Zn (<0,078
µg/mL) ile inkübasyona bırakılan eritrositlerin hemolize duyarlılıklarının artttığı
görüldü. % 50 hemoliz oluşturan NaCl konsantrasyonları kontrolde 0. saatte
0,415±0,006 olarak bulundu. Bu değer ve tüm çinko ile muamele edilen eritroit
süspansiyonlarındaki değerlerden daha düşük olduğu göze çarpmaktadır. Ayrıca
farklı saatlerde yapılan ölçümlerden elde edilen H50 değerleri kontrole göre diğer
zinkolu eritrosit süspansiyonlarında yüksek bulundu. Çalışılan koşullar altında, 0,156
µg/mL Zn ihtiva eden eritrositler hemolize karşı diğer yüksek ve düşük Zn ile
muamele edilen eritrositlerden daha yüksek direnç gösterdikleri belirlendi (Çizelge
4.1).
Çinko iyonlarının eritrositlerinde hemoliz düzeyine olan etkisi, çinko iyonlarının,
Band 3 proteininin sitoplazmik alanına bağlanabilme, anyon transport aktivitesini
inhibe etme yeteneğine sahip olması (Tu ve Xu, 1994) nedenyle hücreler ve hücreleri
çevreleyen medyum arasında iyon değişiminin bozulması ve sonuç olarak da hücre
hemolizininin artmasına yol açmaktadır.
Şekil’4.3’deki verilere göre 40-0,078 µg/mL aralığında değişen konsantrasyonlarında
hazırlanan çinko çözeltilerinin H2O2 indüksiyonlu eritrosit lipit oksidasyonu üzerine
zamana bağlı etkileri negatif kontrol ve pozitif kontrole göre değerlendirmesi
46
görülmektedir. Şekil 4.3.’deki verilere göre artan çinko konsantrasyonuna bağlı
olarak lipit peroksidasyonunda azalma gözlenmiştir. Çalışmamızda eritrosit
süspansiyonlarına enzim inhibiörü olarak NaN3 ilave edilmemiştir. Dördüncü saatte
kadar yapılan MDA ölçümlerinin yüksek çıkması negatif ve pozitif kotrole göre
değerlendirildiğinde H2O2’ninkatalaz aracılıklı elimine edilmesindeki sürece bağlı
olabileceğini göstermektedir. Bir mikro besin olan çinkonun eritrositlerde hidrojen
peroksit-aracılıklı lipit peroksidasyona bakıldığı bu çalışmada çinkonun bir lipit
peroksidasyonu ürünü olan MDA’nın oluşumunu azalttığı dolayısıyla eritrositlerdeki
oksidatif hasarı önlemede etkili olduğu sonucu ortaya çıkmaktadır.
Comet yöntemi, besin maddeleri veya mikro besin maddelerinin genotoksik etkinin
belirlenmesi çalışmalarında comet tekniği hassas, ekonomik, pratik, tek hücrede
DNA hasarını ortaya koyması ve kısa sürede yapılabilmesi açısından tercih edilen ve
sıklıkla kullanılan genotoksik testlerden biridir.
Görüntü analizinde operatör tarafından seçilen comet’ler için flüoresan
parametrelerini değerlendiren çok sayıda yazılım paketi var. Yazılım paketlerinde
comet’lerin değerlendirilmesinde en sık kullanılan parametreler, kuyruk uzunluğu,
baş ve kuyrukların göreli floresan yoğunluğu (normal olarak kuyrukta DNA'nın bir
yüzdesi olarak ifade edilir) ve kuyruk momentidir. Ortalama kuyruk uzunluğu, ilk
belirleme aşamasında nispeten düşük hasar seviyelerinde artış gösterebildiğinden çok
yararlı değildir. Akabinde, kuyruk yoğunluğu artar, ancak hasar dozu arttıkça
uzunluk artmaz. Kuyruk uzunluğu arka plan üzerinde belirli bir aşırı flüoresan
yoğunluğu ile tanımlandığından, görüntü analizi programının arka planına veya eşik
ayarına da duyarlıdır. Göreceli kuyruk yoğunluğu parametresi, kırılma frekansı için
doğrusal bir ilişki ortaya koyduğundan eşik ayarlarından nispeten etkilenmez ve
mümkün olan en geniş aralıkta hasarın ayrımcılığına imkan sağladığından (teoride,
kuyrukta %0 ila %100 DNA) en yararlı parametre olarak gözükmektedir. Bunun
aksine, kuyruk momenti parametresi (aslında kuyruk uzunluğu ve kuyruk yoğunluğu
ürünüdür) doza göre doğrusal değildir ve comet görünümüne dair herhangi bir
izlenim ortaya koymaz. Slayt başına 50 comet analizinin yapılması önerilmektedir
(Collins, 2004).
47
Yaptığımız çalışmada çinkonun lenfosit DNA’sı üzerine etkileri ortaya koyma
amacıyla yapmış olduğumuz comet analizindeki konsantrasyonları, düşük-normal ve
yüksek plazma çinko seviyelerini yansıtacak şekilde ayarlandı. Çalışmamızın
verilerine göre, Çözücü kontrolün (TBS) negatif kontrollere ve 5-0,078 µg/mL çinko
ihtiva eden örneklere göre yüksek seviyede DNA hasarı oluşturduğu gözlenmiştir.
TBS’ye bağlı DNA hasarı muhtemelen trisinden kaynaklanmaktadır ve 5-0,078
µg/mL çinko ihtiva eden örneklere göre oluşan DNA hasarı istatistiksel olarak da
anlamlıdır (p<0,05). Yüksek çinko konsantrasyonunda (20-40 µg/mL) oluşan DNA
hasarı konsantrasyona bağımlı olarak hem solvent ve hem de negatif kontrollerden
yüksek çıkmış olup, DNA hasarındaki bu artış istatistiksel olarak da anlamlı
bulunmuştur (p<0,005). En düşük DNA hasarına ise 0,313 µg/mL çinko
konsantrasyonunda ulaşılmıştır ve DNA hasarındaki azalma solvent kontrole göre
istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Çinko konsantrasyonunun 0,313
µg/m’nin altında olduğu durumlarda ise DNA hasarı çinko konsantrasyonundaki
azalmaya bağımlı olarak artış göstermiştir. Çizelge 4.4’de çinko seviyelerinin DNA
hasarı üzerine etkileri istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.
Çinko, çok sayıda makromolekülün yapısı ve fonksiyonunun yanı sıra 300'den fazla
enzimatik reaksiyon için esansiyel bir elementtir. Toplam insan vücudundaki çinko
içeriğinin 30 mmol (2 g) olduğu tahmin edilmektedir ve turnoveri tamamen
homeostatik kontrol altındadır. Diyetteki bu mikro besin maddesinin eksikliği ile
ilgili çalışmalar yapılmış olup eksikliğinde büyüme yetersizliği, nöropati, diyare,
dermatit, hipotansiyon ve hipertermi ortaya çıkmaktadır (Jenner vd., 2007; Tapiero
ve Tew, 2003; Taysi vd., 2003).
Çinkonun genellikle toksik olmadığı düşünülmektedir. Aşırı çinko bakır toksisitesine
neden olduğu düşünülmekle birlikte çoğu klinik durumda pratik bir öneme sahip
olmadığı ileri sürülmektedir. Örneğin, bebeklerde 4 ay süreyle günde 10 mg'lık çinko
takviyesinin, hipokupremi ile ilişkili olmadığı bulunmuştur (Yakoob vd., 2011).
Ergenlik dönemindeki erkek çocuklarda yapılan dört aylık deneme çalışmasında, 5 -
10 mg/gün olarak verilen ilave çinkonun bakır statüsü ile ilişkili olumsuz etkilere
dair hiçbir kanıt elde edilememiştir (Buhutta vd., 2000; Lazzerini ve Ronfani, 2013).
Aşırı çinko alınımının, otizmde bir faktör olduğu öne sürülmesine rağmen, yapılan
48
kontrollü çalışmalarda böyle bir ilişkinin olduğu ispatlanamamıştır (Galvao vd.,
2013).
Birçok çalışma ve meta-analizler, çinko desteğinin plazma çinko konsantrasyonunu
arttırdığını ifade etmektedirler. Bu araştırmalara ilaveten, plazma çinko
konsantrasyonunun ek çinkoya tepkisinin doz-yanıtını veya zaman sürecini inceleyen
birkaç çalışma mevcuttur. Bu çalışmalar, plazma çinkosundan sağlanan doz veya ek
çinko miktarı ile ilişkili olarak hem çocuklarda hem de yetişkinlerde çinko desteğine
sürekli ve oldukça hızlı tepki verdiğini göstermektedir. Çinko desteğinin geri
çekilmesinden sonra plazma çinko konsantrasyonunu 1-2 hafta içinde başlangıç
seviyesine geri dönmektedir (King vd., 2015).
Plazma çinko konsantrasyonu ile çinko eksikliğinin klinik bulguları arasındaki
ilişkiyi değerlendirmek için, deneysel çinko deplesyon/replesyon çalışmaları ve
akrodermatitis enteropatika (AE) tanısı alan bireylerde yapılmış olan çalışmalardan
elde edilen veriler incelenmiştir (Wessells vd., 2014). Aynı çalışmada, deneysel
çinko deplesyon/replesyon çalışmalarında olduğu gibi, AE'li hastalarda klinik
bulguların varlığı ile düşük plazma çinko seviyesi arasında açık bir ilişki mevcuttur.
