Nukleov é kyseliny

Význam genetické informace, její replikace

a exprese pro živý organismus

DNA – struktura, vlastnosti a funkce v organismu

RNA – dtto

Virus ( = parazitující soubor genů)

Možné využití syntetických oligonukleotidů

Technické použití nukleových kyselin: aptamerové senzory, DNA nanomateriály

Nukleové kyseliny

Znaky živého organismu

získávání energie z živin pro své životní potřeby

   možnost růstu, diferenciace a reprodukce

aktivní udržování vnitřní uspořádanosti

   aktivní reakce na změny vnějších podmínek

Všechny tyto životní projevy se realizují primárně na úrovni buněk

Jednotná molekulární strategie buněk

Polysacharidy a lipidy … stavební a zásobní

Bílkoviny (proteiny) … univerzální, mohou mít funkci: stavební, zásobní, biochemickou (enzymy), transportní, pohybovou,

kontrolní, signální,..

Specifický vztah mezi strukturou a funkcí:

posloupnost aminokyselin struktura funkce

Kritická podmínka pro zachování životních pochodů buňky: mít možnost podle potřeby vytvořit protein pro zabezpečení dané funkce

To zajišťují Nukleové kyseliny: v DNA je informace uložená, RNA je prostředníkem její realizace (exprese)

Centrální dogma molekulární biologie

Přenos genetické informace v živých organismech vždyDNA RNA protein

Chemické složení DNA

Asymetrický řetězec s jasně rozlišeným 5’ a 3’ koncem.

DNA je polymerní řetězec, vzniklý

polymerací nukleotidů.

Nukleotid = báze + deoxyribóza + + fosfátová skupina

Uspořádání DNA

DNA je v buňkách ve formě dimeru tvořeného antiparalelně uspořádanými řetězci s komplementárním bázovým složením.

Rozsah buněčné genetické informace

Kompletní genetická informace organismu = genom.

Prokaryota: Genom obsahuje typicky jednotky tisíc genů. Existují však i primitivní bakterie s méně než 100 geny.

________________________________________________Eukaryota: Desetitisíce až statisíce genů v genomu. Primitivní eukaryota nemají o mnoho více genů než nejlépe geneticky vybavená prokaryota (kvasinka Saccharomycescerevisiae má 6 tisíc genů).

Příklad genu

Uložení DNA v buňce

Genom prokaryot je uložen v jediné molekule DNA, která je cyklická.__________________________________________________V případě eukaryot je genom představován sadou molekul DNA, které jsou základem jednotlivých chromosomů. Například somatické (nepohlavní) lidské buňky obsahují dvě sady po 23 chromosomech. V každém chromosomu je DNA o délce kolem 10 cm.

Délka a počet DNA molekul v jádře vylučuje jejich volné uložení. Proto dochází k několikastupňové organizaci. Ta je maximální při přípravě pro buněčné dělení, kdy jsou zformovány chromosomy. Při ostatních životních fázích buňky dochází k částečnému rozvolnění:struktura DNA + podpůrné proteiny = chromatin

Vyšší stupně uspořádání Nukleosomy jsou vázány na další vláknový histon a tvoří „30 nm vlákno“. To je dále zprohýbáno a organizováno.

Díky uspořádání je délka chromosomu 10.000x menší než délka rozvinuté DNA.

Při ostatních životních fázích buňky dochází k rozvolnění. Málo rozvolněný chromatin (heterochromatin) je nedostupný pro expresi genetické informace.

I v nejvíce rozvolněném chromatinu zůstává struktura nukleosomů. Základní pochody na DNA, tj. replikace, transkripce nebo opravy mohou probíhat přes nukleosomy.

Uspořádání v jádře

V jádře se chromosomy (= molekula DNA + histony) uspořádávají do více a méně rozvinutých oblastí.

Předávání a rekombinace genetické informace

Genetická informace při diferenciaci buněk nemizí

Replikace DNA

Přesnost replikace:

prostá syntéza DNA vlákna: pravděpodobnost chyby 1:100000

bezprostřední kontrola a oprava: pravd. chyby 1:100

další kontrola a oprava na novém vláknu: pravd. chyby 1:100

Celková pravděpodobnost chyby při replikaci: 1 : 1 miliarda

Důležitost předávání genetické informace

Je to především pojistka proti současnému poškození životně důležitých genů u celého společenství jednotlivců

U bakterií je možné předání malého množství DNA přímo mezi jedinci, nebo i z okolí buňky.

