Praktikum: kvalitativna indirektna ELISA · • metoda razdvajanja bioloških makromolekula...

1

Praktikum: kvalitativna indirektna ELISA detekcija prisustva protutijela (DNA auto-antitijela) za SLE (sistemski eritematozni lupus, autoimuna bolest)

(DNA)

W – ispiranje E – enzim S – kromogeni supstrat

I – plastična površina

Ag - antigen

Ab – protutijelo specifično za antigen

anti-Ab – protutijelo dobiveno u drugoj vrsti specifično za protutijelo Ab

3

https://www.youtube.com/watch?v=lNxZxJtvB94

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay [HD Animation]

4

ELISPOT

5

6

7

8

Western blotting

• identifikacija specifičnih proteina u

složenim smjesama proteina

• SDS-PAGE (natrijev dodecil sulfat – poliakrilamid gel elektroforeza)

• SDS denaturira i oblaže proteine svi postaju negativno nabijeni

• SDS-proteini – imaju ujednačenu gustoću naboja

– tijekom elektroforeze migriraju na osnovi molekulskih masa

_

+

9

10

11

Identifikacija specifičnog protutijela metodom Western blot

(npr. identifikacija protutijela na HIV)

-poznati antigen (HIV) se razdvoji SDS-PAGE elektroforezom i prebaci na nitroceluloznu membranu

-membrana se izlaže test-uzorku (eventualno sadrži protutijela specifična za jedan ili više epitopa antigena (HIV)

-prisustvo protutijela iz test-uzorka se detektira sekundarnim protutijelom obilježenim enzimom (ili radioaktivno)

12

Imunoprecipitacija

• za purifikaciju antigena od interesa

• za otkrivanje prisustva određenog

antigena u nekom tipu stanica ili tkiva

• antigen u niskoj konc. mala količina

precipitata, puno vremena

• primarna ili sekundarna protutijela se

vežu za čvrstu fazu – sintetičke kuglice – centrifugiranje

– kuglice magneta

13

Metaboličko označavanje (Janeway) ili

biosintetsko radioizotopsko označavanje (Kuby)

imunoprecipitacija

• imunoprecipitacija + metaboličko označavanje

• jel određena stanica ili tkivo sintetizira antigen od interesa / koliko (scintilacijski brojači analiziraju nastale imunokomplekse)

stanice rastu u mediju za kulturu stanica koji sadrži

radioaktivno označene aminokiseline (npr. 35S-Met)

14

15

Afinitetna kromatografija (pročišćavanje antigena)

• metoda razdvajanja bioloških makromolekula temeljena na njihovu velikom afinitetu prema određenom prirodnom partneru

• stacionarna faza veže (time i zadržava na kromatografskoj koloni) molekule biološki specifičnog partnera

• sve nevezane molekule isperu se s kromatografske kolone

• pročišćena željena molekularna vrsta se eluira

• za purifikaciju proteina (antigena) od interesa iz neke složene otopine (kao i imunoprecipitacija) – protutijelo vezano za kolonu

16

Afinitetna kromatografija (pročišćavanje protutijela)

• ili obrnuto - za purifikaciju specifičnih protutijela iz antiseruma (antigen je tada vezan za kolonu)