Spesifik olarak, AE'nin klinik belirtilerinin bulunduğu günlerde ortalama 6 SD
plazma çinko konsantrasyonu (PÇK) 38 ± 21 mg/dL iken tedavi sonrasında klinik
bulguların artık mevcut olmadığı günlerde ortalama 6 SD PÇK 102 ± 35 mg/dL
olarak bulunmuştur. Wessells ve arkadaşları (2014) 6 SD PÇK değerinin, çinko
eksikliği ile ilişkili klinik belirtileri geliştiren, diyetteki çinko tükenmesine maruz
kalan hastalarda anlamlı olarak düşük olduğunu ve cutoff değerinin 50 mg/dL olarak
uygulandığında, eksikliğin klinik belirtilerini saptamaya yönelik PÇK'nin duyarlılığı
ve özgüllüğü sırasıyla % 82 ve % 92 olarak belirlemişlerdir. Çinko eksikliği
riskininin değerlendirilmesinde önerilen plazma çinko konsantrasyonlarının, yaş
gruplarına, cinsiyete ve açlık durumuna göre cutoff değerleri Çizelge 5.1. de
verilmiştir.
49
Çizelge 5.1. Plazma çinko konsantrasyonlarının, yaş gruplarına, cinsiyete ve açlık
durumuna göre cutoff değerleri (King vd., 2015; Hotz ve Brown, 2004;
Pilch ve Senti, 1984)
Açlık durumu ve
günün zamanı
Plazma çinko konsantrasyonu µg/dL
Çocuk < 10 yaş Bayan ≥ 10 yaş Erkek ≥ 10 yaş
Sabah, açlık - 70 74
Sabah, tokluk 65 66 70
Öğleden sonra 57 59 61
Tam kandaki çinko konsantrasyonu 4-8 mg/mL'dir. Eritrosit paketinin çinko içeriği
normalde 8-14 mg/g yaş ağırlık veya 10-11 mg/1010 hücre'dir (Brown vd., 1998).
Çinko beslenmesinin biyolojik belirteçleri olarak kan hücresel çinko
konsantrasyonlarının kullanışlılığı üzerine yapılan çalışmalar karmaşık sonuçlar
ortaya koymaktadır. Deneysel insan çinko deplesyon/replesyon çalışmaları veya
uzun süreli çinko desteği (örneğin 50 mg/gün), eritrosit çinko, eritrosit zar çinkosu,
lökosit çinko veya lökosit alt popülasyonlarının çinko içeriğinde çinko seviyeleri ile
uyumlu değişiklikler göstermemektedir (Raiten ve Comps, 2015). Gerçekten de, bazı
çinko deplesyon çalışmalarında fonksiyonel çinko deplesyonunun iki potansiyel
biyobelirteci olan tat duyarlılığının ve bağışıklığın baskılanmasına rağmen eritrosit
veya lökosit çinko konsantrasyonlarında kayda değer herhangi bir cevap
belirlenememiştir. Bu duruma ilaveten, hücresel çinko konsantrasyonları için
belirlenmiş referans değerlerinin olmaması, kan hücrelerinin ayrımı ve fazla
miktarda kana ihtiyaç duyulması sonuçların yorumlanmasını da zorlaştırmaktadır.
Gıda ve Beslenme Kurulu, diyetteki çinko alımları için tolore edilebilir üst alım
seviyesini (UL) belirlemişlerdir. UL'nin üstündeki uzun-süreli alımlar olumsuz sağlık
etkileri riskini artırdığı bilinmektedir (Akhtar, 2013). UL, yetişkinlerde> 50 mg/gün
çinko alınımının, bakır bağımlı enzim eritrosit Cu, Zn süperoksit dismutaz
aktivitesini azalttığını gösteren verileri temel almaktadır. Belirsizlik faktörü için
düzeltme yapıldıktan sonra, UL yetişkinler için 40 mg/gün olarak ayarlanmıştır.
Çocuklar için UL, 6 - 11 ay arasında bebeklerde 5 mg/gün ve 14 - 18 yaşları arasında
ergenlerde ise 34 mg/gün arasında değişmektedir (Bertinato vd., 2013).
Tüm vücut çinkosunun yaklaşık % 99'u hücre içindedir (Jackson, 1989). Dokulardaki
toplam çinko miktarı, plazmadan çok daha fazla olduğu için, karaciğer gibi dokuların
çinko içeriğindeki nispeten küçük değişiklikler PÇK üzerinde çarpıcı bir etkiye sahip
50
olabilmektedir. Örneğin glukokortikoid tedavisi, hepatik MT'yi indükleyerek
çinkonun karaciğere girişini artırmakta ve dolayısıyla da plazma çinkosunda belirgin
bir düşüşe neden olmaktadır (Cousins, 1989). Bu durum, tam kan konsantrasyonları
ve PÇK'leri içeren çinko durumunun sistemik belirteçlerinin neden orta düzeyde
çinko eksikliğini yansıtmadığını açıklayabilmektedir. Yakın tarihli çalışmalar,
hücresel çinkonun düzenlenmesinin kompleks olduğunu ve hücresel çinko
turnoverini ayarlamak için hızlı ve yavaş mekanizmaların yer alabileceğini
göstermektedir (Maret, 2013). Lökosit veya eritrosit çinko konsantrasyonları
diyetteki çinko değişikliklerine cevap vermese de, hücre altı birimlerinin çinko
konsantrasyonları ve çeşitli hücresel fonksiyonlar ile ilgili araştırmalar, yeni çinko
statüsü için biyolojik belirteçlerin ortaya koyulmasına yol açabilir.
Çinko terapisi akrodermatitis enteropatika ve Wilson’s hastalığı olan bireylerde
oldukça başarılıdır ve sağlığa bağlı yaşam kalitesi üzerinde oldukça etkilidir. Çinko
süplementasyonunun olumlu terapötik çevapları çocuklarda akut diyare, kronik
hepatit C, Shigella enfeksiyonu, cüzam, şark çıbanı ve nezlede gözlenmiştir.
Çinkonun bu yegane özellikleri insanlarda görülen çeşitli hastalıklarda anlamlı olarak
yararlı terapötik etkilere sahiptir. Özellikle çinko eksikliği ile seyreden hastalıklar
oldukça karmaşık hale gelebilir ve immünolojik durumu olumsuz olarak, oksidatif
stresi artırarak ve enflamatuar sitokinlerin üretimini artırarak klinik taployu karmaşık
hale getirebilir. Oksidatif stres ve kronik inflamasyon eterosikleroz, çeşitli
malignansiler, nörolojik bozukluklar ve otoimmün hastalıklar gibi birçok kronik
hastalıkta önemli nedensel rol oynamaktadır (Prasad 2009). Diğer taraftan aşırı çinko
alınımına bağlı olarak akut ve kronik çinko zehirlenmesi oluşabilmektedir. Aşırı
çinko hücreler için toksiktir (Pagani vd., 2007). Dolayısıyla hücresel çinko seviyesi
uygun ranjlar (0,1 ve 0,5 mM) içersinde tutulması gerekmektedir (Eide, 2006).
Çinko, vücut sıvılarında ve hücrelerde çinko (II) iyonu olarak bulunur ve redoks-
inerttir. Yine de, antioksidan özelliklere sahip olduğu yaygın olarak kabul
edilmektedir (Bray ve Bettger, 1990; Prasad vd., 2007). Çinko antioksidan özellikleri
dolaylı bir antioksidan görevi görebileceğinden, "pro-antioksidan" terimi daha
uygundur (Maret, 2008). Bununla birlikte, çinko, sınırlı çinko konsantrasyonları
aralığında anti-oksidan fonksiyonları kolaylaştırır. Bu aralığın dışında, çinko bir pro-
oksidandır. Dolayısıyla da çinko eksikliği ve çinko aşırılığı oksidatif strese ve reaktif
51
oksijen türlerinin fazla üretilmesine neden olabilmektedir (Eide, 2011; Oteiza vd.,
1995).
Çinko eksikliğine bağlı oksidatif stresden sorumlu moleküler mekanizmalar, pro-
antioksidan çinko fonksiyonlarının sürdürülmesinin yetersizliğinden
kaynaklanmaktadır. Çinko eksikliğinde, genellikle çinkoyu bağlayan ve çinko
tamponlamasına katılan hücresel sülfidriller reaktif oksijen türleri oluşturmak üzere
bakır ve demir ile tepkimeye girerler. Buna ek olarak, çinko eksikliğinde antioksidan
savunmaya katılan MT ve enzimlerin uyarılması sonucu durumu daha da
kötüleştirmektedir. Yüksek çinko konsantrasyonlarında ise, çinko, tioredoksin ve
glutatyon redüktaz gibi antioksidan enzimleri ve reaktif oksijen türlerinde eş zamanlı
artışlarla birlikte mitokondriyal solunum zincirinin bileşenlerini (kompleks II ve III)
inhibe etmektedir. Ek olarak, yüksek, uzun süreli çinko takviyesi, bir pro-oksidan
olan ikincil bakır eksikliğine neden olabilmektedir (King vd., 2015).
