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Principios de Biología Molecular

2º Curso de Postgrado en Salud Reproductiva

Centro Rosarino de Estudios Perinatales

Gustavo Leguizamón

Unidad de Embarazo de Alto Riesgo

Hitos en el camino hacia la secuenciación de ADN

• 1940 reconocimiento de AND como material de herencia

• 1953 estructura de la doble cadena• 1966 decodificación del código genético• 1972 tecnología del ADN recombinante• 1975-1977 tecnología de la secuenciación

de ADN

• 1983 mapeo genético de enfermedad (Huntington)

• 1990 lanzamiento del PGH• 1996 comienza la secuenciación• 2001 borrador

Hitos en el camino hacia la secuenciación de ADN

Watson & Crick

• Watson: zoologo, Crick: físico

• “En 1947 Crick no poseia conocimientos de biología ni de quimica orgánica o cristalografía..” – www.nobel.se

• Aplicando las reglas de Chagraff y las imàgenes de rayos X de Rosalind Franklin construyeron el modelo de la doble hélice

• En 1953 Nature: “It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.”

Watson & Crick with DNA model

Rosalind Franklin with X-ray image of DNA

Porquè era necesario secuenciar el genoma humano?

• Las enfermedades son producto de interacciones del medio-genes

• Los progresos relacionados a enfermedades asociadas a un gen

• Cáncer, cardiopatía, hipertensión: asociadas a componente genéticoMúltiples genes comprometidosDifícil su estudio

Proyecto genoma humano: objetivos

• Identificar los 30.000 a 35.000 genes humanos

• Determinar la secuencia de los 3 millones de pares de bases

• Almacenar la información en bases de datos

• Mejorar las herramientas de análisis• Transferencia de tecnología al sector

privado• Analizar las implicancias éticas, legales y

sociales

Proyecto Genoma Humano

Major events in the history of Molecular Biology 2000-2001

• 2001 International Human Genome Sequencing: primer borrador de la secuencia del genoma humano

Niveles de organización

• Nucleo = biblioteca• Cromosomas = estantes• Genes = libros

Purinas Pirimidinas

DNA Components• Nitrogenous Base:

N is important for hydrogen bonding between bases A – adenine with T – thymine (double H-bond)C – cytosine with G – guanine (triple H-bond)

• Sugar: Ribose (5 carbon)Base covalently bonds with 1’ carbonPhosphate covalently bonds with 5’ carbonNormal ribose (OH on 2’ carbon) – RNAdeoxyribose (H on 2’ carbon) – DNA dideoxyribose (H on 2’ & 3’ carbon) – used in DNA sequencing

• Phosphate:negatively charged

Estructura del ADN

Base (A,T, C or G)

Azùcar

Fosfato

Antiparalela

Double helix of DNA

• The double helix of DNA has these features:Concentration of adenine (A) is equal to thymine

(T) Concentration of cytidine (C) is equal to guanine

(G). Watson-Crick base-pairing A will only base-pair

with T, and C with Gbase-pairs of G and C contain three H-bonds, Base-pairs of A and T contain two H-bonds. G-C base-pairs are more stable than A-T base-

pairsTwo polynucleotide strands wound around each

other.

Double helix of DNA

• The DNA strands are assembled in the 5' to 3' direction by convention, we "read" them the same way.

• The phosphate group bonded to the 5' carbon atom of one deoxyribose is covalently bonded to the 3' carbon of the next.

• The purine or pyrimidine attached to each deoxyriboseprojects in toward the axis of the helix.

• Each base forms hydrogen bonds with the one directly opposite it, forming base pairs (also called nucleotide pairs).

Superestructura

Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.

The Histone Code• State of histone tails govern TF access to

DNA

• State is governed by amino acid sequence and modification (acetylation, phosphorylation, methylation)

Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.

DNA, RNA, and the Flow of Information

TranslationTranscription

Replication

Replicación del DNA

• Semiconservadora• Diferentes

mecanismos para cada cadena

DNA RNA: Transcription• DNA gets transcribed by

a protein known as RNA-polymerase

• This process builds a chain of bases that will become mRNA

• RNA and DNA are similar, except that RNA is single stranded and thus less stable than DNAAlso, in RNA, the base

uracil (U) is used instead of thymine (T), the DNA counterpart

Transcription• Transcription is highly regulated. Most DNA is in a

dense form where it cannot be transcribed. • To begin transcription requires a promoter, a small

specific sequence of DNA to which polymerase can bind (~40 base pairs “upstream” of gene)

• Finding these promoter regions is a partially solved problem that is related to motif finding.