Dobře se uplatňují plasmidy, malé kruhové DNA

U eukaryot se děje předávání genetické informace při pohlavním rozmnožování

Somatické buňky jsou diploidní – mají vždy 2 páry chromosomů, jeden od otce a jeden od matky, které se spojily při oplození, kdy se do jednoho jádra dostaly chromosomy z samční i samičí podhlavní buňky.

Přenos genetické informace podle principu KOMPLEMENTARITY

pouze bázové páry A:T, G:C

Zápis genetické informace

U všech organismů se zápis genetické informace realizuje

v molekule DNA = deoxyribonukleová kyselina

a to pořadím čtyř bází:

Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin

Co je příčinou principu komplementarity ?

Pouze při zachování principu komplementarity lze při libovolném řazení čtyř bází na jednom řetězci vytvořit pravidelnou strukturu dvojšroubovice

Stabilita dvojšroubovice DNA

Relativně velká citlivost na vnější podmínky: teplota, tlak, pH, koncentrace kationtů, koncentrace jednotlivých vícemocných iontů

Zvláštní struktury DNA podmíněné speciálním bázovým složením:- alternující G a C ………………………….levotočivá šroubovice- pouze A a G v jednom vlákně … ……….trojšroubovice- pouze G …………………………. ……….kvadruplex- úsek pouze s A a T s alternacemi ………ohyb

Závislost stability na stavbě DNA - délce řetězce - bázovém složení: stabilita roste s podílem G:C párů

RNA - chemické složení

Chemické složení RNA se od DNA liší pouze ve dvou detailech

Místo báze Thymin je Uracil (Uracil nemá methylovou skupinu)

Místo deoxyribózy je ribóza (má OH skupinu v pozici 2’)

DNA RNA

Role RNA

RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolíchmRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselinrRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů)tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách

Centrální dogma molekulární biologie:Přenos genetické informace v živých organismech vždy

DNA RNA protein

Eukaryota Prokaryota

Postup exprese genetické informace

RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolíchmRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselinrRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů)tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách

Strukturní rysy RNA RNA se zásadně vyskytuje jako jednovláknová, může ale vytvářet lokální interní dvojšroubovice a stabilizovat se ve složité prostorové struktuře. Základními strukturními motivy jsou vlásenka (hairpin, hairpin loop) - obsahuje vlastní smyčku a stonek (stem), výduť (bulge), vnitřní smyčka, křížení (junction)

Struktura 5´konce viru HIV-1 • TAR – vlásenka, na kterou se vážou proteiny virový Tat a

buněčný CyclinT1• DIS (SL1) – vlásenka, která je zodpovědná za držení obou

homologních vláken viru při sobě

Viry• Samostatně existující skupiny genů. Mohou se replikovat pouze pokud infikují vhodnou hostitelskou buňku. Nebuněčné částice, nepovažují se za živý organismus.

• Mimo hostitelskou buňku nevykazují životní projevy: nemají látkový ani energetický metabolismus, nerostou, nejsou dráždivé, nemají aktivní pohyb, nerozmnožují se. Žádný z virů neobsahuje geny klíčové pro jeho replikaci, především pro stavbu ribosomu nebo syntézu ATP.  • V procesu své reprodukce představují vnitrobuněčné parazity, kteří jsou zpravidla patogenní pro hostitelskou buňku.

• Obsahují 3 až stovky genů a jejich velikosti se pohybují od 15 do cca 400 nm.

Životní cyklus DNA viru

Lytický cyklus – s využitím buněčného aparátu (permisivita buňky) se replikuje nukleová kyselina i virové proteiny. Kapsidové proteiny se v procesu tzv. maturace samovolně skládají a vytvářejí kapsid, sestavují se nové viriony. Konkrétní mechanismus závisí především na tom, jak je realizován zápis virových genů:

DNA viry - přímá transkripce a translace virové DNA

Životní cyklus retroviru RNA je virovou reverzní transkriptázou přepsána do DNA a ta je virovou integrázou včleněna do buněčné DNA v jádře

Použití oligonukleotidu k „uspání“ genu

oligonukleotid = krátký úsek nukleové kyseliny

Motivace:

1. Chemoterapie:

Selektivní likvidace nežádoucích organismů

Potlačení reprodukce virů, především retrovirů

Potlačení růstu vlastních buněk s patogenním chováním

2. Molekulární biologie:

Efektivní zkoumání funkcí řízených jednotlivými geny

Možné mechanismy

• Antigenní – oligonukleotid se váže na dvojšroubovici DNA a vytváří triplex; blokuje transkripci (vznik mRNA)

• Antisensní – oligonukleotid se váže na mRNA a vytváří duplex; blokuje translaci (syntézu proteinů) nebo dokonce vede ke štěpení mRNA pomocí RNasy H

• Aptamerní – oligonukleotid zabraňuje funkci proteinu zajišťujícímu nezbytný krok v realizaci genetické informace (reverzní transkriptáza, integráza, apod.)

• siRNA – krátká dvojšroubovice RNA obsahující nežádoucí sekvenci

• Ribozymy – speciální RNA sekvence katalyzující štěpení mRNA

Chemicky modifikovaná analoga nukleových kyselin

Krátké úseky přírozených nukleových kyselin nejsou v buněčném prostředí stabilní – působení štěpících enzymů (nukleázy)

První generace antisense léků: Založené na fosforothioátechAktivují RNázu HDesítky přípravků ve stadiu klinickýchtestů, jeden lék povolen pro lékařské použití Problémem je nespecifická vazba na nukleové kyseliny a proteiny

Druhá a třetí generace antisense léků: Založené na ochranných O-methyl nebo O-methoxy-ethyl skupinách, někdy v kombinaci s fosforothioáty (2.generace) nebo jiné typy modifikací (3.generace)Neaktivují RNázu H, řeší se to tvorbou „chimerických“ oligonukleotidů Více než desítka ve stadiu klinických testů

Výběr z přehledu testovaných přípravků

To je motivace pro hledání nových, vhodnějších modifikací

- dostatečná stabilita vůči enzymům v buňce štěpícím nukleové kyseliny

- specifická afinita k cílovému úseku přirozené nukleové kyseliny

s komplementární bázovou sekvencí

- pro antisense aplikaci schopnost aktivovat enzym RNáza H

-  úspěšné pronikání do buněk a správná distribuce

ve vnitrobuněčném prostředí

- netoxičnost a to ani metabolických produktů

Žádná z dosud používaných modifikací nemá bohužel optimální vlastnosti, aby se mohl plně využít potenciál antisensní strategie

Požadavky na syntetická analoga nukleových kyselin pro terapeutické použití

Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i

modifikovaných nukleových kyselin

Studované problémy

tvorba a rozpad duplexů, triplexů a kvadruplexů

vliv vnějších podmínek : pH, jednotlivé kationty, speciální molekuly

stabilita a dynamika duplexů s neúplnou komplementaritou

struktura, dynamika a interakce s enzymy regulačních úseků DNA

interakce s enzymy (HIV integráza, RNasa H) významné pro terapii

interakce vazebných strukturních motivů s aptamery (TAR smyčka)

pronikání oligonukleotidů do buněk a jejich vnitrobuněčný osud

Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i

modifikovaných nukleových kyselin

Používané metody

UV absorpce

Ramanova spektroskopie

senzory na bázi rezonance povrchových plasmonů

mikrokalorimetrie

strukturní a dynamická NMR měření

cikulární dichroismus (v UV absorpci)

gelová elektroforéza

mikrofluorescenční techniky

počítačové modelování

Testování syntetických oligonukleotidů

0

1

2

3

4

0 10 20 30 40

0

1

2

3

4

0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40

O

PO T

HO

OO

OCH3

d[T15

]d[(X)14

T]

dT15

50 nM buffer

buffer

O

PO T

HO

OO

CH3OCH2CH2O

d[(X)14

T]

O

PO

THO

OOH

(S)-

d[T(TX)7] (S)

O TO

PHO

O

O

d[(X)14

T]

Sen

sor

resp

on

se [

nm

]

O

PO T

HO

OO

CH3O

d[(XTTT)3XXT]

O

PO T

HO

OO

OCH3

d[T(XT)7]

Time [min]

O

P

OTHO

O

O

d[(X)14

T]

Testování vazby na přirozený řetězec – SPR biosenzor

Specificita vazby(výsledky UV absorpce)

stabilita komplexu s přirozeným vláknem, strukturní podobnost (UV absorpce, počítačové simulace, Ramanův rozptyl)

biochemický test: aktivace RNasy H