Çinkonun anti-oksidan özelliği birçok insan çalışmaları ile ortaya koyulmaya
çalışılmıştır. Sağlıklı erişkin gönüllülere 8 hafta boyunca 45 mg çinko/gün olarak
yapılan çinko takviyesinin oksidatif stres biyobelirteçlerinde azalmaya yol
açmaktadır (Prasad, 2004). Orta yaşlı ya da yaşlı gönüllülere 12 ay boyunca 45 mg
çinko/gün verilmesi durumunda inflamatuar biyobelirteçlerde de azalma görülmüştür
(Prasad vd., 2007). Çinkonun oksidatif stres veya inflamasyon belirteçleri üzerindeki
ılımlı artış ve azalma hassasiyetini belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç
olduğu yapılan çalışmalarda ifade edilmektedir.
Çinko aynı zamanda çinko eksikliğinin DNA mutasyonları üzerindeki etkisiyle
kanser ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Birçok DNA onarım mekanizmasında
çinko önemli yer tutmaktadır. Örneğin, tümör süpresör proteini p53 düşük hücre içi
çinko ile işlev kaybına uğramaktadır ve DNA onarımı için sorun oluşturmaktadır
(Ho, 2004). Çinko eksikliğinde, oksidatif stres ve DNA hasarında artma meydana
gelmektedir. Bu durum, artan DNA hasarı ile birlikte yetersiz DNA onarım
mekanizmaları sinyali nedeniyle daha da kötüleşir. Deney hayvanları ve insanlar
üzerindeki çalışmalar, aşırı çinko eksikliğinin veya yetersizliğinin DNA onarımını
bozduğunu ve DNA zincir kırıklıklarının sayısını arttırdığını göstermektedir (Song
vd., 2009). Yapılan diğer çalışmalarda, Çinko eksikliğine bağlı olarak DNA zincir
52
kırıklarındaki artışın çinko alımındaki değişiklikler ile ortaya çıkmış gibi görünse de,
bu kırılmalar çinko eksikliği için spesifik bir biyobelirteç olamayacağını ifade
etmektedirler ve bu duruma ilaveten kolin, folat ve niasin'in yetersizliği durumunda
da DNA hasarında artış olabileceği vurgulanmaktadır (Kirkland, 2012; Zeisel, 2011).
Diğer bir araştırıcı, özetle, kişilerin çinko ve redoks durumu birbirleri ile bağlantılıdır
ve bu bağlantı durumunun ise hastalık etiyolojisi ve patogenezinde önemli bir faktör
olduğunu ileri sürmekle birlikte çinko durumunun oksidatif stres belirteçleri ile
değerlendirmesinde ikincil veya ikame faktörü olarak kabul edilmesi gerektiğini ve
birçok başka etkenin redoks durumunu değiştirdiğinden, bu oksidatif stres
biyobelirteçlerinin çinko durumunun değerlendirilmesi için spesifik olmadığını ifade
etmektedir (King vd., 2015).
Çizelge 5.2. Olası, yeni geliştirilen ve yararlı olmayan çinkonun biyolojik belirteçleri
(King vd., 2015).
Potansiyel Yeni geliştirilen Kullanışsız
Tanımlar Umut vaad eden biyolojik
belirteçler; ancak veriler,
popülasyonlarda çinko
yetersizliğini gösteren
spesifik cutoffların belirlenmesi için
yetersizdir
Çinko alınımı veya
durumu ile ilişkisi için
bazı teorik temellerin
bulunduğu
biyobelirteçler; ancak bu testler ilişkiyi
doğrulamada yetersizdir.
Çinko alımına
veya durumuna
sürekli olarak
bağlı olmayan
biyolojik belirteçler
Biyobelirteçler İdrar çinkosu Tırnak çinkosu Çinko-bağımlı
enzimler
Saç çinkosu Çinko-bağımlı proteinler Eritrosit ve
lökosit çinkosu
Nörodavranışsal
fonksiyonlar
Oksidatif stres ve DNA
bütünlüğü
Çinko kinetikleri
Tat keskinliği
Çeşitli popülasyonlardaki ve patofizyolojik olaylarda çinko beslenme düzeyini
yansıtan spesifik, hassas bir çinko biyobelirteçinin yetersizliği göz önüne alındığında,
yeni biyolojik belirteçleri tanımlamak veya doğrulamak için araştırmalara ihtiiyaç
duyulmaktadır. Halihazırda sıklıkla çinko durumunu belirlemede kullanılan
biyobelirteçler Çizelge 5.2.’de verilmiştir. Bu biyobelirteçlerin hepsi, çinko alımıyla
veya durumuyla teorik bir ilişkiye sahiptir, ancak çinko beslenmesindeki
değişikliklere duyarlılıkları ve özgüllükleri daha fazla çalışmaya ihtiyaç
duymaktadır.
53
6. ÖNERİLER
İnsan biyolojik sistemlerinde çinkonun tüm vücut sıvılarında ve ayrıca doku ve hücre
bölümlerinde bulunması, yapılan çalışmalarda elde edilen sonuçların birbirinden
farklılıklar arzetmesi ve yetersiz çinko alımının yanıtlarının karmaşıklığını
açıklamaktadır. Marjinal çinko eksikliği, çocuklarda fiziksel gelişim geriliği ile
bağlantılı olmasına rağmen, marjinal çinko alımına metabolik cevap konusunda
kapsamlı çalışmalar yalnızca erişkinlerde yürütülmüştür; çinko eksikliğine karşı daha
savunmasız olan bebekler ve çocuklar için karşılaştırılabilir bilgiler mevcut değildir.
Ayrıca, doku çinko konsantrasyonlarını ve düşük çinko alımı sonucunda fonksiyonel
işlevi sürdürmek için oluşan güçlü homeostatik mekanizmalar, çinko eksikliğini
tespit etme kabiliyetimizi ciddi şekilde etkilemektedir.
Günümüzde, popülasyonlara özgü çinko durumunu belirlemede aşağıdaki 3 gösterge
kullanılır. Bu üç gösterge; Çinko alımının tahmini ortalama ihtiyacın (EAR)
altındakilerin prevalansı, düşük PÇK'lilerin yüzde oranı ve yaşı 5'in altında olan
büyüme geriliği ile karakterize çocukların yüzdesidir. Klinik ortamda çinko
açısından beslenmeyi iyileştirmek için PÇK'lerden daha hassas olan çinko statüsünde
bir biyobelirteç gereklidir. Çeşitli potansiyel veya klinik olarak ortaya çıkan çinko
biyolojik belirteçleri tespit edilmiştir (örneğin saç, tırnak ve üriner çinko
konsantrasyonları, çinkoya bağımlı protein konsantrasyonları, çinko kinetik
belirteçleri ve DNA onarım işlevleri).
Yukarıda bahsedilen durumlar göz önünde bulundurulduğunda, bu biyolojik
belirteçlerin bireylerin veya popülasyonların çinko durumunu değerlendirmesi
amacıyla kullanılmasından önce önemli ölçüde araştırma yapılması gerekmekteve
yapılan araştırmaların sonucuna göre ve spesifik, hassas bir çinko biyobelirtecine
ihtiyaç vardır.
Günümüzde, ulusal veya uluslararası düzeyde koruyucu çinko programı faaliyetleri
yoktur. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ), yetersiz çinko beslenmesini önlemek için
tasarlanmış büyük ölçekli çinko grişimleri için yönergeler oluşturmamıştır.
Dolayısıyla, hassas, spesifik çinko biyobelirteçleri olmadan program planlamacıları,
koruyucu çinko müdahalelerine olan ihtiyaç ve etkilerini ölçmek için nasıl mücadele
ediyorlar. Buna ek olarak, en uygun dozun, doz sıklığının, farmasötik formununun,
54
dağıtım organizasyonların (örneğin, Çocuk Sağlığı Günleri, büyüme izleme veya
çoklu mikro besin tozlarının dağıtımı gibi), etkili olan dağıtım platformlarının
(örneğin, klinikler, sağlık merkezleri, pazar temelli erişim noktaları, topluluk
merkezleri veya sosyal koruma programları) uygulanabilirliği ve etkinliğinin
belirlenmesi gerekmektedir.
Çalışmamızdan elde ettiğimiz sonuçlara göre, ZnSO4'ün, kullanılan doza bağımlı
olarak güçlü bir genotoksik ajan olarak DNA hasarını indükleyebilmektedir. Ayrıca,
Zn ve Zn tuzlarının DNA hasarını uyarma etkisi göz önüne alındığında, çinko ve
çinko bileşiklerine maruz kalma dikkate alınması gerekmektedir.
55
KAYNAKLAR
Agren, M.S., 1990. Percutaneous Absorption of Zinc from Zinc Oxide Applied
Topically to İntact Skin in Man. Dermatologica,180, 36-39.
Agren, M.S.; Krusell, M.; Franzen, L. 1991. Release and Absorption Of Zinc from
Zincoxide and Zinc Sulfate in Open Wounds. Acta Dermato.-Venereol. 71,
330-333.
Akhtar, S. 2013. Zinc Status in South Asian Populations—an Update. Journal of
Health, Population, and Nutrition, 31(2), 139.
Alam, S.; Kelleher, S.L. 2012. Cellular Mechanisms of Zinc Dysregulation: A
Perspectiveon Zinc Homeostasis as an Etiological Factor in the
Development and Progression of Breast Cancer. Nutrients, 4, 875–903.