• There can also be repressors and inhibitors acting in various ways to stop transcription. This makes regulation of gene transcription complex to understand.

Definition of a Gene

• Regulatory regions: up to 50 kb upstream of +1 site

• Exons: protein coding and untranslated regions (UTR)

1 to 178 exons per gene (mean 8.8)8 bp to 17 kb per exon (mean 145 bp)

• Introns: splice acceptor and donor sites, junk DNAaverage 1 kb – 50 kb per intron

• Gene size: Largest – 2.4 Mb (Dystrophin). Mean – 27 kb.

Central Dogma Revisited

DNA hnRNA mRNA

protein

Splicing

Spliceosome

Translation

Transcription

Nucleus

Ribosome in Cytoplasm

Traducción

Traducción: codigo genético degenerado

Overview of DNA to RNA to Protein

A gene is expressed in two stepsTranscription: RNA synthesisTranslation: Protein synthesis

Western blot (SDS PAGE)

• Gel de poliacrilamida (poro variable)• Disociación de la proteina en unidades polipeptídicas

por rotura de puentes S-S (agente reductor-mercaptoetanol)

• El detergente SDS de carga negativa se une a la regiones hidrofóbicas de la proteina desplegandola y neutralizando su carga

• La migración es por tamaño ( no por forma ni carga)• Identificación de proteinas

Western blot (SDS PAGE)

Western blot (SDS PAGE)

Tratamiento del trabajo del parto prematuro:conclusiones parciales

• Tocolíticos: efectivos por 48-72 horas• Corticoides: disminuyen la morbi-

mortalidad neonatal• Antibióticos: no son efectivos en el

tratamiento del TPP

?

Gemelos

Contracción Infección

RPM

?

? Parto pretérmino

Parto pretérmino: fundamentos de la tocolisis

Tocolíticos: mecanismo de acción

Ca++Ca++

Calmodulina-Ca

Ca++

Ca++Voltaje dependientes

V.Ind

MLK

AMPcProg

A/M

OcitocinaPGs

Beta miméticos Sulfato de Mg

Bloqueantes cálcicosIndometacina

Stress/Fisiológico Gemelar/PoliAbruptioInfección

Eje Inflamación Hemorragia DistenciónHip Hip decidual

CRH-Cortisol TNFIL-1-6-8

Trombina Stretching

AA PGsCOX

PGDH

InactivosProteasas

Amnion

Mecanismos de parto prematuro

Cox-2Cox-2

Antecedentes (I): inducción de la expresión de COX-2 mediante stretching

celularMecánico

Químico

La síntesis de prostaglandinas en el amnios esta incrementada en mujeres que presentan parto prematuro secundario a sobredistención (gemelos y polihidramnios). Esto se debe a un aumento en la expresión y actividad de la iso-enzima COX-2.

Hipótesis

Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000

• Membranas de pacientes con parto pretérmino secundario a sobredistención controladas con membranas de pacientes sin trabajo de parto

• Determinación de PG E2 en amnion (EIA)• Determinación de la expresión de COX-1 y

COX-2 (Western Blot)• Inhibición selectiva de COX-1 (SC 560) y de

COX-2 (SC 236)

Método

Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000

Producción de PGE2 en amnionGemelos y polihidramnios

Producción de PGE2 en amnionGemelos y polihidramnios

00

20002000

40004000

TwinsTwins Poly-Poly-hydramnioshydramnios

Non-Non-LaborLabor

LaborLabor

PG

E2

(pg/

mg

tissu

e)P

GE

2(p

g/m

g tis

sue)

Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000

*

** P < 0.05

Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000

Expresión de COX-1 y COX-2 en pacientes con parto pretérmino secundario a gemelos

y polihidramnios

Expresión de COX-1 y COX-2 en pacientes con parto pretérmino secundario a gemelos

y polihidramnios

Amnion

PGE2 ASSAY

DMSO DMSO INDOMETHACIN SC236 SC560

H2O AA AA AA AA

Controles

Leguizamón et al 2.000

Efecto de los inhibidores del COX sobre la producción de PGE2 por el amnion

Efecto de los inhibidores del COX sobre la producción de PGE2 por el amnion

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8

IndoIndoSC-236SC-236SC-560SC-560

PG

E2

prod

uctio

n (%

of c

ontro

l)