Alayash AI, Patel RP, and Cashon RE. 2001. Redox Reactions of Hemoglobin and
Myoglobin: Biological and Toxicological İmplications. Antioxid Redox
Signal 3: 313–327
Andreini C, Banci L, Bertini I, Rosato A. 2006. Counting the Zinc-Proteins Encoded
İn The Human Genome. J Proteome Res 5: 196–201,
Andreini C, Bertini I, Cavallaro G. 2011. Minimal Functional Sites Allow a
Classification of Zinc Sites in Proteins. PLoS One 6: e26325,
Andrews, G.K. 2000. Regulation of Metallothionein Gene Expression by Oxidative
Stress and Metal İons. Biochem. Pharmacol., 59, 95–104.
Arcasoy A. 2002. Çinko ve çinko eksikliği. Ankara Talasemi Derneği Yayınları; 2.
Baskı,1-23. 2.
Aydemir, T.B.; Chang, S.M. 2012. Zinc Transporter ZIP14 Functions in Hepatic
Zinc, İron and Glucose Homeostasis During The İnnate İmmune Response
(Endotoxemia). PLoS ONE, 7, e48679.
Azqueta, A. Shaposhnikov, S. Collins, A.R., 2009. DNA Oxidation: Investigating İts
Key Role in Environmental Mutagenesis with The Comet Assay. Mutation
Research, 674, 101-108.
Bao, B., Prasad, A. S., Beck, F. W., Fitzgerald, J. T., Snell, D., Bao, G. W., Cardozo,
L. J. 2010. Zinc decreases C-Reactive Protein, Lipid Peroxidation, and
Inflammatory Cytokines In Elderly Subjects: A Potential Implication Of
Zinc as an Atheroprotective Agent–. The American Journal of Clinical
Nutrition, 91(6), 1634-1641
Belcher, J. D., Chen, C., Nguyen, J., Zhang, P., Abdulla, F., Nguyen, P., Vercellotti,
G. M. 2017. Control of Oxidative Stress and Inflammation in Sickle Cell
Disease with the Nrf2 Activator Dimethyl Fumarate.Antioxidants Redox
Signaling, 26(14), 748-762.
56
Bentley, P. J., Grubb, B. R. 1991. Experimental Dietary Hyperzincemia Tissue
Disposition of Excess Zinc in Rabbits. Trace Elements in Medicine, 8(4),
202-207
Berg, J. M., Shi, Y. 1996. The Galvanization of Biology: a Growing Appreciation for
the Roles of Zinc. Science, 271(5252), 1081-1085.
Bertinato, J., Simpson, J. R., Sherrard, L., Taylor, J., Plouffe, L. J., Van Dyke, D.,
Vresk, L. 2013. Zinc Supplementation Does Not Alter Sensitive Biomarkers
of Copper Status in Healthy Boys. The Journal of Nutrition, 143(3), 284-
289.
Bhutta, Z. A., Bird, S. M., Black, R. E., Brown, K. H., Gardner, J. M., Hidayat, A.,
Rosado, J. L. 2000. Therapeutic Effects of Oral Zinc in Acute and Persistent
Diarrhea in Children in Developing Countries: Pooled Analysis of
Randomized Controlled Trials. The American Journal of Clinical Nutrition,
72(6), 1516-1522.
Biagiotti, S., Menotta, M., Orazi, S., Spapperi, C., Brundu, S., Fraternale, A.,
Magnani, M. 2016. Dexamethasone İmproves Redox State in Ataxia
Telangiectasia Cells by Promoting an NRF2‐Mediated Antioxidant
Response. The FEBS Journal, 283(21), 3962-3978.
Bitanihirwe, B. K., Cunningham, M. G. 2009. Zinc: The Brain's Dark Horse.
Synapse, 63(11), 1029-1049.
Bonaventura, P., Benedetti, G., Albarède, F., Miossec, P. 2015. Zinc and İts Role in
İmmunity and İnflammation. Autoimmunity Reviews, 14(4), 277-285.
Bostanci, Z., Mack Jr, R. P., Lee, S., Soybel, D. I., Kelleher, S. L. 2015. Paradoxical
Zinc Toxicity and Oxidative Stress in the Mammary Gland During Marginal
Dietary Zinc Deficiency. Reproductive Toxicology, 54, 84-92.
Bray, T. M., Bettger, W. J. 1990. The physiological Role of Zinc as an Antioxidant.
Free Radical Biology and Medicine, 8(3), 281-291.
Briefel, R.R., Bialostosky, K., Kennedy-Stephenson, J., McDowell, M.A., Ervin,
R.B., Wright, J. D. 2000. Zinc İntake of the US Population: Findings from
The Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988–
1994. The Journal of Nutrition, 130(5), 1367S-1373S.
Brown, A. M., Kristal, B. S., Effron, M. S., Shestopalov, A. I., Ullucci, P. A., Sheu,
K. F. R., ... Cooper, A. J. 2000. Zn2+ İnhibits α-ketoglutarate-Stimulated
Mitochondrial Respiration and the İsolated α-ketoglutarate Dehydrogenase
Complex. Journal of Biological Chemistry, 275(18), 13441-13447.
Brown, J. L. 1988. Zinc Fume Fever. The British journal of Radiology, 61(724), 327-
329.
Brown, K. H., Peerson, J. M., Allen, L. H. 1998. Effect of Zinc Supplementation on
Children Growth: a Meta-Analysis of İntervention Trials. In Role of Trace
Elements for Health Promotion and Disease Prevention (Vol. 54, pp. 76-83).
Karger Publishers.
57
Brown, M. A., Thom, J. V., Orth, G. L., Cova, P., Juarez, J. 1964. Food Poisoning
İnvolving Zinc Contamination. Archives of Environmental Health: An
International Journal, 8(5), 657-660.
Brownlee, N. R., Huttner, J. J., Panganamala, R. V., Cornwell, D. G. 1977. Role of
Vitamin E in Glutathione-İnduced Oxidant Stress: Methemoglobin, Lipid
Peroxidation, and Hemolysis. Journal of Lipid Research, 18(5), 635-644.
Bryan, S., Baregzay, B., Spicer, D., Singal, P. K., Khaper, N. 2013. Redox-
İnflammatory Synergy in The Metabolic Syndrome. Canadian journal of
Physiology and Pharmacology, 91(1), 22-30.
Bunn, H. F., Jandl, J. H. 1968. Exchange of Heme Among Hemoglobins and
Between Hemoglobin and Albumin. Journal of Biological Chemistry,
243(3), 465-475.
Butterfield, D. A., Di Domenico, F., Barone, E. 2014. Elevated Risk of Type 2
Diabetes for Development of Alzheimer Disease: A Key Role for Oxidative
Stress in Brain. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of
Disease, 1842(9), 1693-1706.
Chasapis, C. T., Loutsidou, A. C., Spiliopoulou, C. A., Stefanidou, M. E. 2012. Zinc
and Human Health: an Update. Archives of Toxicology, 86(4), 521-534.
Chimienti, F., Aouffen, M., Favier, A., Seve, M. 2003. Zinc Homeostasis-Regulating
Proteins: New Drug Targets for Triggering Cell Fate. Current Drug Targets,
4(4), 323-338.
Clayton, P. T. 2017. Inherited Disorders of Transition Metal Metabolism: An
Update. Journal of Inherited Metabolic Disease, 40(4), 519-529.
Clegg, M. S., Hanna, L. A., Niles, B. J., Momma, T. Y., Keen, C. L. 2005. Zinc
Deficiency‐İnduced Cell Death. IUBMB Life, 57(10), 661-669.
Clemens, M. R., Waller, H. D. 1987. Lipid Peroxidation in Erythrocytes. Chemistry
and Physics of Lipids, 45(2-4), 251-268.
Collins, A. R. 2004. The Comet Assay for DNA Damage and Repair. Molecular
Biotechnology, 26(3), 249.
Cousins, R. J. 1985. Absorption, Transport, and Hepatic Metabolism of Copper and
Zinc: Special Reference to Metallothionein and Ceruloplasmin.
Physiological Reviews, 65(2), 238-309.
Cousins, R. J. 1989. Systemic Transport of Zinc. In Zinc in Human Biology (pp. 79-
93). Springer, London.
Coyle, P., Philcox, J. C., Carey, L. C., Rofe, A. M. 2002. Metallothionein: The
Multipurpose Protein. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 59(4),
627-647.
Fernandes Cruz, J. B., Freire Soares, H. 2011. Uma Revisão Sobre O Zinco. Ensaios
e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde, 15(1), 207-222.
58
Cruz, K. J. C., de Oliveira, A. R. S., do Nascimento Marreiro, D. 2015. Antioxidant
Role of Zinc in Diabetes Mellitus. World journal of Diabetes, 6(2), 333-337.
Cui, L., Takagi, Y., Sando, K., Wasa, M., Okada, A. 2000. Nitric Oxide Synthase
İnhibitor Attenuates İnflammatory Lesions in the Skin of Zinc-Deficient
Rats. Nutrition, 16(1), 34-41.
Cui, L., Takagi, Y., Wasa, M., Sando, K., Khan, J., Okada, A. 1999. Nitric Oxide
Synthase İnhibitor Attenuates İntestinal Damage İnduced by Zinc
Deficiency in Rats. The Journal of Nutrition, 129(4), 792-798.
Cummings, J. E., Kovacic, J. P. 2009. The Ubiquitous Role of Zinc in Health and
Disease. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 19(3), 215-
240.
Dikilitaş M, Koçyiğit A. 2010. Canlilarda “Tek Hücre Jel Elektroforez” Yöntemi İle
DNA Hasar Analizi (Teknik Not): Comet Analiz Yöntemi. Journal Of
Agriculture Faculty Of Harran University, 14, 77-82.
Dinçer Y, Kankaya S. 2010. DNA Hasarının Belirlenmesinde Comet Assay. Turkiye
Klinikleri Journal of Medical Sciences, 30(4), 1365-73
Dineley, K. E., Votyakova, T. V., Reynolds, I. J. 2003. Zinc İnhibition of Cellular
Energy Production: İmplications for Mitochondria and Neurodegeneration.
Journal of Neurochemistry, 85(3), 563-570.
Duranton, C., Huber, S. M., Lang, F. 2002. Oxidation İnduces a Cl−‐Dependent
Cation Conductance in Human Red Blood Cells. The Journal of Physiology,
539(3), 847-855.
Eder, H. A., Finch, C., McKee, R. W. 1949. Congenital Methemoglobinemia. A
Clinical and Biochemical Study of a Case. The Journal of Clinical
İnvestigation, 28(2), 265-272.
Eide, D. J. 2011. The Oxidative Stress of Zinc Deficiency. Metallomics, 3(11), 1124-
1129.
Eide, D.J., 2006. Zinc Transporters and the Cellular Trafficking of Zinc. Biochim
Biophys Acta, 1763(7), 711–722.
Feng, B., Ruiz, M. A., Chakrabarti, S. 2012. Oxidative-Stress-İnduced Epigenetic
Changes in Chronic Diabetic Complications. Canadian journal of
Physiology and Pharmacology, 91(3), 213-220.
Feng, P., Li, T., Guan, Z., Franklin, R. B., Costello, L. C. 2008. The involvement of
Bax in Zinc-İnduced Mitochondrial Apoptogenesis in Malignant Prostate
Cells. Molecular Cancer, 7(1), 25.
Feng, P., Li, T. L., Guan, Z. X., Franklin, R. B., Costello, L. C. 2002. Direct Effect
of Zinc on Mitochondrial Apoptogenesis in Prostate Cells. The Prostate,
52(4), 311-318.
Fidan, A. F. 2008. DNA Hasar Tespitinde Tek Hücre Jel Elektroforezi. Afyon
Kocatepe Üniversitesi Fen Ve Mühendislik Bilimleri Dergisi, 8(1), 41-52.
59
Formigari, A., Irato, P., Santon, A. 2007. Zinc, Antioxidant Systems and
Metallothionein in Metal Mediated-Apoptosis: Biochemical and
Cytochemical Aspects. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:
Toxicology Pharmacology, 146(4), 443-459.
Foster, M., Chu, A., Petocz, P., Samman, S. 2014. Zinc Transporter Gene Expression
and Glycemic Control in Post-Menopausal Women with Type 2 Diabetes
Mellitus. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 28(4), 448-
452.
Foster, M., Samman, S. 2010. Zinc and Redox Signaling: Perturbations Associated
with Cardiovascular Disease and Diabetes Mellitus. Antioxidants redox
signaling, 13(10), 1549-1573.
Fox, M.R.S. 1989. Zinc Excess. In Zinc in Human Biology; Mills, C.F., Ed.;
Springer Verlag: New York, NY, USA,; pp. 366-368.
Fraker, P. J., Telford, W. G. 1997. A Reappraisal of the Role of Zinc in Life and
Death Decisions of Cells. Proceedings of the society for Experimental
Biology and Medicine, 215(3), 229-236.
Fukamachi, Y., Karasaki, Y., Sugiura, T., Itoh, H., Abe, T., Yamamura, K., Higashi,
K. 1998. Zinc Suppresses Apoptosis of U937 Cells İnduced By Hydrogen
Peroxide Through An İncrease of the Bcl-2/Bax ratio. Biochemical and
Biophysical Research Communications, 246(2), 364-369.
Fung, E. B., Gildengorin, G., Talwar, S., Hagar, L., Lal, A. 2015. Zinc Status Affects
Glucose Homeostasis and İnsulin Secretion in Patients with Thalassemia.
Nutrients, 7(6), 4296-4307.
Furuta, T., Ohshima, C., Matsumura, M., Takebayashi, N., Hirota, E., Mawaribuchi,
T., Nagasawa, K. 2016. Oxidative Stress Upregulates Zinc Uptake Activity
Via Zrt/Irt-like Protein 1 (ZIP1) in Cultured Mouse Astrocytes. Life
Sciences, 151, 305-312.
Galvao, T. F., Pontes, R. F., Silva, M. T., Pereira, M. G. 2013. Zinc Supplementation
for Treating Diarrhea in Children: a Systematic Review and Meta-Analysis.
Revista Panamericana de Salud Publica, 33, 370-377.
Ghosh, S., Adisa, O. A., Chappa, P., Tan, F., Jackson, K. A., Archer, D. R., Ofori-
Acquah, S. F. 2013. Extracellular Hemin Crisis Triggers Acute Chest
Syndrome in Sickle Mice. The Journal of Clinical İnvestigation, 123(11),
4809-4820.
Gladwin, M. T., Shelhamer, J. H., Schechter, A. N., Pease-Fye, M. E., Waclawiw, M.
A., Panza, J. A., Cannon, R. O. 2000. Role of Circulating Nitrite and S-
Nitrosohemoglobin in the Regulation of Regional Blood Flow in Humans.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(21), 11482-11487.
Grzywacz, A., Gdula-Argasińska, J., Muszyńska, B., Tyszka-Czochara, M.,
Librowski, T., Opoka, W. 2015. Metal Responsive Transcription Factor 1
(MTF-1) Regulates Zinc Dependent Cellular Processes at The Molecular
Level. Acta Biochimica Polonica, 62(3),491-498.
60
Guo, C. H., Wang, C. L. 2013. Effects of Zinc Supplementation on Plasma
Copper/Zinc Ratios, Oxidative Stress, and İmmunological Status in
Hemodialysis Patients. International journal of medical sciences, 10(1), 79-
89.
Günther, V., Davis, A. M., Georgiev, O., Schaffner, W. 2012. A Conserved Cysteine
Cluster, Essential for Transcriptional Activity, Mediates Homodimerization
of Human Metal-Responsive Transcription Factor-1 (MTF-1). Biochimica
et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1823(2), 476-483.
Günther, V., Lindert, U., Schaffner, W. 2012. The Taste of Heavy Metals: Gene
Regulation by MTF-1. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular
Cell Research, 1823(9), 1416-1425.
Ha, K. N., Chen, Y., Cai, J., Sternberg, P. 2006. Increased Glutathione Synthesis
Through an ARE-Nrf2–Dependent Pathway By Zinc in The RPE:
İmplication for Protection Against Oxidative Stress. Investigative
Ophthalmology Visual Science, 47(6), 2709-2715.
Haase, H., Maret, W. 2003. Intracellular Zinc Fluctuations Modulate Protein
Tyrosine Phosphatase Activity in İnsulin/İnsulin-Like Growth Factor-1
Signaling. Experimental Cell Research, 291(2), 289-298.
Haase, H., Wätjen, W., Beyersmann, D. 2001. Zinc İnduces Apoptosis That Can Be
Suppressed by Lanthanum in C6 Rat Glioma Cells. Biological
chemistry, 382(8), 1227-1234.
Habib, S. A., Saad, E. A., Elsharkawy, A. A., Attia, Z. R. 2015. Pro-inflammatory
Adipocytokines, Oxidative Stress, İnsulin, Zn and Cu: Interrelations with
Obesity in Egyptian Non-Diabetic Obese Children and Adolescents.
Advances in Medical Sciences, 60(2), 179-185.
Liu-Sheng, H., Xiao-Shan, Y., De-Chang, W. 1991. Age-Dependent Variation of
zinc-65 Metabolism in LACA Mice. International Journal of Radiation
Biology, 60(6), 907-916.
Higashi, Y., Segawa, S., Matsuo, T., Nakamura, S., Kikkawa, Y., Nishida, K.,
Nagasawa, K. 2011. Microglial Zinc Uptake Via Zinc Transporters İnduces
ATP Release and The Activation of Microglia. Glia, 59(12), 1933-1945.
Ho, E. 2004. Zinc Deficiency, DNA Damage and Cancer Risk. The Journal of
Nutritional Biochemistry, 15(10), 572-578.
Homma, K., Fujisawa, T., Tsuburaya, N., Yamaguchi, N., Kadowaki, H., Takeda, K.,
Ichijo, H. 2013. SOD1 as a Molecular Switch for İnitiating the Homeostatic
ER Stress Response Under Zinc Deficiency. Molecular Cell, 52(1), 75-86.
Homma, S., Jones, R., Qvist, J., Zapol, W. M., Reid, L. 1992. Pulmonary Vascular
Lesions in The Adult Respiratory Distress Syndrome Caused by İnhalation
of Zinc Chloride Smoke: a Morphometric Study. Human Pathology, 23(1),
45-50.
61
Hotz, C., Lowe, N. M., Araya, M., Brown, K. H. 2003. Assessment of The Trace
Element Status of İndividuals and Populations: the Example of Zinc and
Copper. The Journal of Nutrition, 133(5), 1563S-1568S.
Jackson, M. J. 1989. Physiology of Zinc: General Aspects. In Zinc in Human
Biology (pp. 1-14). Springer, London.
Jain, S. K. 1985. In Vivo Externalization of Phosphatidylserine and
Phosphatidylethanolamine in The Membrane Bilayer and
Hypercoagulability By The Lipid Peroxidation of Erythrocytes in Rats. The
Journal of clinical investigation, 76(1), 281-286.