TwinsTwins Poly-hydramnios

Poly-hydramnios

Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000

El parto prematuro secundario a embarazo múltiple o polihidramnios se asocia a un aumento de la expresión y actividad del COX-2 del amnion

Conclusión

Especulación: Los inhibidores selectivos de la COX-2 podrían ser tocolíticos efectivos y

segurosLeguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000

Polymerase Chain Reaction (PCR)• Polymerase Chain Reaction

(PCR)Used to massively replicate DNA sequences.

• How it works:Separate the two strands with low heatAdd some base pairs, primer sequences, and DNA Polymerase

Creates double stranded DNA from a single strand.Primer sequences create a seed from which double stranded DNA grows.

Repeat. Amount of DNA grows exponentially.1→2→4→8→16→32→64→128

Denaturation

Raise temperature to 94oC to separate the duplex form of DNA into single strands

Design primers

• To perform PCR, a 10-20bp sequence on either side of the sequence to be amplified must be known because DNA pol requires a primer to synthesize a new strand of DNA

Annealing

• Anneal primers at 50-65oC

Annealing• Anneal primers at 50-65oC

Extension• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taqpol to attach at each priming site and extend a new DNA strand

Extensiòn• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taqpol to attach at each priming site and extend a new DNA strand

Repeat

• Repeat the Denature, Anneal, Extension steps at their respective temperatures…

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction

• Problem: Modern instrumentation cannot easily detect single molecules of DNA, making amplification a prerequisite for further analysis

• Solution: PCR doubles the number of DNA fragments at every iteration 1… 2… 4… 8…

DNA Arrays--Technical Foundations

• An array works by exploiting the ability of a given mRNAmolecule to hybridize to the DNA template.

• Using an array containing many DNA samples in an experiment, the expression levels of hundreds or thousands genes within a cell by measuring the amount of mRNA bound to each site on the array.

• With the aid of a computer, the amount of mRNA bound to the spots on the microarray is precisely measured, generating a profile of gene expression in the cell.

Tipos de Microarrarys

GENÓMICOS DE EXPRESIÓN MUTACIONES

MICROARRAYS

Microarray GenMicroarray Genóómicomico•• DetectaDetecta la la presenciapresencia o o ausenciaausencia de un de un gengen y en y en cucuáántas ntas copiascopias

••MicroarrayMicroarray de de ExpresiExpresióónn•• Determina los niveles relativosDetermina los niveles relativos de de expresiexpresióónn ((mRNAmRNA) de ) de loslosgenesgenes

AnAnáálisis por Microarrayslisis por Microarrays

Duggan DJ. et al., Nature Genet. 21: 10-14 (Supplement) (1999).

An experiment on a microarray

In this schematic:

GREEN represents Control DNA

RED represents Sample DNA

YELLOW represents a combination of Control and Sample DNA

BLACK represents areas where neither the Control nor Sample DNA

Each color in an array represents either healthy (control) or diseased (sample) tissue. The location and intensity of a color tell us whether the gene, or mutation, is present in the control and/or sample DNA.

Tipos de Muestra Tipos de Muestra DiagnDiagnóóstico Pre y Poststico Pre y Post--natalnatal

• Sangre• Líquido Amniótico

Células en CultivoCélulas sin cultivar

• Vellosidades Coriónicas• Blastómeros• Cuerpos Polares• Productos de Aborto

Análisis mediante microarray de expresión génica

• Objetivo: identificar patrones de expresión génica durante el trabajo de parto prematuro y de término en el humano y la rata

• Análisis de microarray utilizando ARN miometral de pacientes con:

o Parto prematuro con y sin trabajo de partoo Parto de término con trabajo de parto

DNA Microarray

Tagged probes become hybridized to the DNA chip’s microarray.

Millions of DNA strands build up on each location.

77 genes incrementaronsu actividad (X2) enpacientes con trabajode parto a tèrmino y pretèrmino

PTNL PTL TL

Sin cambiosAumentoDisminución

Agrupación funcional en clusters de genes de miometrio humano

Bethin et al

Agrupación funcional en clusters de genes de miometrio de rata

PTNL PTL TL

Activación de diferentes genes enel humano y en la rata