Jansen, J., Rosenkranz, E., Overbeck, S., Warmuth, S., Mocchegiani, E., Giacconi,
R., Rink, L. 2012. Disturbed Zinc Homeostasis in Diabetic Patients by in
Vitro and in Vivo Analysis of İnsulinomimetic Activity of Zinc. The Journal
of Nutritional Biochemistry, 23(11), 1458-1466.
Jenner A, Ren M, Rajendran R, Ning P, Huat BT, Watt F, Halliwell B 2007. Zinc
Supplementation İnhibits Lipid Peroxidation and The Development of
Atherosclerosis in Rabbits Fed A High Cholesterol Diet. Free Radic Biol
Med 42(4):559–566
Jenner, A., Ren, M., Rajendran, R., Ning, P., Huat, B. T. K., Watt, F., Halliwell, B.
2007. Zinc Supplementation İnhibits Lipid Peroxidation and The
Development of Atherosclerosis in Rabbits Fed a High Cholesterol Diet.
Free Radical Biology and Medicine, 42(4), 559-566.
Johnson, R. M., Goyette Jr, G., Ravindranath, Y., Ho, Y. S. 2005. Hemoglobin
Autoxidation and Regulation of Endogenous H2O2 Levels in Erythrocytes.
Free Radical Biology and Medicine, 39(11), 1407-1417.
Jurowski, K., Szewczyk, B., Nowak, G., Piekoszewski, W. 2014. Biological
Consequences of Zinc Deficiency in The Pathomechanisms of Selected
Diseases. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 19(7), 1069-
1079.
Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. 2015. The Physiological,
Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc
Homeostasis and Metabolism. Physiological Reviews, 95(3), 749-784.
Kay, M. M., Bosman, G. J., Shapiro, S. S., Bendich, A., Bassel, P. S. 1986.
Oxidation as a Possible Mechanism of Cellular Aging: Vitamin E
Deficiency Causes Premature Aging and IgG Binding to Erythrocytes.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 83(8), 2463-2467.
Keen, C.L., Gershwin, M.E., 1990. Zinc Deficiency and Immune Function. Annu
Rev Nutr, 10, 415–431
Kenny, F., Sriram, K., Hammond, J. B. 1989. Clinical Zinc Deficiency During
Adequate Enteral Nutrition. Journal of the American College of Nutrition,
8(1), 83-85.
62
Kim, Y. H., Kim, E. Y., Gwag, B. J., Sohn, S., Koh, J. Y. 1999. Zinc-İnduced
Cortical Neuronal Death with Features of Apoptosis and Necrosis:
Mediation by Free Radicals. Neuroscience, 89(1), 175-182.
Kim, Y. H., Koh, J. Y. 2002. The Role of NADPH Oxidase and Neuronal Nitric
Oxide Synthase in Zinc-İnduced Poly (ADP-ribose) Polymerase Activation
and Cell Death in Cortical Culture. Experimental neurology, 177(2), 407-
418.
King, J. C., Brown, K. H., Gibson, R. S., Krebs, N. F., Lowe, N. M., Siekmann, J.
H., Raiten, D. J. 2015. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)—
Zinc Review–5. The Journal of nutrition, 146(4), 858S-885S.
Kirkland, J. B. 2012. Niacin Requirements for Genomic Stability. Mutation
Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 733(1),
14-20.
Kirschke, C. P., Huang, L. 2003. ZnT7, A Novel Mammalian Zinc Transporter,
Accumulates Zinc in the Golgi Apparatus. Journal of Biological Chemistry,
278(6), 4096-4102.
Kreżel, A., Maret, W. 2007. Dual Nanomolar and Picomolar Zn (II) Binding
Properties of Metallothionein. Journal of the American Chemical Society,
129(35), 10911-10921.
Krishna, S. S., Majumdar, I., Grishin, N. V. 2003. Structural Classification of Zinc
Fingers: Survey and Summary. Nucleic Acids Research, 31(2), 532-550.
Kuhn, V., Diederich, L., Keller IV, T. S., Kramer, C. M., Lückstädt, W., Panknin, C.,
Cortese-Krott, M. M. 2017. Red Blood Cell Function and Dysfunction:
Redox Regulation, Nitric Oxide Metabolism, Anemia. Antioxidants Redox
Signaling, 26(13), 718-742.
Laity, J. H., Andrews, G. K. 2007. Understanding the Mechanisms OF Zinc-Sensing
by Metal-Response Element Binding Transcription Factor-1 (MTF-1).
Archives of Biochemistry And Biophysics, 463(2), 201-210.
Lansdown, A. B. G. 1991. Interspecies Variations in Response to Topical
Application of Selected Zinc Compounds. Food and Chemical Toxicology,
29(1), 57-64.
Lazzerini M, Ronfani L. 2013. Oral Zinc for Treating Diarrhoea in Children.
Cochrane Database Syst Rev;1:CD005436
Lech, T., Sadlik, J. K. 2011. Zinc in Postmortem Body Tissues and Fluids. Biological
Trace Element Research, 142(1), 11-17.
Liang, D., Xiang, L., Yang, M., Zhang, X., Guo, B., Chen, Y., Cao, J. 2013. ZnT7
Can Protect MC3T3-E1 Cells From Oxidative Stress-İnduced Apoptosis Via
PI3K/Akt and MAPK/ERK Signaling Pathways. Cellular Signalling, 25(5),
1126-1135.
Liang, T., Zhang, Q., Sun, W., Xin, Y., Zhang, Z., Tan, Y., Cheng, M. 2015. Zinc
Treatment Prevents Type 1 Diabetes-İnduced Hepatic Oxidative Damage,
63
Endoplasmic Reticulum Stress, and Cell Death, and Even Prevents Possible
Steatohepatitis in The OVE26 Mouse Model: Important Role of
Metallothionein. Toxicology Letters, 233(2), 114-124.
Lichten, L. A., Cousins, R. J. 2009. Mammalian Zinc Transporters: Nutritional and
Physiologic Regulation. Annual Review of Nutrition, 29, 153-176.
Lima, V. B. D. S., Sampaio, F. D. A., Bezerra, D. L. C., Moita Neto, J. M., Marreiro,
D. D. N. 2011. Parameters of Glycemic Control and Their Relationship with
Zinc Concentrations in Blood and with Superoxide Dismutase Enzyme
Activity in Type 2 Diabetes Patients. Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia Metabologia, 55(9), 701-707.
Llobet, J. M., Domingo, J. L., Colomina, M. T., Mayayo, E., Corbella, J. 1988.
Subchronic Oral Toxicity of Zinc in Rats. Bulletin of Environmental
Contamination and Toxicology, 41(1), 36-43.
Magalhães, R. N., Araújo, C. G. B., Sousa Lima, V. B., Moita Neto, J. M., Nogueira,
N. N., Marreiro, D. N. 2011. Nutritional Status of Zinc and Activity
Superoxide Dismutase in Chronic Renal Patients Undergoing Hemodialysis.
Nutrición Hospitalaria, 26(6), 1456-1461.
Maret, W. 2008. Metallothionein Redox Biology İn The Cytoprotective and
Cytotoxic Functions of Zinc. Experimental Gerontology, 43(5), 363-369.
Maret, W. 2012. New Perspectives of Zinc Coordination Environments in Proteins.
Journal of İnorganic Biochemistry, 111, 110-116.
Maret, W. 2004. Zinc and Sulfur: a Critical Biological Partnership. Biochemistry,
43(12), 3301-3309.
Maret, W. 2013. Zinc Biochemistry: From a Single Zinc Enzyme to a Key Element
of Life. Advances in Nutrition, 4(1), 82-91.
Maret, W. 2008. Metallothionein Redox Biology in The Cytoprotective and
Cytotoxic Functions of Zinc. Experimental Gerontology, 43(5), 363-369.
Maret, W. 2006. Zinc Coordination Environments in Proteins as Redox Sensors and
Signal Transducers. Antioxidants Redox Signaling, 8(9-10), 1419-1441.
Maret, W., Jacob, C., Vallee, B. L., Fischer, E. H. 1999. Inhibitory Sites in Enzymes:
Zinc Removal and Reactivation by Thionein. Proceedings of the National
Academy of Sciences, 96(5), 1936-1940.
Maret, W. 2013. Zinc Biochemistry: from a Single Zinc Enzyme to a Key Element of
Life. Advances in Nutrition, 4(1), 82-91.
Maret, W., Krężel, A. 2007. Cellular Zinc and Redox Buffering Capacity of
Metallothionein/Thionein in Health and Disease. Molecular Medicine, 13(7-
8), 371-375.
Maret,W.; Sandstead, H.H. 2006. Zinc Requirements and the Risks and Benefits of
Zinc Supplementation. J. Trace Elem. Med. Biol. 20, 3–18.
64
Marreiro, D. D. N., Cruz, K. J. C., Morais, J. B. S., Beserra, J. B., Severo, J. S., de
Oliveira, A. R. S. 2017. Zinc and Oxidative Stress: Current
Mechanisms. Antioxidants, 6(2), 24.
Martins, L. M., de Oliveira, A. R. S., Cruz, K. J. C., de Araújo, C. G. B., de Oliveira,
F. E., de Souza, G. S., Marreiro, D. D. N. 2014. Influence of Cortisol on
Zinc Metabolism in Morbidly Obese Women. Nutr. Hosp, 29, 57-63.
McLaughlin, B., Pal, S., Tran, M. P., Parsons, A. A., Barone, F. C., Erhardt, J. A.,
Aizenman, E. 2001. p38 Activation is Required Upstream of Potassium
Current Enhancement and Caspase Cleavage in Thiol Oxidant-İnduced
Neuronal Apoptosis. Journal of Neuroscience, 21(10), 3303-3311.
Miao, X., Wang, Y., Sun, J., Sun, W., Tan, Y., Cai, L., Wang, Y. 2013. Zinc Protects
Against Diabetes-İnduced Pathogenic Changes in The Aorta: Roles of
Metallothionein and Nuclear Factor (erythroid-derived 2)-like 2.
Cardiovascular Diabetology, 12(1), 54.
Miller, J., McLachlan, A. D., Klug, A. 1985. Repetitive Zinc‐Binding Domains in the
Protein Transcription Factor IIIA from Xenopus Oocytes. The EMBO
Journal, 4(6), 1609-1614.
Mills, D. A., Schmidt, B., Hiser, C., Westley, E., Ferguson-Miller, S. 2002.
Membrane Potential-Controlled Inhibition of Cytochromec Oxidase by
Zinc. Journal of Biological Chemistry, 277(17), 14894-14901.
Morris, C. R., Morris Jr, S. M., Hagar, W., Van Warmerdam, J., Claster, S., Kepka-
Lenhart, D., Vichinsky, E. P. 2003. Arginine Therapy: A New Treatment
For Pulmonary Hypertension in Sickle Cell Disease?. American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine, 168(1), 63-69.
de Oliveira, A. R. S., Cruz, K. J. C., Morais, J. B. S., Severo, J. S., De Freitas, T. E.
C., Veras, A. L., do Nascimento Marreiro, D. 2015. Magnesium Status and
İts Relationship with C-reactive Protein in Obese Women. Biological Trace
Element Research, 168(2), 296-302.
Oteiza, P. I., Olin, K. L., Fraga, C. G., Keen, C. L. 1995. Zinc Deficiency Causes
Oxidative Damage to Proteins, Lipids and DNA in Rat Testes. The Journal
of Nutrition, 125(4), 823-829.
Oteiza, P. I. 2012. Zinc and The Modulation of Redox Homeostasis. Free Radical
Biology and Medicine, 53(9), 1748-1759.
Oteiza, P. I., Clegg, M. S., Zago, M. P., Keen, C. L. 2000. Zinc Deficiency İnduces
Oxidative Stress and AP-1 Activation in 3T3 cells. Free Radical Biology
and Medicine, 28(7), 1091-1099.
Özcelik, D., Nazıroglu, M., Tunçdemir, M., Çelik, Ö., Öztürk, M., Flores-Arce, M.
F. (2012). Zinc Supplementation Attenuates Metallothionein and Oxidative
Stress Changes in Kidney Of Streptozotocin-İnduced Diabetic Rats.
Biological Trace Element Research, 150(1-3), 342-349.
Özçelik D. 1998. Bakır, Çinko, Kurşun ve Kadmiyum Katkılı Besinlerle Beslenen
Civcivlerin Kan, Serum ve Değişik Dokularındaki Element
65
Konsantrasyonlarının Ölçülmesi ve Besi Perfomansın Etkilerinin
Saptanması. Uzmanlık Tezi, İstanbul.
Pagani, A., Villarreal, L., Capdevila, M., Atrian, S., 2007. The Saccha- Romyces
Cerevisiae Crs5 Metallothionein Metal-Binding Abilities and Its Role in
The Response to Zinc Overload. Mol Microbiol, 1, 256–269.
Perry, D. K., Smyth, M. J., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S., Duriez, P., Poirier, G.
G., Hannun, Y. A. 1997. Zinc is a Potent İnhibitor of the Apoptotic
Protease, Caspase-3 a Novel Target for Zinc in the İnhibition of Apoptosis.
Journal of Biological Chemistry, 272(30), 18530-18533.
Pilch, S. M., Senti, F. R. 1984. Assessment of the Folate Nutritional Status of the US
Population Based on Data Collected in the Second National Health and
Nutrition Examination Survey, 1976-1980/edited by Frederic R. Senti,
Susan M. Pilch.
Pisoschi, A. M., Pop, A. 2015. The Role of Antioxidants in The Chemistry of
Oxidative Stress: A review. European Journal of Medicinal Chemistry, 97,
55-74.
Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. 2010. The Essential Toxin: İmpact of Zinc on
human health. International journal of Environmental Research and Public
Health, 7(4), 1342-1365.
Prabasheela, B., Singh, A. K., Fathima, A., Pragulbh, K., Deka, N. J., Kumar, R.
2011. Association Between Antioxidant Enzymes and Breast Cancer.
Recent Research in Science and Technology, 3(11), 93-95.
Prasad, A. S., Bao, B., Beck, F. W., Kucuk, O., Sarkar, F. H. 2004. Antioxidant
Effect of Zinc in Humans. Free Radical Biology and Medicine, 37(8), 1182-
1190.
Prasad, A. S., Beck, F. W., Bao, B., Fitzgerald, J. T., Snell, D. C., Steinberg, J. D.,
Cardozo, L. J. 2007. Zinc Supplementation Decreases İncidence of
İnfections in The Elderly: Effect of Zinc On Generation of Cytokines And
Oxidative Stress–. The American Journal of Clinical Nutrition, 85(3), 837-
844.
Prasad, A.S., 2009. Zinc: Role in Immunity, Oxidative Stress and Chronic
Inflammation. Curr Opinion Clin Nutr Metab Care, 12, 646–652.
Prasad, A. S., Bao, B., Beck, F. W., Sarkar, F. H. 2011. Zinc-Suppressed
İnflammatory Cytokines by İnduction of A20-Mediated İnhibition of
Nuclear Factor-κB. Nutrition, 27(7), 816-823.
Raiten, D. J., Combs, G. F. 2015. Directions in Nutritional Assessment. Sight and
Life, 29, 39-44.
Ranasinghe, P., Pigera, S., Galappatthy, P., Katulanda, P., Constantine, G. R. 2015.
Zinc and Diabetes Mellitus: Understanding Molecular Mechanisms and
Clinical İmplications. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 23(1), 44.
66
Risbano, M. G., Kanias, T., Triulzi, D., Donadee, C., Barge, S., Badlam, J., Gladwin,
M. T. 2015. Effects of Aged Stored Autologous Red Blood Cells on Human
Endothelial Function. American Journal of Respiratory and Critical Care
Medicine, 192(10), 1223-1233.
ROHRS, L. C. 1957. Metal-Fume Fever From İnhaling Zinc Oxide. AMA Archives
of Internal Medicine, 100(1), 44-49.
Roshanravan, N., Alizadeh, M., Hedayati, M., Asghari-Jafarabadi, M., Alamdari, N.
M., Anari, F., Tarighat-Esfanjani, A. 2015. Effect of Zinc Supplementation
on İnsulin Resistance, Energy and Macronutrients İntakes İn Pregnant
Women with İmpaired Glucose Tolerance. Iranian Journal of Public Health,
44(2), 211-217.
Rostan, E. F., DeBuys, H. V., Madey, D. L., Pinnell, S. R. 2002. Evidence
Supporting Zinc as an İmportant Antioxidant for Skin. International Journal
of Dermatology, 41(9), 606-611.
Ruz, M., Carrasco, F., Rojas, P., Codoceo, J., Inostroza, J., Basfi-Fer, K., López, G.
2013. Zinc as a Potential Coadjuvant in Therapy for Type 2 Diabetes. Food
and Nutrition Bulletin, 34(2), 215-221.
Schrier, S. L., Centis, F., Verneris, M., Ma, L., Angelucci, E. 2003. The Role of
Oxidant İnjury in the pathophysiology of Human Thalassemias. Redox
Report, 8(5), 241-245.
Scott, D. A., Fisher, A. M. 1938. The insulin and the zinc content of normal and
diabetic pancreas. The Journal of Clinical İnvestigation, 17(6), 725-728.
Scott, B. J., Bradwell, A. R. 1983. Identification of the Serum Binding Proteins for
İron, Zinc, Cadmium, Nickel, and Calcium. Clinical Chemistry, 29(4), 629-
633.
Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. 2007. Mechanism and
Regulation of Cellular Zinc Transport. Molecular Medicine, 13(7-8), 337-
343.
Sensi, S. L., Paoletti, P., Koh, J. Y., Aizenman, E., Bush, A. I., Hershfinkel, M. 2011.
The Neurophysiology and Pathology of Brain Zinc. Journal of
Neuroscience, 31(45), 16076-16085.
Sheline, C. T., Behrens, M. M., Choi, D. W. 2000. Zinc-İnduced Cortical Neuronal
Death: Contribution of Energy Failure Attributable to Loss of NAD+ and
İnhibition of Glycolysis. Journal of Neuroscience, 20(9), 3139-3146.
Song, Y., Leonard, S. W., Traber, M. G., Ho, E. 2009. Zinc Deficiency Affects DNA
Damage, Oxidative Stress, Antioxidant Defenses, and DNA Repair in Rats.
The Journal of Nutrition, 139(9), 1626-1631.
Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. 1997. Biochemical Characteristics of Caspases-3,-
6,-7, and-8. Journal of Biological Chemistry, 272(41), 25719-25723.
Suliburska, J., Bogdanski, P., Szulinska, M., Pupek-Musialik, D., Jablecka, A. 2014.
Changes in Mineral Status are Associated with İmprovements in İnsulin
67
Sensitivity in Obese Patients Following L-arginine Supplementation.
European journal of Nutrition, 53(2), 387-393.
Sun, Q., Li, Q., Zhong, W., Zhang, J., Sun, X., Tan, X., Zhou, Z. 2014.
Dysregulation of Hepatic Zinc Transporters in a Mouse Model of Alcoholic
Liver Disease. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver
Physiology, 307(3), G313-G322.
Sun, Q., Zhong, W., Zhang, W., Li, Q., Sun, X., Tan, X., Zhou, Z. 2015. Zinc
Deficiency Mediates Alcohol-İnduced Apoptotic Cell Death in the Liver of
Rats Through Activating ER and Mitochondrial cell Death Pathways.
American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology,
308(9), 757-766.
Tapiero H, Tew KD 2003. Trace Elements in Human Physiology and Pathology:
Zinc and Metallothioneins. Biomed Pharmacother 5:399–411
Tapiero, H., Tew, K.D., 2003. Trace Elements in Human Physiology and Pathology:
Zinc and Metallothioneins. Biomed Pharmacother, 57, 399–411.
Taylor, K. M., Morgan, H. E., Johnson, A., Nicholson, R. I. 2004. Structure-Function
Analysis of HKE4, a Member of the New LIV-1 Subfamily of Zinc
Transporters. Biochemical Journal, 377(1), 131-139.
Taylor, K. M., Vichova, P., Jordan, N., Hiscox, S., Hendley, R., Nicholson, R. I.
2008. ZIP7-Mediated İntracellular Zinc Transport Contributes to Aberrant
Growth Factor Signaling in Antihormone-Resistant Breast Cancer Cells.
Endocrinology, 149(10), 4912-4920.
Taysi S, Akcay F, Uslu C, Dogru Y, Gulcin I 2003. Trace Elements and Some
Extracellular Antioxidant Proteins Levels in Serum of Patients with
Laryngeal Cancer. Biol Trace Elem Res 91(1):11–18
Tonelli, M., Wiebe, N., Hemmelgarn, B., Klarenbach, S., Field, C., Manns, B., Gill,
J. 2009. Trace Elements in Hemodialysis Patients: A Systematic Review
and Meta-Analysis. BMC Medicine, 7(1), 25.
Toxicological Profile for Zinc. 2005. Agency for Toxic Substances and Disease
Registry Division of Toxicology and Environmental Medicine: Atlanta, GA,
USA,
Trumbo, P., Yates, A. A., Schlicker, S., Poos, M. 2001. Dietary Reference İntakes:
Vitamin A, Vitamin K, Arsenic, Boron, Chromium, Copper, İodine, İron,
Manganese, Molybdenum, Nickel, Silicon, Vanadium, and Zinc. Journal of
the American Dietetic Association, 101(3), 294-301.
Truong-Tran, A. Q., Carter, J., Ruffin, R. E., Zalewski, P. D. 2001. The Role of Zinc
in Caspase Activation and Apoptotic Cell Death. In Zinc Biochemistry,
Physiology, and Homeostasis (pp. 129-144). Springer, Dordrecht.
Tu, Y.P., Xu, H., 1994. Zn2+ İnhibits The Anion Transport Activity of Band 3 by
Binding To İts Cytoplasmic Tail. Bioscience Reports, 14(4), 159-169.
68
Turnlund, J. R., King, J. C., Keyes, W. R., Gong, B., Michel, M. C. 1984. A Stable
İsotope Study of Zinc Absorption in Young Men: Effects of Phytate and a-
Cellulose. The American journal of Clinical Nutrition, 40(5), 1071-1077.
Vallee, B. L., Falchuk, K. H. 1993. The Biochemical Basis of Zinc Physiology.
Physiological Reviews, 73(1), 79-118.
Van der Zee, J., Van Steveninck, J., Koster, J. F., Dubbelman, T. M. A. R. 1989.
Inhibition of Enzymes and Oxidative Damage of Red Blood Cells İnduced
by t-Butylhydroperoxide-Derived Radicals. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Biomembranes, 980(2), 175-180.
Van Schoor, J. 2008. Minerals and Trace Elements in Nutritional Supplements. SA
Pharmacist's Assistant, 8(1), 26-27.
Vardatsikos, G., Pandey, N. R., Srivastava, A. K. 2013. Insulino-Mimetic and Anti-
Diabetic Effects of Zinc. Journal of İnorganic Biochemistry, 120, 8-17.
Vergnano, A. M., Rebola, N., Savtchenko, L. P., Pinheiro, P. S., Casado, M., Kieffer,
B. L., Paoletti, P. 2014. Zinc Dynamics and Action at Excitatory Synapses.
Neuron, 82(5), 1101-1114.
Vogelmeier, C., König, G., Bencze, K., Fruhmann, G. 1987. Pulmonary İnvolvement
in Zinc Fume Fever. Chest, 92(5), 946-948.
Walsh, C. T., Sandstead, H. H., Prasad, A. S., Newberne, P. M., Fraker, P. J. 1994.
Zinc: Health Effects and Research Priorities for the 1990s. Environmental
health perspectives, 102 (Suppl 2), 5.
Wang, W. M., Liu, Z., Liu, A. J., Wang, Y. X., Wang, H. G., An, D., Liu, Y. Q.
2015. The Zinc İon Chelating Agent TPEN Attenuates Neuronal
Death/Apoptosis Caused By Hypoxia/İschemia Via Mediating The
Pathophysiological Cascade İncluding Excitotoxicity, Oxidative Stress, and
İnflammation. CNS neuroscience Therapeutics, 21(9), 708-717.
Wastney, M. E., Aamodt, R. L., Rumble, W. F., Henkin, R. I. 1986. Kinetic Analysis
of Zinc Metabolism And İts Regulation in Normal Humans. American
Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology,
251(2), 398-408.
Wätjen, W., Haase, H., Biagioli, M., Beyersmann, D. 2002. Induction of Apoptosis
in Mammalian Cells by Cadmium and Zinc. Environmental Health
Perspectives, 110(Suppl 5), 865-867.
Weglicki, W. B., Chmielinska, J. J., Kramer, J. H., Mak, I. T. 2011. Cardiovascular
and İntestinal Responses to Oxidative and Nitrosative Stress During
Prolonged Magnesium Deficiency. The American Journal of The Medical
Sciences, 342(2), 125-128.
Wessells, K. R., King, J. C., Brown, K. H. 2014. Development of a Plasma Zinc
Concentration Cutoff To İdentify İndividuals with Severe Zinc Deficiency
Based On Results From Adults Undergoing Experimental Severe Dietary
Zinc Restriction and İndividuals with Acrodermatitis Enteropathica. The
Journal of nutrition, 144(8), 1204-1210.
69
Williams, R. J. P. 1987. The Biochemistry of Zinc. Polyhedron, 6(1), 61-69.
Wiseman, D. A., Wells, S. M., Wilham, J., Hubbard, M., Welker, J. E., Black, S. M.
2006. Endothelial Response to Stress From Exogenous Zn2+ Resembles
that of NO-Mediated Nitrosative Stress, and İs Protected by MT-1
Overexpression. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 291(3),
C555-C568.
Yakoob, M. Y., Theodoratou, E., Jabeen, A., Imdad, A., Eisele, T. P., Ferguson, J.,
Bhutta, Z. A. 2011. Preventive Zinc Supplementation in Developing
Countries: İmpact on Mortality And Morbidity Due To Diarrhea,
Pneumonia And Malaria. BMC Public health, 11(3), S23.
Yavuz İ. 2013. Kurşuna Maruz Kalan Bireylerde Lenfosit DNA Hasarının
Belirlenmesi. Ankara Üniversitesi, Doktora Tezi, Ankara.
Yeşilkaya, A., Yeğin, A. 1998. Inhibition of Human Erythrocyte (Na+-K+) ATPase
by Organic Hydroperoxides and Protection by Ascorbic Acid and Butylated
Hydroxytoluene. General Pharmacology: The Vascular System, 30(4), 495-
498.
Zalewski, P. D., Forbes, I. J., Betts, W. H. 1993. Correlation of Apoptosis with
Change in İntracellular Labile Zn (II) Using Zinquin [(2-methyl-8-p-
Toluenesulphonamido-6-quinolyloxy) Acetic Acid], A New Specific
Fluorescent Probe for Zn (II). Biochemical Journal, 296(2), 403-408.
Zalewski, P. D., Forbes, I. J., Giannakis, C. 1991. Physiological Role for Zinc in
Prevention of Apoptosis (gene-directed death). Biochemistry İnternational,
24(6), 1093-1101.
Zeisel, S. H. 2011. Nutritional Genomics: Defining the Dietary Requirement and
Effects of Choline–. The Journal of Nutrition, 141(3), 531-534.
70
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Tuğba DEMİRAL
Doğum Yeri ve Yılı : Adana, 1986
Medeni Hali : Evli
Yabancı Dili : İngilizce
E-posta : tugba_sdu01@hotmail.com
Eğitim Durumu
Lise : Mehmet Kemal Tuncel Lisesi 2004
Lisans : SDÜ, Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü
Taranmış Fotoğraf
(3.5cm x 3cm)
Recommended